Bioqumica I

Electroforese
2013-2014

ELECTROFORESE
Mtodo de separao de ies e macromolculas.
Princpio
Aplicao de um campo elctrico Movimento dos ies diferente, caractersticas. Separao de acordo com: -Tamanho; -Carga elctrica; -Estrutura. Aplicaes: Separao e/ou identificao de protenas.
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dependendo

das

ELECTROFORESE SDS-PAGE
PAGE: gel de poliacrilamida acrylamide gel electrophoresis).
Gel em que a separao ocorre.

(poly

SDS: dodecilsulfato de sdio (sodium dodecyl sulphate).

Agente tensioactivo inico que desnatura as protenas e confere-lhes carga negativa.

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GEL DE POLIACRILAMIDA
Poliacrilamida
Polmero formado por copolimerizao de acrilamida e bisacrilamida. A reaco de polimerizao catalizada por persulfato de amonio (APS) e tetrametil diaminoetano (TEMED). A percentagem de acrilamida no gel pode afectar a separao: Quanto > for a % de poliacrilamida, tanto > ser a polimerizao e tanto < sero os poros no gel. A reteno das molculas ser maior, ou seja a velocidade de movimento no campo elctrico ser menor.
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SDS
Tensioactivo inico que desnatura a estrutura secundria das protenas. Confere s protenas uma carga negativa proporcional ao peso molecular (MW). Adiciona-se s solues de protenas e dos geis.

DESNATURAO
2-mercaptoetanol. Temperatura (70-80 oC, 7-10 minutos).

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PREPARAO GEL
Geis de separao e empacotamento
Gel de separao: onde ocorre a separao das protenas Parte inferior do suporte. Percentagem maior de poliacrilamida. Gel de empacotamento: permite que todas as protenas cheguem ao gel de separao ao mesmo tempo. Parte superior do suporte. Percentagem menor de poliacrilamida. Onde se coloca o pente para formar os poos.

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PREPARAO AMOSTRAS
Dissoluo amostras em tampo apropriado. Adio de agente(s) desnaturantes. Adio de corante (Comassie Brilliant Blue ou azul de bromofenol). 1 amostra em cada poo. Marcadores de massa molecular: amostra composta de protenas de massa molecular conhecida.

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RESULTADOS
MARCADOR AMOSTRA MOLECULAR

Proporcionalidade inversa entre Rf e MW. Nmero de bandas: nmero de cadeias polipeptdicas com MW diferente.
Rf = 1

Rf = 0.35

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DETERMINAO MW
Correlao entre mobilidade relativa Rf e a massa molecular MW. Grfico de calibrao: log(MW) vs Rf para o marcador molecular. Estimao MW amostra CHK1. da

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