Descubridor

El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich

Tsvett, 1872-1919)

Definicin
Cromatografa es un mtodo de separacin en el que se

aprovechan las diferencias en el comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla.

Cromatografa, definicin (cont.)

Una columna u otro soporte mantienen a la fase

estacionaria y la fase mvil acarrea a la muestra. Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase estacionaria estarn ms tiempo dentro de la columna.

Si es en columna :
Conforme los componentes son eluidos de la

columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para anlisis posterior

Mtodos cromatogrficos

De gases En capa fina En lquidos inmovilizados De exclusin molecular Intercambio inico Hidroxiapatita Hidrofbica Afinidad HPLC

Exclusin molecular
Fase estacionaria: Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Las molculas grandes fluyen ms rpido que las

pequeas.

Desarrollo de una cromatografa de exclusin molecular

Determinacin del tamao de la columna Hidratacin y lavado de la resina Empaque de la columna Determinacin del volumen vaco Corrimiento de la muestra

Caractersticas de las resinas de EM clsicas

Nombre BioGel Cdigo Rango de Fraccionamiento (kDa) Flujo mximo (cm/hr) 5 5 4 3 5 5 3 2 P-60 P-100 P-200 P-300 G-50 G-100 G-150 G-200 3-60 5-100 30-200 60-300 2-30 4-150 5-300 5-600

Sephadex

Intercambio inico
Las protenas difieren mucho en su afinidad por

materiales cargados positiva o negativamente. Los soportes pueden ser:

Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado

Poliacrilamida
Celulosa Poliestireno Slice

Grupos intercambiadores
Fosfato (P)
PO3

CH2 COO

Carboximetilo (CM)

CH2 CH3

Dietilaminoetil (DEAE)

(CH2) NH + 2 CH2 CH3

Principios del intercambio inico

La afinidad de una protena es proporcional a la

concentracin de sal requerida para liberarla del material.

Una

columna se carga (de protenas) con un amortiguador de baja fuerza inica y la elusin se inicia por incremento de la concentracin del amortiguador de elusin.

Desarrollo de una cromatografa de intercambio inico

Hidratacin y Lavado de la resina
Activacin (lavado con cido y base fuerte diluidos,

HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usar ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) Volumen de la columna y capacidad de retencin de la resina.

Amortiguadores
Para intercambiadores aninicos se deben usar

amortiguadores catinicos o zwitterionicos No usar amortiguadores aninicos pues se unen a la resina. Usar detergentes catinicos o no inicos.

Hidroxiapatita (HA)
Introducida por Tiselius et al. en 1956
Bernardi realiz un estudio sistemtico

Frmula
Forma cristalizada de fosfato de calcio

(Ca10(PO4)6(OH)2)

Unin selectiva de protenas a la hidroxiapatita

A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces

de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos amino son atrados por los sitios fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para los carboxilos.

Adsorcin de grupos amino

Se debe a interaccin electrosttica no especfica entre

su cargas positivas y las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de fosfato.

Incremento de la unin de aminas por bloqueo de la repulsin.

A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces

de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos fosfatos en solucin pueden cubrir a calcios que repeleran a los grupos aminos.

Disociacin selectiva de la hidroxiapatita

A, es una protena

bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Notar que estos no se afectan.

Usos
Purificacin de: Protenas cidos nuclicos Virus

Bases de la Tcnica
Su selectividad no depende de la masa molecular,

densidad de carga o punto isoelctrico.

Bases de la tcnica
La adsorcin y la elucin de las protenas no son

procesos en reversa de un solo efecto. Los grupos amino y carboxilo actan de manera diferente en la adsorcin de las protenas a la HA. La elucin de protenas cidas y bsicas por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

Ventajas
HA tiene poco poder de adsorcin de molculas de

masa molecular baja como nucletidos, sales y aminocidos. Es relativamente incompresible. Existen variantes cermicas ms fciles de trabajar pues no se compactan.

Cromatografa Hidrofbica
Los grupos adicionados al soporte son el alcohol octlico, grupos bencnicos u otros grupos hidrfobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18).
Los centros hidrfobos de las protenas son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.

Cromatografa de Afinidad
Sistema muy poderoso de purificacin Sistema restringido Se basa en la interaccin especfica de dos compuestos Antgeno - Anticuerpo Enzima - sustrato Receptor - Ligando

Cromatografa lquida de alta resolucin High-performance liquid chromatography

Limitaciones de la cromatografa a bajas presiones

Imposibilidad fsica de aumentar el flujo Resinas compresibles Corridas de muchas horas Grandes volmenes

Descubrimientos que facilitaron la HPLC

Sntesis de resinas incompresibles
Nuevas tcnicas en el empaque de las

columnas Microparticulacin de las resinas Adelantos en la tecnologa espectrofotometrica

Tipos de HPLC
De exclusin molecular

Intercambio inico
Hidrofbica

Afinidad
De fase reversa

Instrumentacin
Sistema de bombeo Resistente a qumicos Poca variabilidad Presiones de 30 as 400 atm Flujo constante (libre de pulsos) Buen mezclado de los solventes Reproducibilidad en la formacin de los gradientes

Tipos de bombas
Jeringa
Pistn recproco Diafragma

Presin constante

Detectores
Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o ms

longitudes de onda al mismo tiempo Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.

Cromatografa de fase reversa

Se basa en las propiedades hidrofbicas de las

protenas.
El proceso de elucin es diferente que en la

cromatografa hidrofbica.
La fase mvil es un solvente orgnico (metanol, 2-

propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).

Fase estacionaria
Slica acoplada con un derivado alquilsilano.

La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4,

C8, C18. La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 A o de las partculas es de 5 a 20 m El tamao

Fase mvil
La acidez de la fase mvil:
Influencia el estado inico de la

protena Controla la ionizacin de la superficie silanol Forma pares inicos con la zona catinica de la protena Favorece la exposicin de zonas hidrofbicas de la protena

HPLC de Fase Reversa

Separacin eficiente an con concentraciones altas de

protenas Bajo ruido de fondo Solventes voltiles Fcil formulacin de la fase mvil Reproducibilidad de gradientes.

HPLC WATERS modelo antiguo

HPLC WATERS

Gas de acarreo

Controladores de flujo
Inyectores Columnas Detectores Sistema de datos

 Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el

uso de un gas de complemento en el detector (make-up). de la columna antes de que pase al detector.

El make-up, es un gas de arrastre adicionado al efluente

El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o

varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxgeno.

Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila

entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares.