INSTITUTO TECNOLGICO DE MRIDA

ING. BIOQUMICA CINTICA QUMICA Y BIOLGICA Q.F.B. GERARDO RIVERA MUOZ 3.7 SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS INTEGRANTES: AZUETA MATA CIELO KU PUC LIDIA SNCHEZ CUPUL LENNY
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CONTENIDO

3.7.1 Mtodos de inmovilizacin. 3.7.2 Velocidad de reaccin en sistemas con enzimas inmovilizadas. 3.7.2.1 Efecto de la inmovilizacin sobre la actividad cataltica. 3.7.2.2 Limitaciones difusionales en sistemas con enzimas inmovilizadas. 3.7.2.3 Efecto alostrico y electrosttico en sistemas con enzimas inmovilizadas.
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INTRODUCCIN
La inmovilizacin de las enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la produccin industrial de productos qumicos, farmacuticos y de alimentos; en el tratamiento de residuos; en el diagnstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas aplicaciones.
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3.7 SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS

Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas, clulas u organelos (o combinacin de ellos) confinados o localizados en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y continuo.
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VENTAJAS DEL EMPLEO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o clula inmovilizada. 2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimtica por la capacidad de reutilizacin. 3.- Se aumenta la facilidad de recuperacin y purificacin de los productos. 4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseos ingenieriles 5.- Se aumenta la facilidad de operacin y control del proceso, al trabajar en 19/01/2014 condiciones ms suaves

DESVENTAJAS DEL EMPLEO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica. 2.- Se aumentan los problemas difusionales. 3.- El biocatalizador es mas caro que la enzima nativa.

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3.7.1 MTODOS DE INMOVILIZACIN

En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes categoras:

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Atrapamiento Retencin Fsica

membrana

Inclusin en membranas

Microencapsulacion Reactores de

Mtodos De Inmovilizacin
Unin Qumica

Unin a Soporte Reticulado o Entrecruzamiento

Absorcin Inica Unin covalente

Co-reticulado

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MTODO DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA

Atrapamiento. Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruza-bles o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.
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CONTINUACIN ATRAPAMIENTO

El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles.

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Es de gran sencillez desde el punto de vista experimental Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.

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RETENCIN FSICA MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS

Se divide en dos tipos

Microencapsulacin
Reactores de membranas

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INCLUSIN EN MEMBRANAS
Microencapsulacin En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro.

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Reactores de membranas Los reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor.

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Esta adsorcin se puede realizar de dos formas: 1.Mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la membrana; 2. Por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

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METODO MEMBRANAS

VENTAJAS
Simplicidad. Posibilidad de uso simultneo de varios enzimas. Uso de membranas selectivas: control de sustratos/productos en mezclas.

DESVENTAJAS
Problemas difusionales debidos a la membrana. Posible inactivacin de enzimas, sometidos a fuerzas de cizalla elevadas. Mal funcionamiento a bajas concentraciones de sustrato (adsorcin de ste en la membrana) Estricto control del tiempo de residencia para sustratos de bajo peso molecular.

Proteccin del enzima ante inhibicin, envenenamiento No hay prdidas.

Adecuado para sustratos de alto peso molecular, buen contacto enzima-sustrato: altas conversiones.

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MTODO DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA

Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas.
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La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1. Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales o materiales manufacturados 2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos y en protenas fibrosas

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UNIN A SOPORTE

Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante : Adsorcin Inica Unin covalente

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UNIN A SOPORTE POR ADSORCIN

En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:
El pH medio La fuerza inica El dimetro de poro La presencia de iones
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UNIN A SOPORTE: UNIN COVALENTE

Formacin de enlaces covalentes entre enzima y soporte, mucho ms fuertes que en la adsorcin. La unin covalente debe afectar a grupos funcionales del enzima que no intervengan en el proceso cataltico.
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Mtodos ADSORCIN

Ventajas Los centros activos permanecen inalterados. No se requieren reactivos y las etapas de activacin son sencillas Mtodo sencillo y econmico.

Inconvenientes Posible desorcin de enzimas por cambios en pH, temperatura Mtodos no especficos para cada reaccin/enzima

UNIN COVALENTE

Estabilidad del enzima. No se desliga.

Mtodo caro y complicado. La actividad puede reducirse si los reactivos usados son txicos para el enzima. Los centros activos pueden modificarse/daarse durante el proceso.

Mtodo muy flexible, segn se elija el agente portador y mtodo de enlace.

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UNIN QUMICA : RETICULADO

Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking. El mtodo consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima

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El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

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mtodo ENTRECRUZAMIENTO

ventajas

inconveniente

Enzima muy estable, fuertemente enlazado. Puede usarse en combinacin con la adsorcin para prevenir prdida de catalizador.

Puede daar los centros activos.

Puede haber problemas difusionales que limiten el rendimiento.

Prdida de enzima durante preparacin.

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UNIN QUMICA: CORETICULADO

Consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo 19/01/2014

3.7.2 VELOCIDAD DE REACCIN EN SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS

3.7.2.1 EFECTO DE LA INMOVILIZACION SOBRE LA ACTIVIDAD CATALITICA

3.7.2.1 EFECTO DE LA INMOVILIZACION SOBRE LA ACTIVIDAD CATALITICA

Altera significativamente el comportamiento de las enzimas. Se producen cambios en su estabilidad.

La enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima.
Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del microentorno. 19/01/2014

3.7.2.1 EFECTO DE LA INMOVILIZACIN SOBRE LA ACTIVIDAD CATALTICA.

La actividad enzimtica puede disminuir e incluso perderse. Si se pierde totalmente puede ser debido: 1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido. 2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima.
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3. Cuando se pueda originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva. 4. Las condiciones experimentales causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima.

Si la prdida de actividad no es total los cambios se debern principalmente efectos : difusionales, electrostticos, estricos y/o del
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3.7.2.2 LIMITACIONES DIFUSIONALES EN SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS.

La difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo :externo e interno. a) resistencias difusionales externas: Si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el resto de la disolucin. Los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km).
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3.7.2.2 LIMITACIONES DIFUSIONALES EN SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS

b) resistencias difusionales internas:

Debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.

Diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como: disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la concentracin de sustrato, incrementar la agitacin o el flujo en el reactor, etc.

Se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de km disminuye.

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3.7.2.3 EFECTO ALOSTRICO Y ELECTROSTTICO EN SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS.

Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte Si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. Cuando tienen cargas opuestas, el valor de km aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolucin. Hornby y cols. desarrollaron una expresin matemtica que permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas.
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3.7.2.3 EFECTO ALOSTRICO Y ELECTROSTTICO EN SISTEMAS CON ENZIMAS INMOVILIZADAS.

La expresin de Michaelis-Menten en este caso es:

donde x=espesor de la capa de Nernst; D=coeficiente de difusin; T=temperatura (K); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday; R=constante universal de los gases V=gradiente de potencial en el soporte. 19/01/2014

APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analticas: biosensores 2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y de tratamiento de

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BIOSENSORES

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OBTENCIN DE ANTIINFLAMATORIOS

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TRATAMIENTO DE RESIDUOS

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BIBLIOGRAFA
- Inmovilizacin de enzimas, Prof. J.M.Snchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica. Fac. Farmacia - Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y aplicaciones, DR. MIGUEL ARROYO, Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid 19/01/2014