BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

PRACTICA N 11

EXTRACCIN DE ADN Y ELECTROFORESIS

EXTRACCIN DE ADN

OBJETIVOS
1. El objetivo fundamental de esta prctica es utilizar unas sencillas tcnicas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.

2. A partir de la longitud enorme de las fibras tambin se confirma que en el ncleo el ADN se encuentra replegado.

EXTRACCIN DE ADN
FUNDAMENTACIN
1. La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula 2. Las clulas se lisan mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN

Representacin esquemtica de cuatro eslabones de una cadena de nucletidos.

Propsito de la Extraccion de ADN

Obtener ADN en forma relativamente purificada que pueda ser usada para posteriores investigaciones, ej. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciamiento, clonacin de AND, filogenia basada en AND, anlisis funcional de genes, la identificacin de huellas gentica y diagnstico de enfermedades infecciosas.

DNA

El ADN est encerrado en una membrana nuclear y una membrana celular hecha de fosfolipidos El ADN adems est enrrollado con protenas (Histonas) Tanto los fosfolipidos como las protenas deben ser removidos para exponer ADN
En los seres humanos hay cinco tipos principales: la histona H1 y las histonas H2A, H2B, H3 y H4

Reconstruccin de una molcula de ADN en 3D tal y cmo concibieron el modelo Watson y Crick hace 60 aos. (c) Science Photo Library / Cordon Press

Composicin de fotografas con timelapse que muestra una clula cancergena dividindose. El ADN aparece en rojo, y la membrana celular en azul.

Cromosoma de Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, obtenido de las glndulas salivares, a 1.000 aumentos. Fotografiado por Earl Nishiguchi, del Kauai Community College de Hawaii.

Secuencia de genes (bases adenina, timina, citosina y guanina). (c) Voisin/Phanie/Cordon Press

solucin de molculas de ADN en acetato de amonio

Clulas de ratn entrando en telofase, captadas con microscopa electrnica.

Cariotipo espectral, una tcnica de laboratorio que permite visualizar los cromosomas pintando cada pareja (23 pares en una clula humana) de un color fluorescente distinto. la imagen fue tomada por el Instituto Nacional de Genoma Humano de Estados Unidos.

Etapas para la extraccin de ADN:

Romper la pared celular y la membrana plasmtica. Mecnicamente y por accin del detergente Romper tambin la membrana nuclear. Por accin del NaCL Proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo. Por desnaturalizacin (accin del calor) Para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

PROCEDIMIENTO Para la extraccin de ADN del manto de choro, con etanol, seguiremos los siguientes pasos: A. Homogenizacin del Tejido 1. Las clulas se homogenizarn en un mortero empleando el medio de homogenizacin. 2. ES OBLIGATORIO el uso de guantes en todo momento para evitar la contaminacin de la muestra con DNA asa proveniente del sudor de las manos que pueda degradar nuestras muestras de ADN. 3. Se lisarn las clulas agregando 10 ml de la solucin de homogenizacin por cada gramo de tejido con que se inici el proceso. Los componentes como el SDS, permitir por una parte la separacin de las protenas asociadas a la cromatina y por otra parte la ruptura de membranas. El NaCl produce el estallido de los ncleos para liberar as las fibras de cromatina. El EDTA es un agente quelante que inactiva a las DNA asas. 4. Incubar la mezcla en un Bao Mara a 60C por 15 minutos exactos. El calor ablandar el tejido permitiendo que los componentes de la solucin homogeneizadora ingrese a la clula. Adems, esta temperatura desnaturaliza muchas enzimas que interfieren con el procedimiento.

5. Filtrar el homogenizado empleando la gasa estril

6. Enfriar rpidamente la preparacin filtrada en una cubeta con hielo, por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.

B. Precipitacin del ADN

1. Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente hasta que comience a aparecer una consistencia blanca que significa que el ADN ha precipitado. 2. Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar enrollando a la vez con una bagueta de vidrio. 3. Reconoce 3 fases en tu solucin: la del alcohol (que flota en agua), la de tu tejido triturado (abajo del todo) y la interfase entre los 2 que contiene ADN precipitado. 4. Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola direccin, se lograr apreciar el ADN en la bagueta, asemejando una madeja de un hilo sumamente fino o como copos de algodn. Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extraccin no es ADN puro ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin "profesional" se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN (protocolos de PURIFICACIN de ADN).

Cuando el detergente entra en contacto con la clula, captura los lpidos y las protenas.

ADN

ELCTROFORESIS

OBJETIVOS
1. Comprobar la movilidad del ADN en un gel de agarosa 2. Analizar la utilidad de esta tcnica en ensayos de biologa molecular aplicada

Qu es Electroforesis?
La Electroforesis es una tcnica de laboratorio para separar mezclas de molculas cargadas.
Mezcla:

material compuesto de dos o ms componentes.

Molculas Cargadas: una molcula (tal como una protena o ADN) que posee exceso o defecto de electrones.

ELECTROFORESIS

ADN y ARN tienen carga negativa; y CORREN al NODO!

Equipo de Electroforesis:

DNA/RNA tienen carga negativa: CORRE HACIA EL ROJO

Separacin de una Mezcla de Molculas cargadas

molculas son separadas en base a su carga elctrica y su tamao.
Positive Molecules

Analiza
Separacin por tamao

Separacin por carga

Identifica

Mixture of Charged Molecules

Purifica
Negative Molecules

Electroforesis en gel Grupo de tcnicas para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico*.
*El punto isoelctrico es un polianflito tiene carga neta cero el pH al que

Como Ocurre la Separacin

Muchas molculas (aminocidos, pptidos, protenas, DNA, y RNA) tienen por su naturaleza cargas negativas y/o positivas en ellas. La suma de estas cargas determina la carga neta. Cuando se introduce molculas cargadas negativamente a un campo elctrico, estas sern atradas al electrodo positivo, mientras que las que tienen carga positiva sern atradas al electrodo negativo.
+ - +
-

O
-

- + -+ -

+
N Aminocido cargado Positivamente

+ +

+ - + +

Pptido cargado positivamente

Protena cargada negativamente

Como ocurre la separacin

- El material poroso del material est hecho de partculas

microscpicas suspendidas en un gel. - Las partculas unidas forman tneles que actan como un tamz para separarar las molculas. - Molculas pequeas se movern ms rpido que las molculas grandes.

Porous Materia l

Proteins Entering Porous Material

Smallest Move Fastest

Ejemplo de experimento con Gel de Agarosa

This is a standard 1% agarose gel. 50 mL 1X TAE + 0.500 grams routine laboratory grade agarose

This, too, is a standard 1% agarose gel. 200 mL 1X TAE + 2.000 grams laboratory grade agarose

- Determinar las longitudes aproximadas de las molculas de DNA de la muestra. - Se compara las bandas del DNA de la muestra con las bandas del patrn de DNA, de longitud conocida, medida en pares de bases (pb o, en ingls, bp), para cada una de las bandas de tu muestra de DNA

PASO DE PRCTICA BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR 1. a) b) c) d) La funcin del dodecilsulfato de sodio (SDS) en la prctica de extraccin de ADN es: desintegrar la muestra degradar la muestra compactar los componentes celulares dispersar los componentes de las membranas y desnaturaliza las protenas.

2. Un nucletido est constituido por: a) Azcar y fsforo b) Azcar base nitrogenada aminocido c) Azcar y base nitrogenada d) Azcar fosfato base nitrogenada

3. Proceso que consiste en la aplicacin de una diferencia de voltaje a una muestra de ADN que se encuen inmersa en un gel de agarosa, y esta a su vez en baada por un buffer determinado . 4. La carga neta del ADN es .