UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

AISLAMIENTO DE BACTERIOFAGOS
Equipo 6 Castaeda Rico Dione Gisela. Camarillo Cruz Erick. Gonzlez Campos Montserrat. Lzaro Limn Edith.

OBJETIVOS:
1.Conocer e identificar un bacterifago, un virus y el efecto de parasitismo intracelular que producen en una clula hospedera. 2.Llevar a cabo el manejo y aislamiento de bacterifagos. 3. Conocer las etapas de replicacin de los bacterifagos.

CONCEPTO DE VIRUS
Agentes infecciosos ms pequeos: 20 a 300 n.m de dimetro. Contienen un tipo de cido nucleico: ADN o ARN; como genoma. cido nucleico recubierto y protegido por cpside (capsmeros) , algunos presentan envoltura de lipoprotenas.

 La unidad infecciosa se denomina virin. Los virus son partculas inertes que adquieren vitalidad y se reproducen cuando entran a una clula de un husped susceptible. El cido nucleico viral contiene la informacin necesaria para producir la progenie viral.

CLASIFICACIN DE LOS VIRUS

Morfologa del virin Tamao, forma, tipo de cido nucleico, presencia o ausencia de peplmeros, y presencia o ausencia de membranas. Propiedades fisicoqumicas del virin Masa molecular, densidad de flotacin, estabilidad de pH y a la temperatura, susceptibilidad a los agentes qumicos y fsicos.

 Propiedades del genoma virus Tipo de cido nucleico, tipo de cadena (sencilla o doble), lineal o circular, sentido (+, - ambos), segmentos (#, tamao), secuencia de nucletidos, contenido G + C.
Propiedades de las protenas virus Tamao, #, actividad funcional neuroaminidasa)

(transcriptasa,

 Organizacin y replicacin del genoma Orden de los genes, estrategias de replicacin (patrones de trascripcin, traduccin) Propiedades antignicas Propiedades biolgicas Huspedes naturales, modo de transmisin , patogenicidad, patologa.

TAXONOMA DE LOS VIRUS

Existe un sistema en el cual se separan en grupos de mayor tamao-llamados familias- con base en la morfologa del virin, estructura del genoma y estrategias de multiplicacin. En cada familia las subdivisiones (denominadas gneros) habitualmente se basan en diferencias fisicoqumicas o serolgicas. Incluso hay rdenes para agrupar familias de virus que comparten caractersticas comunes.

Virus

Acido nucleico

Tamao

Enfermedad

Poxvirus
Herpesvirus

DNA
DNA

250 x 300 nm
150-200 nm

Viruela
Citomegalovirus Virus Epstein-Barr (VEB) Herpes simple tipo 1 Herpes simple tipo 2 Virus herpes humano 8 (VHH8) Varicela-zster Resfriado comn Virus del papiloma humano (VPH) Hepatitis B Eritema infeccioso, anemia crnica

Adenovirus Papovavirus Hepadnavirus Parvovirus

DNA DNA DNA DNA

75 nm 55 nm 42 nm 22nm

Virus

Acido nucleico

Tamao

Enfermedad

Picornavirus

RNA

28 nm

Hepatitis A Poliomielitis Resfriado comn

Gastroenteritis Encefalomielitis, rubola Hepatitis C Resfriado comn Diarrea (rotavirus) Rabia Fiebre hemorrgica (bola) Sarampin Paperas Parainfluenza

Calicivirus Togavirus Flavivirus Coronavirus Reovirus Rabdovirus Filovirus Paramixovirus

RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA

35-40 nm 40-50 nm 40-50 nm 100 nm 60-80 nm 180 x 75 nm 80-4000 nm 150 nm

Ortomixovirus
Retrovirus

RNA
RNA

80-200 nm
100-120 nm

Influenza tipos A y B
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

CPSIDE
La estructura viral se forma con muchas molculas idnticas de una o unas cuantas protenas. Tres tipos con base en el arreglo de las subunidades morfolgicas. 1. simetra cbica (icosaedro) 2. simetra helicoidal 3. estructura compleja

PROTENAS
Las protenas son el nico componente de la cpside, principal componente de las envolturas, estan ntimamente asociadas a los cidos nucleicos (icosadricos). Participan en la adhesin de la partcula viral y determinan las caractersticas antignicas del virus. La respuesta inmune del husped se orienta contra los determinantes antigncios de protenas o glucoprotenas expuestas en la superficie viral.. Otras son enzimas que aunque en pequeas cantidades son indispensables para iniciar el ciclo replicativo.

REPLICACIN DE LOS VIRUS

Los virus solo se multiplican en clulas vivientes, stas deben proporcionar la energa y maquinaria de sntesis, asi como los precursores moleculares para la sntesis de protenas virales y cidos nucleicos. El cido nucleico viral transporta la especificidad gentica para cifrar las macromolculas especficas virales en una forma altamente organizada.

ETAPAS DE LA REPLICACIN VIRAL

Adsorcin: el virus se une a la membrana celular. Penetracin: 2 maneras, por fusin (virus envueltos) o endocitosis (sin envoltura). Latencia o eclipse: decapsidacin del cido nucleico que se incorpora al genoma celular y se apodera de la maquinaria celular. Maduracin y Sntesis: se sintetizan protenas virales y nucleocpsides, se ensamblan y permanecen en la clula algun tiempo. Liberacin: 2 maneras, por lisis celular o destruccin y por exocitosis en sitios codificados provocando una envaginacin, arrastrando componentes de la membrana celular que constituirn la envoltura viral o peplos.

CICLO LISOGENICO

CARACTERSTICAS
Puede inducir mutaciones. En clulas animales pueden originar transformaciones cancerosas. En bacterias pueden introducir genes de la bacteria de procedencia y dar lugar a la transduccin apareciendo nuevos caracteres como la resistencia a los antibiticos.

Ciclo ltico
Adhesin (receptores) Penetracin Replicacin de cido nucleico

Sntesis de protenas
estructurales

Ensamblado
Liberacin

REPLICACIN VIRAL CLASIFICACIN

Clase I genoma con ADN de dos filamentos Clase II genoma con ADN de una cadena Clase III genoma con ARN de dos cadenas Clase IV integra virus de ARN de un filamento Clase V genoma con ARN de un filamento de polaridad negativa Clase VI genoma de ARN de un filamento a hbridos de ARN ADN

MTODOS DE CUANTIFICACIN
1. MTODOS FSICOS Contar directamente del microscopio electrnico (no se distinguen partculas infectantes de las no infectantes) Hemaglutinacin: los eritrocitos humanos y de otras especies pueden ser aglutinados Radioinmunoensayo Anlisis de Inmunoabsorcin ligada a enzimas 2. MTODOS BIOLGICOS Medicin de la cantidad de virus en trminos del # de unidades infecciosas por unidad de volumen, mediante infeccin de un husped o clula blanco

ANLISIS EN PLACA
Se inoculan virus en diluciones adecuadas sobre monocapas de clulas husped, y despus de la adsorcin son recubiertas con agar para prevenir la diseminacin viral a travs del cultivo. Las clulas inicialmente infectadas han producido virus que disemina a los alrededores, produciendo una pequea zona de infeccin o placa.

En condiciones controladas, una sola partcula viral, denominada unidad formadora de placa (UFP) origina infeccin en una sola placa, stas se pueden contar macroscpicamente.

QU ES UN BACTERIFAGO?
Parsitos intracelulares obligados que se replican en el interior de las bacterias, haciendo uso de

algunas

todas

sus

maquinarias biolgicas.

BACTERIOFAGO

MORFOLOGA

HUESPED

LUGAR RECEPTOR DE LA PARED Cadena O del lipopolisacarido Ncleo basal del lipopolisacarido Ncleo basal del lipopolisacarido Ncleo basal del lipopolisacarido Ncleo basal del lipopolisacarido Protena transportadora de maltosa, en la membrana externa

P22. psilon 15 y 24 y g 341 P1

Cabeza icosadrica con cola corta no contrctil Cabeza icosadrica con cola larga no contrctil Cabeza icosadrica con cola larga contrctil Cabeza polidrica con cola larga contrctil. Placa basal con espculas y fibras Cabeza icosadrica con cola corta no contrctil Cabeza icosadrica con cola larga no contrctil

Salmonella E. Coli Salmonella Salmonella E. Coli E. Coli

P2

T4

T3 y T7

E. Coli

Lamda

E. Coli

PLACAS LITICAS o CALVAS

Son reas claras (halos) en un medio previamente sembrado con una muestra diluida del fago y de la clula husped. Representa la lisis que produjo el fago que infecto una bacteria.

Calvas producidas por seis fagos diferentes sobre un husped comn, Escherichia coli cepa B.

La lisis incompleta tiene lugar con frecuencia debido a:

Agotamiento de nutrientes
La presencia de clulas que son resistentes a los bacterifagos por causas genticas o fenotpicas. Acumulacin de metablitos txicos

AGAR BLANDO
Se utiliza con el fin de que las calvas sean mayores al ofrecer menos resistencia al gel que incluye al bacterifago y la bacteria. Tiene una baja concentracin de Agar (0.4%)

Se emplea en forma de capa fina de 1-2 mm de grosor

Previene tambin la diseminacin viral

Tipos de clavas o halos de lisis producidos por T2 en un csped de bacterias de las cepas B y B/2 de E. coli .

 Por consiguiente, la propagacin exitosa de los virus requiere:

1)Una forma estable que permita al virus sobrevivir en ausencia de su huesped. 2)Un mecanismo de invasin. 3)Informacin gentica para la replicacin de los componentes virales dentro de la clula. 4)Informacin adicional para el empaquetamiento de los componentes virales y liberacin de los virus formados.

 Los fagos cumplen un papel de gran importancia en la biologa molecular al ser utilizados como vectores de clonacin para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como resultado bibliotecas genmicas. Los bacterifagos son tiles en el diagnstico de laboratorio para la identificacin de bacterias patgenas (fago-tipificacin). Aunque la fagotipificacin no se usa en el laboratorio clnico de rutina, s se usa en los laboratorios de referencia con propsitos epidemiolgicos.

La terapia fgica ha sido utilizada como una alternativa a los antibiticos para tratar infecciones bacterianas, ya que eliminar bacterias es lo que los fagos hacen mejor.

El desarrollo de cepas bacterianas resistentes a mltiples drogas ha conducido a investigadores en medicina a reconsiderar a los fagos como una alternativa al uso de antibiticos.

MTODO
A) Adicione moscas a un pequea cantidad de caldo de soya tripticaseina y macere con un pistilo hasta hacer una pulpa fina. Transfiera esta mezcla a un frasco esteril y adicione ms caldo soya tripticaseina hasta completar 20 ml ms dos mililitros de caldo de E. coli en cultivo. B) Adicione 45 ml de aguas residuales a 5 ml de caldo nutritivo decaconcentrado en un frasco esteril. Adiciones 5 ml de cultivo en caldo de E. coli. Mezcle suavemente.

Siga el enriquecimiento A o B incube 24 hrs a 35 c

Filtre el sobrenadante a traves de un filtro de membrana. Decante el liquido claro dentro de un tubo con tapon de rosca.

Decante 10 ml del enriquecimiento dentro de un tubo. Centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos para remover bacterias y material solido.

Marque 4 placas y 4 tubos de caldo, del 1 al 4

Asepticamente adicione 1 ml de la suspension enriquecida al tubo 1. Mezcle cuidadosamente aspirando y bajando el volumen tres veces. De este tubo (1) transfiera 1 ml al segundo tubo, mezcle bien y transfiera de este segundo tubo, 1 ml al tubo (3), mezcle bien y transfiera de este tubo 1 ml al tubo (4), de este tubo tranfiera 1 ml a un contenedor con desinfectante.

Adicione 1 ml de cultivo de E. coli a los tubos de agar blando, previamente fundido y mantenindolo a 45 C, continu mantenindolos a 45 C sin permitir que solidifique.

Con la pipeta comience con el tubo de caldo enriquecido (4) y aspticamente transfiera 1 ml del tubo 4 a el agar blando. Mezcle por agitacin y rpidamente invierta este tubo sobre la caja marcada con el numero 4 y mezcle en forma de ochos, usando la misma tcnica continu con los tubos 3, 2 y 1.

Adicione 2 asadas de cultivo de E. coli a cada remanente de los tubos de caldo y mezcle.

Incube las cajas y los tubos del paso 9 a 35 C. Obsrvese a las 24 horas

BIBLIOGRAFA
Brooks G. Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17 ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno. 2002. Murray P. Microbiologa Mdica. 4 ed. Espaa: Editorial Mosby, 2004. Duerden, B. Reid, T. et. al. Microbiologa de enfermedades infecciosas. Ed. Limusa. Mxico, 1993. pp. 25, 36-37, 100-101 Rhodes, A. Tratado de virologa. Ed. Toray. Barcelona, 1973. pp 10-11, 36-37, 562-563