Mtodos colorimtricos

Mtodo do Biureto
Mtodo de Bradford

Mtodo de Lowry
Absorvncia no UV Mtodo do BCA

Quantificao de Protenas
Diagnstico de doenas Nutrio Determinao de grupos funcionais Purificao de novas protenas e enzimas

Origem do mtodo
- Processo moroso -Muitos interferentes - Lei de Lambert-Beer

Mtodo de Lowry :

Proposto por Paul Smith e a sua equipa

Mtodo do cido Bicinconnico (BCA)

Estrutura do BCA

4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina

Reagente BCA
BCA (C20H12N2O4) Bicarbonato de sdio (NaHCO3) Carbonato de sdio (Na2CO3) Tartarato de sdio (Na2C4H4O6 ) Hidrxido de sdio (NaOH)

Reagente A

Reagente BCA Reagente B

4% m/V CuSO4 . 5H2O

O complexo resultante passa a apresentar uma cor roxa intensa, com mxima aos 562nm com absorvncia mxima O complexo resultante passaabsorvncia a apresentar uma cor prpura, aos 562nm.
Adicionar amostra Incubadora 30 min, 37C Ler a 562 nm

Reaces Qumicas

Passo 1

Passo 2

Recta de Calibrao

Sensibilidade

0,5 g.cm-3

Interferentes Substncias que reagem: com os ies cobre com o BCA

Interferentes
Interferentes
Acares EDTA
Lpidos Sulfato de Amnio Mercaptoetanol e dihitureitol Perxido de Hidrognio Vitamina C e paracetamol Cloropromazina Penicilinas

Alterao provocada
Reduo parcial do Cu2+ (falso positivo)

Complexa ies de Cu2+

Reaco com BCA (falso positivo) Falso Positivo Reduo do Cu2+ Falso positivo Reduo do Cu2+ (falso positivo) Turbidez na amostra Falso positivo

Vantagens Reagente muito resistente e de elevada sensibilidade Mtodo flexvel. Realizado numa nica etapa O complexo colorido estvel

Desvantagens Dependncia da temperatura e do tempo de incubao Variao do protocolo de acordo com a protena em estudo A absorvncia varia com o tempo Reagente dispendioso Muitos interferentes com o Cu2+

Permite a determinao da concentrao de solues proteicas muito diludas

Sensvel interferncia de acares Tolerante a substncias interferentes redutores Tolerante a detergentes Tempo de incubao menor

Quadro Comparativo
Ensaio Absoro Mecanismo Limite de Deteco Vantagens Desvantagens - Compatvel com detergentes e 20-2000 agentes g/ml desnaturantes - Baixa variabilidade

BCA

562 nm

- Reduo do cobre (Cu2+ a Cu+) - Reaco do BCA com o Cu+ e formao do complexo

- Baixa ou nenhuma compatibilidade com agentes redutores

Lowry

750 nm

- Reduo do cobre pelas protenas - Reduo FolinCiocalteu pelo complexo de cobreprotena

10-100 g/ml

- Elevada sensibilidade

- Incompatvel com detergentes e agentes redutores - Procedimento longo

Bibliografia
Datas de Consulta : 19 a 24 de Outubro de 2013 SMITH, P. K. et al. - Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid, Analytical

Biochemistry n 150, p. 76-85 (1985).

WALSH, Gary Proteins Biochemistry and Biotechnology John Wiley & Sons Ltd, Inglaterra, 2004 p. 92 - 95; WILSON, Keith, WALKER, John Principles and Tecchniques of Biochemistry and Molecular

Biology, sixth edition Cambridge University Press, Hong Kong, 2005 p. 357-359;
HARRIS, E. L. V., ANGAL S. Protein Purification Methods A Pratical Approach p.13-15 http://www.piercenet.com/instructions/2161296.pdf http://www.piercenet.com/product/bca-protein-assay

www.nanodrop.com