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Immunochimica: il rapporto antigene-anticorpo

Limmunologia lo studio della risposta immunitaria, ci del processo tramite il quale un animale si difende

dallinvasione di organismi estranei.


Le risposte immunitarie possono essere distinte in due gruppi: 1) 2) immunitaria umorale (mediata da anticorpi); immunitaria cellulare (mediata da cellule).

Entrambi i tipi di risposta coinvolgono cellule del sistema reticolo-linfocitario.

Le tecniche immunochimiche impiegano gli anticorpi che


partecipano allimmunit umorale.

Antigene qualsiasi sostanza capace, dopo essere penetrata nei tessuti di un vertebrato superiore, di indurre una specifica risposta di difesa immunitaria. Propriet: immunogenicit antigenicit importanti dal punto di vista immunochimico

Immunogenicit: capacit di indurre una risposta immunitaria e/o cellulare


Antigenicit: capacit di reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte immuni (anticorpi e/o recettori di membrana)
Lantigenicit di una molecola non pu essere considerata come una propriet inerente alla molecola stessa, come lo sono le sue caratteristiche chimico-fisiche, bens come una propriet dipendente dalle condizioni sperimentali in cui viene determinata.
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Da che cosa dipende limmunogenicit di una sostanza?


1 - estraneit: il sistema immunitario in grado di discriminare il self dal non self, di conseguenza, le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacit immunogena; 2 - peso molecolare: pi elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sar la possibilit di avere una risposta immunogenica; 3 - complessit chimica e strutturale delle molecole: leterogenicit chimica apporta immunogenicit. Ad esempio omopolimeri anche adeguatamente grandi hanno immunogenicit bassa se confrontata con polimeri, contenenti aminoacidi diversi, dello stesso peso molecolare. Daltra parte, gli antigeni proteici risultano tanto pi immunogenici quanto pi sono complessi i loro livelli di organizzazione molecolare (struttura terziaria e quaternaria); 4 - specie animale: le propriet immunogene di un antigene variano a seconda della specie animale utilizzata per la produzione di anticorpi; 5 degradabilit: macromolecole insolubili sono pi immunogene di quelle pi piccole e solubili, poich vengono pi facilmente fagocitate ed elaborate dal sistema 3 macrofagico.

Tutti gli antigeni si legano agli anticorpi utilizzando piccole zone superficiali e specifiche dette determinati antigenici o epitopi.

Ma tutte le sostanze sono antigeniche? No, infatti esistono piccole sostanze organiche, dette apteni, monovalenti (con un unico determinante antigenico), antigeniche, ma non immunogeniche. possono venire legate artificialmente in modo covalente ad una proteina che prende il nome di carrier e funzionare come epitopi naturali . Teoricamente ogni entit chimica pu di per s contenere un determinante antigenico se legato ad un opportuno carrier immunogeno.

Anticorpo
Gli anticorpi sono proteine che vengono prodotte dai linfociti B. Questi linfociti sono cellule piccole, rotonde, appartenenti alla categoria dei globuli bianchi con il compito di difendere l'organismo da agenti esterni tramite la risposta umorale. Esistono cinque classi di anticorpi che appartengono alla categoria delle molecole proteiche dette

"Immunoglobuline". La loro produzione, da parte delle cellule dallintroduzione

plasmatiche,

provocata

nellorganismo di una sostanza estranea od antigene (Ag) avente determinate caratteristiche fisico-

chimiche,

che,

riconosciuta

poi

per

queste

particolarit dai siti di combinazione dellanticorpo, viene da questo legata, neutralizzata e quindi eliminata.
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Che struttura ha un anticorpo? Essi hanno una struttura fondamentale composta da quattro catene polipeptidiche: due catene leggere identiche (a basso peso molecolare, definito Fc Fragment crystallisable) e due pesanti ad alto peso molecolare (chiamati Fab - Fragment antigen binding). Agli estremi delle catene c' o un gruppo carbossilterminale COO- o il gruppo ammino-terminale NH3+ che ha il compito di legarsi all'antigene specifico.

Fab catena pesante o CH, ovvero di peso


molecolare maggiore, responsabile dellattivit biologica dellanticorpo

Fc catena leggera o CL, ovvero a peso


molecolare minore, corrispondono alle regioni deputate al legame con lantigene (dette paratopi) Queste catene sono legate tra loro da legami disolfuro intercatena.
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Come si producono gli anticorpi?

Immunizzazione mediante iniezione di topi e/o conigli

Saggio ELISA spettrofotometrico (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Immunizzazione di animali, previa coniugazione degli antigeni con molecole ad alto peso molecolare per incrementare la risposta immunogenica Stima delleffettiva presenza e determinazione del titolo e dellaffinit degli anticorpi prodotti mediante saggio ELISA spettrofotometrico Purificazione e caratterizzazione degli anticorpi La specificit del sito di legame con lantigene di ciascuna immunoglobulina dipende dalla variazione di alcuni residui amminoacidi nella porzione N-terminale di ciascuna catena (regione variabile) e spiega lunicit 8 di ciascun anticorpo specifico.

Interazione antigene-anticorpo
Sistema chiave-serratura
Di fronte allagente da riconoscere, che funziona da serratura, il sistema immunitario ricorre ad un metodo apparentemente dispendioso, quello di costruire a caso un elevato numero di chiavi differenti tra le quali ci sar senza dubbio quella giusta per aprire la serratura. Tali chiavi sono gli anticorpi naturali che rappresentano il bagaglio cognitivo del sistema immunitario ed i principali fautori della resistenza naturale di specie o di razza verso particolari agenti estranei.

Lunione che si instaura tra un antigene ed il corrispondente anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito IMMUNOCOMPLESSO. Tale unione altamente specifica ed regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di natura non covalente) che agiscono tra i determinanti dellantigene e dellanticorpo.

La formazione degli immunocomplessi determina una serie di eventi effettori finalizzati alla definitiva distruzione o neutralizzazione dellantigene. 9

Un principio fondamentale su cui si basa linterazione antigene-anticorpo (Ab-Ag) per la formazione del complesso antigene-anticorpo (AgAb). Lequilibrio fra antigene monovalente (aptene) e lanticorpo viene espresso dalla legge di massa: k1

Ab + Ag
k2

Ab-Ag

e, ad equilibrio raggiunto, K= k2/k1 = [AbAg]/[Ab][Ag].

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Quando, per una determinata concentrazione di Ag, [Ag-Ab] = [Ab], cio i siti antigenici dellanticorpo, sono saturati per met con lantigene, allora il valore del reciproco della concentrazione dellantigene libero sar uguale alla costante di affinit:

K = 1/[Ag].

La costante K (costante di associazione) definita dalla concentrazione di epitopo libero necessario perch venga raggiunto il 50% di saturazione dei siti anticorpali ed una misura dellaffinit intrinseca o della stabilit del legame Ag-Ab.

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Il valore della costante di affinit di un anticorpo per un dato antigene determina negli esperimenti immunochimici sia il limite di rilevabilit (che migliora con laumentare dellaffinit), sia la specificit (che cresce allaumentare della differenza tra il valore della costante di affinit di un Ab verso lAg specifico ed quello relativo ad un Ag non).
Le Kaff possono variare da 109 1010 M-1 nel caso di anticorpi con elevata affinit per lantigene, a 104 105 M-1 nel caso invece di immunoglobuline con bassa affinit.

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Affinit: forza dellinterazione antigene-anticorpo (o aptene-anticorpo) misurata dalla costante di equilibrio della reazione di associazione Reazione antigene-anticorpo: reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigene per dare origine al complesso antigene-anticorpo. E caratterizzata da una costante di equilibrio definita. Immunogeno: sostanza antigenica (antigene, coniugato aptene-proteina) che in contatto con un ospite immunocompetente capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici.

Sito legante anticorpale (paratopo) : regione della molecola anticorpale capace di combinarsi con il corrispondente determinante antigenico.
Determinante antigenico (epitopo) : elemento strutturale della molecola antigenica riconosciuto dallanticorpo e capace di combinarsi con il corrispondente sito legante anticorpale. Marcatore: sostanza (radioisotopo, enzima, fuoroforo ecc) che introdotta nella struttura di un reagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la rivelazione
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Tecniche immunoenzimatiche
La specificit delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilit di marcatori (isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi, enzimi) possono essere combinate insieme per compiere un dosaggio immunologico, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica.

La

tecnica pi usata il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante costituito da un isotopo.

Vantaggi: - elevata sensibilit, della facilit con cui si ottengono le marcature isotopiche - invariabilit delle cinetiche di reazione a seguito della marcatura stessa. Svantaggi: - alti costi dei reattivi e delle apparecchiature, - deperibilit, pericolosit e difficolt smaltimento dei composti radioattivi, - necessit di personale specializzato.

di

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Quando il tracciante costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA). In questo caso non viene misurato direttamente il marcatore, ma la sua attivit nei confronti di un suo substrato specifico (ovvero la quantit di prodotto formato). da tener presente che lattivit enzimatica, come pure laffinit fra Ab e Ag, pu variare a seguito della coniugazione fra enzima e anticorpo (o antigene). Vantaggi: - minor costo, - assenza di rischi derivati dallesposizione a radiazioni, - maggior praticit e versatilit.

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Saggio ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Prevede luso di un enzima coniugato ad uno dei biocomponenti utilizzati nel test, susseguentemente laddizione di un substrato e la sua trasformazione in un prodotto colorato, permetter di quantificare il reagente legato indirettamente allenzima tramite lettura con un opportuno spettrofotometro, e quindi, di risalire alla stima dellanalita in esame. Saggio competitivo: saggio immunochimico basato sulla competizione tra analita e tracciante per loccupazione di un numero limitato di siti leganti anticorpali: consiste in pratica nella misura dei siti non occupati dallanalita.
Tracciante: indicatore della reazione analitica nei saggi immunochimici. Sostanza (antigene, anticorpo, aptene) resa direttamente rivelabile mediante lintroduzione di un opportuno marcatore. 16

Procedura test ELISA

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Saggio competitivo diretto


uso del coniugato Antigene-Enzima

Una quantit fissa di antigene marcato e diluizioni decrescenti di antigene libero (come standard o nel campione) vengono messe a reagire insieme nei confronti di un anticorpo in difetto. In questo modo, lantigene marcato e libero si troveranno a competere per un numero limitato di siti anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il substrato per lenzima e si misura lattivit enzimatica spettrofotometricamente, fluorimetricamente o mediante chemioluminescenza. La concentrazione del prodotto enzimatico misurata risulter inversamente proporzionale alla concentrazione dellanalita. 18

Saggio competitivo diretto


uso del coniugato Anticorpo-Enzima

Questo tipo di saggio competitivo coinvolge luso del coniugato anticorpo-enzima, con lantigene immobilizzato sulla fase solida. La reazione di competizione avviene fra lantigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dellanticorpo marcato presente in concentrazione fissa e in difetto. La misura del prodotto della reazione enzimatica sar indirettamente proporzionale alla concentrazione di antigene presente nel campione.
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Saggio competitivo indiretto


uso di un anticorpo secondario

La procedura implica luso di un anticorpo secondario marcato, in grado di riconoscere la regione costante dellanticorpo primario, precedentemente incubato su fase solida. La reazione di competizione avviene fra lantigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dellanticorpo presente in concentrazione fissa. La misura del prodotto enzimatico sar direttamente proporzionale nel caso della misura del titolo dellanticorpo da determinare, mentre inversamente 20 proporzionale per lanalita.

Saggio non competitivo


Saggio ELISA a sandwich
Questa metodica pu essere utilizzata esclusivamente quando lanalita possiede almeno due determinanti antigenici.

Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene immobilizzato sulla fase solida e incubato con diluizioni successive di antigene presente nel campione o in soluzioni standard. Dopo il lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato viene incubato con una concentrazione fissa di anticorpo marcato che andr a legarsi al secondo sito antigenico dellimmunocomplesso. La misura del prodotto della reazione enzimatica risulter direttamente proporzionale alla concentrazione dellantigene da stimare. 21

Fattori che influenzano la scelta del metodo


Le tecniche ELISA non competitive offrono una maggiore sensibilit rispetto alle competitive. La rilevabilit finale di unanalisi competitiva limitata dalla costante di affinit dellanticorpo usato. La sensibilit finale dei saggi non competitivi determinata dal binding non specifico degli immunoreagenti marcati. Nei saggi competitivi diretti, dipende dal grado di purezza e dalla stabilit degli immunoreagenti, Ag o Ab, marcati con lenzima. Quando di lavora con campioni reali (sieri, urine, tessuti, ecc), possono essere presenti proteine in grado di modificare i traccianti enzimatici (proteasi), oppure di inibirne lattivit. Luso dellanticorpo secondario consente unamplificazione della risposta del saggio, poich quando si lavora con il solo anticorpo primario la sensibilit dellanalisi fortemente 22 influenzata dallaffinit del sistema Ag-Ab-E.

Sensibilit
concentrazione dellanalita, sensibilit del sistema di rivelazione, affinit dellanticorpo da usare,

tempo di incubazione
tempo di sviluppo del prodotto enzimatico, precisione del saggio volumi impiegati.
Sensibilit (analitica) : capacit di un metodo di distinguere piccole variazioni di concentrazione di analita. Nella terminologia abituale immunochimica: capacit di un metodo di distinguere da zero piccole concentrazioni di analista, inversamente correlata al limite di rivelazione o di misura, o alla minima concentrazione misurabile (rivelabilit). Specificit (analitica) : capacit di un metodo di determinare esclusivamente lanalita; assenza di reattivit nei confronti di sostanze interferenti

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Scelta dellenzima
Lenzima da utilizzare in un saggio ELISA deve possedere i seguenti requisiti: 1 - deve essere stabile in un intervallo di temperatura compreso fra 25 e 37 C, con un tempo di vita di almeno sei mesi a 4 C 2 - deve essere disponibile commercialmente e ad un prezzo ragionevole 3 - la sua attivit deve essere facilmente misurata con opportuni tests (colorimetrici, fluorimetrici, ecc.) 4 - deve essere facilmente dosabile e possedere un alto numero di turn-over e inoltre il suo prodotto di reazione deve avere un alto coefficiente di estinzione molare

5 - non deve risentire degli effetti negativi della matrice in cui eventualmente svolto il saggio
Gli enzimi normalmente pi usati sono la perossidasi da rafano, la fosfatasi alcalina da intestino di vitello, la -D-galattosidasi da Escherichia coli, lacetilcolinesterasi da Electrophorus electricus. 24

STUDIO DEI PARAMETRI DI UN IMMUNOSAGGIO

Coating: concentrazione dellAg (o Ab) forza ionica tampone pH tempo temperatura Bloccaggio: natura del bloccante tampone tempo e temperatura

Competizione: modalit tempo e temperatura


Substrato delle reazioni enzimatiche e tempo di reazione

Lavaggio: uso di tensioattivi modalit tempo


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ANALISI DEI DATI


100

80

% A/A0

60

40

20

0 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101

[analita]

Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di calibrazione, di taratura) : espressione grafica dellandamento della risposta del saggio al variare della concentrazione dellanalita (standard) utilizzata come scala di calibrazione per interpolare le risposte relative ai campioni incogniti.
Modello logit-it logistico a 4 parametri

Y = (a - d)/[1 + (x/c)b] + d

a = valore asintotico del massimo (dose massima) b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoide c = IC50, ovvero concentrazione dellanalita nel campione in grado di legare il 50% dellanticorpo d = valore asintotico del minimo (dose 0)

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