TCNICAS HISTOLGICAS

Conjunto de procedimientos utilizados para el estudio microscpico (histolgico) de las piezas anatmicas.

No los va a realizar el estudiante, pero debe conocer sus fundamentos, la ejecucin, la interpretacin de los resultados para una mejor comprensin del estudio histolgico.
Todas tienen en comn el que requieren de un corte muy delgado del tejido y montarlo en una lmina de vidrio antes de observarlo al microscopio. Dos tcnicas principales: la de la parafina y la de la congelacin.

TCNICA DE LA PARAFINA:

Obtencin de la muestra;
Fijacin; Deshidratacin;

Aclaracin;
Inclusin; Seccin; y, Montaje y tincin.

Obtencin de la muestra

Tomar pequeo fragmento de pocos milmetros de tejido de cadver (necropsia) o del vivo (biopsia) en un acto quirrgico. Requiere de movimientos delicados y de aparatos afilados.

Fijacin de la muestra

Objetivo: endurecer el tejido obtenido que es muy blando y detener la degeneracin postmortem. Se coagulan las protenas aldehdo frmico al 4%. Los fijadores son antispticos matan cualquier germen presente.

deshidratacin de la muestra

Consiste en reemplazar el agua del tejido con la parafina lquida. Lavado de la muestra con alcoholes de grado ms superior cada vez, hasta llegar al grado absoluto.

aclaracin de la muestra

Es la eliminacin del alcohol y la inclusin de la parafina en su reemplazo. Se emplea el xilol como solvente.

inclusin de la muestra

Es la introduccin de la muestra en parafina lquida se reemplaza al xilol.

seccin de la muestra

Corte muy delicado de la muestra, una vez que se ha enfriado. Se emplea el MICRTOMO que permite obtener una cinta de cortes sucesivos.

Montaje y tincin de la muestra

Montaje de las cintas del espcimen sobre un portaobjetos para someterlo a tincin. Se invierten los pasos de la tcnica, lo cual permite pintar el tejido con colorantes solubles en agua.

TCNICA DE LA CONGELACIN:

Es una tcnica ms usada que la anterior.

Consiste en la solidificacin del fragmento corriente de bixido de carbono hielo seco. Criostato permite la congelacin de la muestra y corte a igual temperatura abrevia el tiempo de preparacin del corte.

Tcnicas de coloracin
Tcnicas que permiten diferenciar los distintos componentes de las clulas y de los tejidos. Igual que las tcnicas histolgicas, debieron atravesar por varias etapas histricas hasta llegar a perfeccionarse.

Se usan dos tipos de colorantes: uno cido cuya afinidad es por los elementos citoplasmticos y uno bsico cuya afinidad es por los elementos nucleares.
Hay varios tipos de tcnicas: hematoxilina-eosina, del cido perydico de Schiff, de tricrmico de Masson, de Van Gieson, de azul alcin, de reticulina, de Azn, de Giemsa, de azul de toluidina (metacromasia), de plata y oro, de alumbre de cromo, de azul de isamina, de Nissl, de azul de metileno, de Sudn negro y osmio, tricrmica de Mallory, y de Feulgen.

Los colorantes de hematoxilina y eosina:

La combinacin ms empleada de colorantes. Un corte teido con este mtodo se denomina un corte de H y E (o simplemente HE). La hematoxilina es un colorante bsico, proporciona color azul purpreo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina (ncleos, ribosomas, y retculo endoplsmico rugoso debido al alto contenido de ADN y ARN). Los tejidos que se tien en color azul con la hematoxilina son basfilos. La eosina es un colorante cido, da color rosa o rojo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina los tejidos que se tien en color rosa o rojo con la eosina se dice que son aidfilos o eosinfilos (mayora de protenas citoplasmticas y citoplasma).

Arriba a la izquierda se observa una clula heptica, coloreada con HE, donde el ncleo muestra un borde color azul, dependiente del DNA y sensible a la hematoxilina. El citoplasma se pinta de rosado, por la protena que se tie con la eosina. Los espacios vacos dependen del depsito de glucgeno. Arriba a la derecha se observa la misma clula tenida con la tcnica de PA-Schiff (que tie algunas macromolculas e hidratos de carbono de color carmes) y hematoxilina. La protena del citoplasma se tie de rojo. La imagen de abajo muestra a varias clulas epiteliales sinuadas sobre tejido conectivo laxo, teidas con la tcnica de PA-Schiff y hematoxilina. Dos de las clulas que se ven son caliciformes y secretan moco (que es una glucoprotena).

LA METACROMASIA:
Cuando se tien ciertos componentes tisulares, como por ejemplo, la matriz cartilaginosa, con el colorante azul de toluidina, se modifica el color azul a prpura o rojo violceo por unin con el tejido; Los colorantes capaces de sufrir esta transformacin se denominan colorantes metacromticos; Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes bsicos, de los cuales los ms importantes son los derivados tiaznicos azul de toluidina y tionina.

Fotomicrografa de un corte de trquea teido con hematoxilinaeosina, que muestra un ejemplo de metacromasis. La ancha zona, intensamente rojo violcea de la mitad inferior de la imagen es cartlago hialino, cuya sustancia basal se tie por metacromasia.

01. ( 02. (

03. (
04. ( 05. (

06. (
07. ( 08. (

09. (
10. ( 11. (

12. (

) Las tcnicas histolgicas permiten el estudio de las piezas anatmicas. ) Fijar una muestra quiere decir aplicar las coloraciones adecuadas de acuerdo a lo que se quiere observar. ) De los colorantes que se emplean en el laboratorio de histopatologa, uno es cido para los elementos nucleares y otro es bsico para los elementos citoplasmticos. ) La tcnica de radioautografa permite que el MO tenga un poder de resolucin de una micra y el ME de 0,1 micras. ) Al igual que la tcnica de Van Gieson, la coloracin tricrmica de Masson se emplea mejor, para ver los tejidos conectivos. ) La principal caracterstica de los colorante metacromticos es que son aquellos que principalmente se emplean para colorear las grasas. ) Aclarar una muestra de tejido es reemplazar el agua del tejido con parafina lquida. ) Entre tantos mtodos de coloracin existentes, en el caso de la coloracin tricrmica de Mallory no se conoce el fundamento qumico de unin entre colorantes y componentes tisulares. ) El tomar una pequea muestra para estudio histolgico se lo puede hacer por necropsia o por biopsia. ) El criostato lo es a la tcnica de congelacin, como el micrtomo lo es a la tcnica de la parafina. ) La reaccin del cido perydico de Schiff tie carbohidratos complejos de un color magenta oscuro. ) Una gran cantidad de tcnicas de coloracin pintan los hemates de naranja o rojo.

Tcnicas de observacin
Una de las ms empleadas actualmente es la RADIOAUTOGRAFA.
Permite identificar:
El sitio exacto de la clula donde se sintetiza un producto; Los componentes qumicos que lo forman; Los desplazamientos de la sustancia dentro de la clula; y, Las localizaciones del organismo despus de salir de la clula.

Se basa en dos principios fundamentales: en una radiacin ionizante y en un precursor biolgico con marca radiactiva.

 Radiacin ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsin fotogrfica que la luz visible. Marca radiactiva es el reemplazo de un tomo de una molcula determinada por su istopo radiactivo correspondiente.

El producto radiactivo inyectado a un animal, finalmente se transformar en una sustancia que ir a formar parte de los tejidos que requieren de l y, con una coloracin especial se observa dichos tejidos.
Se puede obtener un poder de resolucin de una micra con el MO y de 0,1 micras con el ME.

Una importante aplicacin, es el marcado de ncleos celulares y por ende el estudio de la histognesis (desarrollo de clulas embrionarias indiferenciadas a clulas especializadas de un tejido).

LA MICROSCOPA
Tcnica para observar materiales diminutos utilizando un microscopio.
Basados en el microscopio comn se han desarrollado varios tipos de microscopios: Simple, ptico o compuesto, De campo oscuro, De contraste de fases, De interferencia, De luz polarizada, De fluorescencia (o de inmunofluorescencia), De barrido confocal, De luz ultravioleta, Operatorio, Esterescpico, Polarizante, De reflexin, De rayos X, Microscopio electrnico.

MICROSCOPIO SIMPLE:
Lente de aumento muy potente, provisto de un sostn que permite mantenerlo cmodamente de modo que se observe sobre una platina agujereada (de modo que pueda ser iluminada desde debajo por un espejo inclinable) una preparacin colocada en la platina.

El microscopio ptico (MO)

Partes mecnicas:

El pie o estativo, formacin pesada que proporciona estabilidad al aparato, y de la cual sube el brazo, en cuyo extremo superior se encuentran el tubo ptico con el sistema de lentes y el ocular.

El tubo ptico termina en el sistema de revlver de cuatro lentes objetivos.

De la parte inferior del brazo y por debajo del tubo ptico, nace la platina, movible de acuerdo a las necesidades baja o sube cuando se acciona el tornillo macromtrico, o se desplaza a uno u otro lado para precisar el enfoque, cuando se acciona el tornillo micromtrico; en la parte media presenta un orificio para el paso de la luz emitida por una lmpara situada en el pie o estativo.

Por debajo del condensador, hay un filtro llamado diafragma, que al abrirlo y cerrarlo regula el paso de la luz.

Componentes pticos:
Tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular. El condensador concentra el haz de luz que ilumina el objeto estudiado. El objetivo aumenta el objeto y proyecta la imagen sobre el ocular. El ocular aumenta aun ms la imagen y la proyecta sobre la retina del ojo del observador. Por debajo de la platina, se encuentra una lente llamada condensador, destinado a concentrar los rayos luminosos a travs el orificio de la platina. El objetivo est constitudo por un conjunto de lentes situados en el extremo inferior del tubo ptico y accionados por un sistema de revolver, lo cual permite cambiarlos a voluntad. Existen cuatro tipos de lentes, denominados respectivamente 4 X, 10 X, 40 X y de inmersin (de 100 X y que para utilizarlo se requiere de una gota de aceite de cedro, colocada en el portaobjetos sobre el espcimen), de acuerdo al poder de cada uno.

Esquema de un microscopio ptico: (1) ocular, (2) posicin del ojo del observador, (3) portaobjetivos en revlver, (4) objetivo, (5) platina portaobjetos, (6) condensador, (7) regulacin del condensador, (8) colector, (9) lmpara, (10) base, (11) regulacin macromtrica, (12) regulacin micromtrica.

Sobre la platina y por encima de su orificio, se colocan unas l-minas de vidrio llamadas portaobjetos, unas laminillas ms delgadas cubreobjetos - cubren el preparado. El portaobjetos es sujetado por unas pinzas que le aseguran a la misma platina.

El aumento total resultante del microscopio se determina en dimetros con la letra X mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (eventualmente se debe multiplicar por un factor que depende del tubo); as por ejemplo, el empleo del objetivo de 10 X y del lente de 10 X, dar un aumento total de 100 X (10 x 10).

El poder de resolucin: distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen separados.
La calidad de una imagen (claridad y riqueza de detalles) depende del poder de resolucin de un microscopio.

El poder de resolucin depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aberturas numricas del objetivo y del condensador (el ocular slo acta aumentando la imagen del objetivo, no mejora el poder de resolucin). El mximo poder de resolucin que se puede obtener es de 0,2 , pero con los preparados de rutina habituales rara vez se excede de 0,5 .

Existe una relacin inversa entre la longitud de onda de la luz empleada por un microscopio y el poder de resolucin del mismo.

El microscopio de luz ultravioleta

Con el empleo de luz ultravioleta con longitud de onda de alrededor de 250 nm (casi la mitad de la luz visible que se utiliza habitualmente en el microscopio ptico), es posible duplicar el poder de resolucin; El microscopio de luz ultravioleta, cuyo sistema ptico suele estar construdo en cuarzo, permite el paso de la luz ultravioleta, que es invisible; La formacin de la imagen se registra en una pelcula fotogrfica; Principal importancia del microscopio de luz ultravioleta: cidos nucleicos absorben la luz ultravioleta se pueden detectar con facilidad.

Microscopa electrnica
El microscopio electrnico representa un verdadero logro en cuanto a incrementos del aumento y del poder de resolucin; Se reemplaza la luz visible, de longitud de onda de alrededor de 500 nanmetros, por un haz de electrones de longitud de onda del orden de 0,005 nanmetros; Como los electrones no pueden atravesar las lentes de vidrio, es necesario reemplazarlas por bobinas electromagnticas (denominadas lentes electromagnticas), en cuyos campos electromagnticos o electrostticos modifican el trayecto del haz de electrones.
Se han inventado varios tipos de ME vamos a analizar dos: ME de transmisin; y, ME de barrido.

El microscopio electrnico de transmisin (MET):

ME en vez de los rayos luminosos utiliza haces de electrones producidos por un filamento incandescente;
Electrones llevan cargas negativas y pueden por tanto ser refractados o concentrados por lentes electromagnticas; Cortes ultrafinos obtenidos se colorean con una solucin que contenga tomos pesados tetrxido de osmio; Se pueden alcanzar aumentos de orden de 100.000-200.000 se pueden distinguir dos puntos que se encuentren a la distancia de 5-10 millonsimas de milmetros.

Desventajas: Electrones son absorbidos muy fcilmente por la materia; Electrones no pueden recorrer en el aire ninguna distancia til, son detenidos por las molculas del aire es preciso hacer el vaco ms absoluto; Muestras a examinar al microscopio electrnico deben colocarse en soportes especiales; Las muestras biolgicas deben ser extraordinariamente delgadas; Tcnica de la coloracin negativa no es utilizable en muchas muestras.

El microscopio electrnico de barrido (MEB):

Representa uno de los ltimos progresos ya que permite conseguir una imagen de la muestra biolgica en tres dimensiones; Haz de electrones producido es concentrado por un sistema de lentes electromagnticas; Haz muy fino (primario) cepilla, barre superficie del objeto en una fraccin de segundo; Impacto de los electrones del haz primario sobre la superficie en examen induce la emisin de electrones secundarios son recogidos por un sistema de revelado y transformados en seales elctricas; Seales son amplificadas por un aparato apropiado y enviadas a un tubo de rayos catdicos;

Inconveniente: slo se pueden alcanzar los 100.000 aumentos.

IMGENES OBTENIDAS CON ME

(1)

Muestras del inmenso poder de apreciacin que se puede tener con el ME. Izquierda: clula cancergena entre glbulos rojos de la sangre humana; derecha: bacteria de la cavidad oral.

IMGENES OBTENIDAS CON ME

(2)

Izquierda: aspecto microscpico de la estructura trilaminar de la membrana del pulmn humano (250.000X); derecha: virus bacterifagos teidos negativamente con acetato de uracilo.

CUESTIONARIO
01. ( 02. ( 03. ( 04. ( 05. ( 06. ( 07. ( 08. (

(2)

09. ( 10. ( 11. ( 12. (

) El microscopio ptico est formado por piezas mecnicas y por partes pticas. ) En el MO, la platina se encuentra entre el tubo ptico y la fuente de luz. ) El portaobjetos es asegurado en la platina por una pinzas que dependen del estativo. ) La luz polarizada permite obtener informacin de la estructura molecular de las sustancias. ) El microscopio de reflexin puede funcionar con radiaciones de cualquier longitud de onda y por lo tanto, lograr poderes de resolucin bastante grandes. ) En el microscopio electrnico, el campo electrosttico puede alterar las caractersticas del haz de electrones que se produce. ) La distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que ellos se visualicen separados, se llama longitud de onda. ) La diferencia entre un microscopio comn y uno de campo oscuro, es que ste ltimo utiliza un condensador especial que impide que llegue la luz directa al objetivo. ) El microscopio de barrido confocal ya no requiere del uso de la fluorescena. ) El objetivo del MO concentra el haz de luz y permite ver al objeto con el ocular. ) Adems de otros factores, el aumento del lente ocular tambin se toma en cuenta para determinar el poder de resolucin de un microscopio. ) La fluorescencia es el fenmeno que permite absorber energa radiante de determinada longitud de onda y volver a emitir luz con menor longitud de onda que la absorbida.

IMGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO:

01. ( 02. ( ) Los aparatos y sistemas son producto de la formacin de tejidos y rganos. ) La obstetricia y la ginecologa se relacionan con la histolgica ya que la comprensin de los estados patolgicos, de la fisiologa normal y de los tratamientos cientficos que se puedan aplicar a las estructuras anatmicas femeninas se entienden mejor por el estudio microscpico de ellas. ) La esplacnologa es el estudio de los distintos aparatos y sistemas del cuerpo. ) La histologa se relaciona con la histopatologa, toda vez que para poder apreciar los estudios anormales, se hace indispensable el conocimiento de los estudios normales. ) El microscopio ptico est formado por piezas mecnicas y por partes pticas. ) En el MO, la platina se encuentra entre el tubo ptico y la fuente de luz. ) El portaobjetos es asegurado en la platina por una pinzas que dependen del estativo. ) La luz polarizada permite obtener informacin de la estructura molecular de las sustancias. ) El microscopio de reflexin puede funcionar con radiaciones de cualquier longitud de onda y por lo tanto, lograr poderes de resolucin bastante grandes. ) En el microscopio electrnico, el campo electrosttico puede alterar las caractersticas del haz de electrones que se produce.

03. (
04. (

05. (
06. ( 07. ( 08. ( 09. ( 10. (

IMGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO:

11. ( 12. ( ) La distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que ellos se visualicen separados, se llama longitud de onda. ) La diferencia entre un microscopio comn y uno de campo oscuro, es que ste ltimo utiliza un condensador especial que impide que llegue la luz directa al objetivo. ) El microscopio de barrido confocal ya no requiere del uso de la fluorescena. ) El objetivo del MO concentra el haz de luz y permite ver al objeto con el ocular. ) Adems de otros factores, el aumento del lente ocular tambin se toma en cuenta para determinar el poder de resolucin de un microscopio. ) La fluorescencia es el fenmeno que permite absorber energa radiante de determinada longitud de onda y volver a emitir luz con menor longitud de onda que la absorbida. ) Las tcnicas histolgicas permiten el estudio de las piezas anatmicas. ) Fijar una muestra quiere decir aplicar las coloraciones adecuadas de acuerdo a lo que se quiere observar. ) De los colorantes que se emplean en el laboratorio de histopatologa, uno es cido para los elementos nucleares y otro es bsico para los elementos citoplasmticos.

13. ( 14. ( 15. ( 16. (

17. ( 18. ( 19. (

IMGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO:

20. ( 21. ( 22. ( 23. ( ) La tcnica de radioautografa permite que el MO tenga un poder de resolucin de una micra y el ME de 0,1 micras. ) Al igual que la tcnica de Van Gieson, la coloracin tricrmica de Masson se emplea mejor, para ver los tejidos conectivos. ) La principal caracterstica de los colorante metacromticos es que son aquellos que principalmente se emplean para colorear las grasas. ) Aclarar una muestra de tejido es reemplazar el agua del tejido con parafina lquida. ) Entre tantos mtodos de coloracin existentes, en el caso de la coloracin tricrmica de Mallory no se conoce el fundamento qumico de unin entre colorantes y componentes tisulares. ) El tomar una pequea muestra para estudio histolgico se lo puede hacer por necropsia o por biopsia. ) El criostato lo es a la tcnica de congelacin, como el micrtomo lo es a la tcnica de la parafina. ) La reaccin del cido perydico de Schiff tie carbohidratos complejos de un color magenta oscuro. ) Una gran cantidad de tcnicas de coloracin pintan los hemates de naranja o rojo.

24. (

25. (

26. (
27. ( 28. (