Nutricin microbiana

Toda la naturaleza es, como se ha dicho, una conjugacin activa y pasiva del verbo comer
-William Ralph Inge

Metabolismo
Conjunto de reacciones catablicas y anablicas

Catabolismo:

Conjunto de procesos que participan en la degradacin de compuestos en productos ms pequeos; las reacciones enzimticas que toman parte de denominan reacciones catablicas.

Anabolismo:

Reacciones mediante las cuales los m.o. construyen o sintetizan sustancias qumicas complejas a partir de molculas simples; las reacciones enzimticas que toman parte se denominan reacciones biosintticas y requieren energa. El ATP formado en las reacciones catablicas es empleado en el anabolismo.

Nutricin
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo, se les llama nutrientes. Dicho de otro modo, para obtener energa y elaborar nuevos componentes celulares, los organismos tienen que disponer de materias primas o nutrientes.

Nutrientes:
Son sustancias que se emplean en la biosntesis y produccin de energa. Son necesarios para el crecimiento microbiano

Requerimentos de nutrientes comunes

Macroelementos. Microelementos (llamados tambin oligoelementos).

Macronutrientes o macroelementos
Son captados por los m.o. en cantidades relativamente grandes.
Ms del 95% del peso seco de la clula microbiana esta constituido por C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg y Fe.

 C, O, H, N, S y P.
Son componentes de carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nuclecos. Son necesarios en cantidades de g/L de medio de cultivo.

Carbono.
Fuente de energa y/o compuestos para biosntesis

Nitrgeno y azufre*.
Se encuentran en las clulas en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo; generalmente en forma reducida, aunque algunos m.o. los asimilan en forma oxidada. Sulfatos, nitratos, peptonas (N y S) y cisteina. Fijacin de N2 (N2 NH3)

 K, Ca, Mg y Fe: se encuentran en la clula en forma de

cationes, desempeando varias funciones. Se utilizan en cantidades de mg.

K+: necesario para actividad de enzimas, entre

ellas algunas que participan en la sntesis de protenas. Ca2+: contribuye a la termorresistencia de endosporas. Mg2+: acta como cofactor de muchas enzimas, forma complejos con el ATP y estabiliza los ribosomas y las membranas celulares. Fe2+ y Fe3+: Forma parte de los citocromos y es cofactor de enzimas y de protenas transportadoras de electrones.

Requerimientos de N, P y S
Se deben incorporar en grandes cantidades. Aunque pueden adquirirse a partir de los mismos nutrientes que aportan C, los m.o. suelen emplear tambin fuentes inorgnicas.

N: necesario para sintetizar a.a., purinas,

pirimidinas, algunos CHTOS y lpidos. P: presente en cidos nucleicos, fosfolpidos, nucletidos como ATP, varios cofactores, algunas protenas y otros componentes celulares. S: necesario para la sntesis de sustancias como los a.a. cistena y metionina, algunos CHTOS, biotina y tiamina.

Micronutrientes o microelementos u oligoelementos

Son aquellos que se requieren en cantidades tan pequeas, que los contaminantes presentes en agua, en los recipientes para el cultivo y en los componentes habituales del medio son a menudo suficientes. Normalmente son parte de enzimas y cofactores; facilitan la catlisis de reacciones y mantenimiento de la estructura de protenas. Mn, Zn, Co, Mo, Ni y Cu deben estar disponibles en cantidades de g.

 Zn2+: se localiza en el centro activo de

algunas enzimas. Mn2+: facilita a muchas enzimas la catlisis de la transferencia de los grupos fosfato. Mo2+: necesario para fijar nitrgeno. Co2+: componente de la vitamina B12. Cu2+: tiene funciones en algunas enzimas de xido-reduccin.

Factores de crecimiento
Son sustancias precursoras de ciertos constituyentes orgnicos de la clula que el m.o. es incapaz de sintetizar; generalmente se requieren en pequeas concentraciones. Existen tres clases principales:
1. Aminocidos sntesis de protenas 2. Purinas y pirimidinas sntesis de cidos nucleicos 3. Vitaminas normalmente forman la totalidad o parte de los cofactores enzimticos; constituyen grupos prostticos o centros activos de ciertas enzimas.

Elemento Hidrgeno Oxgeno Carbono Nitrgeno Azufre

Fsforo Potasio Magnesio

Manganeso Calcio Hierro Cobalto Cobre, zinc, nquel, molibdeno

Funciones fisiolgicas Constituyente de agua celular, materiales celulares orgnicos Constituyente de agua celular, materiales celulares orgnicos; como O2, aceptor de electrones en la respiracin de los aerobios Constituyente de materiales celulares orgnicos Constituyente de protenas, cidos nucleicos, coenzimas Constituyente de protenas (como aminocidos cistena y metionina), de algunas coenzimas (por ejemplo, CoA, cocarboxilasa). Constituyente de cidos nucleicos, fosfolpidos, coenzimas Uno de los principales cationes inorgnicos de las clulas, cofactor de algunas enzimas. Importante catin celular, cofactor inorgnico en muchas reacciones enzimticas, incluyendo aquellas que requieren ATP; funciona uniendo las enzimas a los sustratos; constituyente de las clorofilas. Cofactor inorgnico de varias enzimas, a veces remplazando al Mg. Importante catin celular, cofactor de algunas enzimas (por ejemplo proteasas) Constituyente de citocromos y otras hemo o no hemoprotenas; cofactor de cierto nmero de enzimas. Constituyente de la vitamina B12 y de sus coenzimas derivados. Constituyentes inorgnicos de enzimas especiales.

Requerimentos de C, H y O
Las necesidades de C, H y O suelen cubrirse simultneamente. El carbono es necesario para construir el esqueleto de todas las molculas orgnicas; las molculas que sirven como fuente de C aportan tambin tomos de H y O, excepto el CO2.

Clasificacin por requerimientos nutricionales (Fuente de carbono)

Auttrofos:
Son m.o. que pueden utilizar CO2 como principal y nica fuente de carbono.

Hetertrofos:
Son organismos que utilizan molculas orgnicas preformadas y reducidas como fuentes de carbono. La mayora usan nutrientes orgnicos como fuente tanto de C como de energa. Este grupo incluye a todos los animales, hongos, protozoarios y la mayora de las bacterias.

Requerimientos nutricionales debidas a mutaciones.

Las necesidades nutricionales de los m.o. varan segn las especies; pueden cambiar en una misma especie debido a mutaciones.

Prottrofo:
Es un m.o. que precisa de los mismos nutrientes que la mayora de los miembros de su especie.

Auxtrofo:
Es un m.o. mutado que carece de la capacidad para sintetizar un nutriente esencial y por ello, debe obtenerlo, o a su precursor, del medio.

Requerimientos de energa de los m.o.

Todos los organismos requieren fuentes de energa, H y e- para poder crecer. Existen nicamente dos fuentes de energa disponibles para los organismos:
Energa lumnica captada durante la fotosntesis. Energa derivada de la oxidacin de molculas orgnicas e inorgnicas.

Clasificacin energtica de m.o.

Quimitrofos:
Obtienen la energa a partir de la oxidacin de compuestos qumicos (orgnicos o inorgnicos). Quimioauttrofos. Quimiohetertrofos.

Fottrofos (o fotosintticos):

Emplean la luz como fuente de energa. Fotoauttrofos. Fotohetertrofos.

 Littrofos:
(que comen roca) obtienen su energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos como el azufre elemental (S0), el in amonio (NH4+), el hierro ferroso (Fe2+) o el H2.

Organtrofos:
Obtienen electrones o hidrgeno a partir de compuestos orgnicos.

Fuentes de carbono, energa e hidrgeno/electrones

Fuentes de carbono Auttrofos Hetertrofos Fuentes de energa Fottrofos Quimitrofos Luz. Oxidacin de compuestos orgnicos o inorgnicos. Molculas inorgnicas reducidas. Molculas orgnicas. CO2 como nica o principal fuente de carbono. Molculas orgnicas preformadas, reducidas, a partir de otros organismos.

Fuentes de hidrgeno o electrones Littrofos Organtrofos

Clasificacin Auttrofos Hetertrofos Quimitrofos Quimiolittrofos Quimiorgantrofos Quimioauttrofos Fottrofos Fotoauttrofos Fotohetertrofos Quimiohetertrofos

Fuente de carbono CO2 Compuestos orgnicos --------_______ _______ CO2 _______ CO2 Compuestos orgnicos Compuestos orgnicos

Fuente de energa -------------Compuestos qumicos Compuestos qumicos inorgnicos Compuestos qumicos orgnicos Compuestos qumicos Luz Luz Luz Compuestos qumicos

Composicin tpica de compuestos orgnicos e inorgnicos de m.o.

Compuesto Bacteria (% base seca)
Promedio

Levaduras (% base seca)

Promedio

Hongos (% base seca)

Promedio

Carbono Nitrgeno Protenas Carbohidratos Lpidos Acidos nucleicos Cenizas

48 12.5 55 9 7 23 6

46-52 10-14 50-60 6-15 5-10 15-25 4-10

48 7.5 40 38 8 8 6

46-52 6-8.5 35-45 30-45 5-10 5-10 4-10

48 6 32 49 8 5 6

45-55 4-7 25-40 40-55 5-10 2-8 4-10

Composicin tpica de compuestos orgnicos e inorgnicos de m.o.

Constituyentes inorgnicos
Elemento Fsforo Azufre Potasio Magnesio Sodio Calcio Fierro Cobre Manganeso Molibdeno Total Cenizas Bacteria 2-3 0.2-1.0 1-4.5 0.1-0.5 0.5-1 0.01-1.1 0.02-0.2 0.01-0.02 0.001-0.01 -------7-12 g/100 g en peso seco Hongos Levaduras 0.4-4.5 0.8-2.6 0.1-0.5 0.01-0.24 0.2-2.5 1-4 0.1-0.3 0.1-0.5 0.02-0.5 0.01-0.1 0.1-1.4 0.1-0.3 0.1-0.2 0.01-0.5 --------0.002-0.01 --------0.0005-0.007 --------0.0001-0.0002 2-8 5-10

Sustratos
S1 S2 Sn

Clulas
X

Productos
P1
P2

Pn

 Producto:
Compuesto qumico diferente de material celular que es liberado al medio.

Sustrato:
Compuestos que son consumidos a partir del medio como resultado de crecimiento celular o formacin de producto.

Factores que limitan la formulacin de medios de cultivo:

Algunos elementos del sustrato liberados como productos no asimilados a material celular. Velocidades limitantes y estequiometra, deben considerarse los rendimientos. Nutrientes especficos que pudieran ser limitantes, o productos especficos que pueden ser inhibitorios.

Factores que limitan la formulacin de medios de cultivo:

Factores ambientales. Factores de crecimiento.

Crecimiento microbiano: Descripcin qumica

ACaHbOc + BO2 + DNH3

MCaHbOc Nd+ PCO2 + QH2O C

donde: A, B, D, P y Q son moles. CaHbOc fuente carbono-energa. M son moles de una unidad celular, CaHbOc Nd

Datos de composicin celular

Bacterias C0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07 Levaduras C0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065

aCHxOy + bO2 + cNH3

CHaOb Nd+ dCO2 + eH2O

C: H: O: N:

a=1+d ax + 3c = a + 2e ay + 2b = b + 2d + e c=d

RQ = moles de CO2 / moles de O2 = d/b

Rendimiento biomasa sustrato (YX/S)

YX/S = X s

Biomasa producida (Xf X0)

Sustrato consumido (S0 Sf)

Medios de Cultivo

 Aunque todos los m.o. necesitan fuentes de energa, C, N, P, S y varios minerales, la composicin precisa de un medio de cultivo adecuado depender de la especie que se quiere cultivar.

Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar m.o. especficos, o para facilitar la identificacin de una especie en particular.
De acuerdo al estado fsico, los medios de cultivo se clasifican en slidos y lquidos.

Medio sinttico o definido

Son medios en que se conocen todos los componentes. Los medios definidos se emplean ampliamente en investigacin ya que con frecuencia se requiere conocer qu est metabolizando el m.o. en estudio.

Medio BG-11 para cianobacterias

Cantidad (g/L) NaNO3 K2HPO4.3H2O MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O cido ctrico Citrato amnico frrico Na2CO3 EDTA (sal de Na2Mg) Solucin de metales traza 1.5 0.04 0.075 0.036 0.006 0.006 0.02 0.001 1 mL/L

Medios complejos
Contienen algunos ingredientes cuya composicin qumica se desconoce. Son medios suficientemente ricos para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos. De gran utilidad cuando se desconoce los requerimientos nutricionales de un m.o. en particular.

Los medios complejos contienen peptonas, extracto de carne y de levadura. Peptonas: hidrolizados de protenas obtenidos de la

digestin parcial de carne, casena, harina de soya y otras protenas. Sirven como fuente de C, N y energa.

Extracto de carne: contiene a.a., pptidos,

nucletidos, cidos orgnicos, vitaminas y minerales.

Extracto de levadura (de cerveza): fuente de

vitaminas del complejo B, y de compuestos de N y C.

Agar MacConkey
Cantidad (g/L) Peptona de gelatina Peptona de casena Peptona de carne Lactosa Sales biliares Cloruro sdico Rojo neutro Cristal violeta Agar 17.0 1.5 1.5 10.0 1.5 5.0 0.03 0.001 13.5

Tipos de medio
Selectivos. Diferenciales

Medios selectivos
Contienen sustancias especficas que favorecen el crecimiento de un tipo particular de m.o.

Las sales biliares o colorantes como la fucsina y el cristal violeta favorecen el crecimiento de Gram(-), inhibiendo el desarrollo de Gram(+).
Agar Salmonella-Shigella (SS), adicionado con sales biliares para inhibir coliformes. Se producen colonias incoloras por la incapacidad de fermentar lactosa. Agar sulfito de bismuto (BS). Para aislar Salmonella typhi; colonias negras con tono metlico.

Agar sal manitol (MS), adicionado con 7.5% de sal. Se usa para aislar estafilococos.

Medios diferenciales
Contienen productos qumicos para dar lugar a una alteracin visible del medio de cultivo

Diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificacin tentativa de m.o. segn las caractersticas biolgicas. Ejemplo: agar sangre.
Agar Eosina azul de metileno (EMB). Contiene lactosa, sales y colorantes (eosina y azul de metileno), para diferenciar entre fermentadores y no fermentadores de lactosa. Ej. E. coli (fermentador) produce colonias oscuras o con brillo metlico. Agar McConkey. Adicionado con sales biliares y cristal violeta. Para seleccin y recuperacin de Enterobacteriaceae y bacterias Gram(-). Bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias rojas. Agar entrico de Hektoen. Adicionado con elevada concentracin de sales biliares como inhibidor. Para aumentar el rendimiento de Salmonella y Shigella.

Formulacin de medios de cultivo

Consiste en la formulacin cuantitativa del medio, tomando en cuenta todos los elementos o nutrientes requeridos. Los macronutrientes son los que controlan la velocidad de crecimiento. Los medios de cultivo deben prepararse con una formulacin balanceada cualitativa y cuantitativa.

DISEO CUALITATIVO DEL MEDIOS DE CULTIVO : DEFINICION QUIMICA

La definicin del medio debe vincularse con los tipos microbianos: Hetertrofos (simples) Autottrofo Glucosa Amoniaco Sulfato de amonio Sales de sulfato Fosfato monobsico de K Sales de fosfato NaCl NaCl CaCl2 Cationes (Cu, Mo)

FORMULACION Y BALANCEO DEL MEDIO

Determinacin de las concentraciones de los sustratos limitantes La relacin C/N como criterio de balanceo

C/N Tipo de Medio ____________________________________________ Protena microbiana 18 Orgaheterotrfico Respiracin 2-80 Litoautotrfico (desasimilativo) ___________________________________________ _

Rendimiento biomasa sustrato (YX/S)

YX/S = X s
Biomasa producida (Xf X0) Sustrato consumido (S0 Sf)

Rendimiento de biomasa producida por fuente de carbono consumida

M.o. aerobio = 0.5 biomasa

M.o. anaerobio = 0.1 biomasa

Rendimiento = Y = 0.5

m.o. aerobio

50% Biomasa + 50% produccin de metabolitos y mantenimiento celular.

Sustrato (S0)
m.o. anaerobio
Rendimiento = Y = 0.1

10% Biomasa + 90% produccin de metabolitos y mantenimiento celular.

Composicin celular
Cantidad de C = 50% Cantidad de N = 8% Cantidad de P = 5% Cantidad de S = 3%
El hidrgeno y el oxgeno constituyen el agua

Ejercicio 1
Disear un medio de cultivo para un m.o. hetertrofo simple anaerobio.
Fuente de C: glucosa Fuente de N: cloruro de amonio, NH4Cl Fuente de S: sulfato de magnesio, MgSO4 Fuente de P: fosfato cido de potasio, KH2PO4 La clula bacteriana tiene 50% C, 8% N, 5% P y 3% S.

Qu cantidad de cada uno de los compuestos se tiene que aadir a 1 L de agua para producir 20 g/L de biomasa?

Solucin
Glucosa
20 g biomasa L 0.5 g C g biomasa 180 g Glucosa 72 g C = 25 g/L

NH4Cl

20 g biomasa L

0.08 g C g biomasa

53.5 g NH4Cl 14 g N

= 6.1 g/L

MgSO4

20 g biomasa L

0.03 g C g biomasa

120.3 g MgSO4 32 g S

= 2.25 g/L

KH2PO4

20 g biomasa L

0.05 g C g biomasa

136 g KH2PO4 30.9 g P

= 4.42 g/L

Rendimiento
Glucosa
20 g biomasa L 0.5 g C g biomasa 180 g Glucosa 72 g C = 25 g/L

25 g Glucosa x

10% biomasa (anaerobio) 100% biomasa x = 250 g Glucosa

Si el m.o. fuera aerobio, entonces se requieren 50 g Glucosa

Ejercicio 2
Formular y disear un medio de cultivo para una bacteria mesoflica, hetertrofa simple y anaerobia estricta, basado en 100 g/L de fuente de carbono. Cuntos g/L de biomasa se producirn en 1 L de medio diseado?
Hetertrofa simple, anaerobia estricta. Fuente de C: glucosa Fuente de N: cloruro de amonio, NH4Cl Fuente de S: sulfato de magnesio, MgSO4 Fuente de P: fosfato de potasio, K2HPO4