Universidad ALAS PERUANAS Facultad de Ciencias de la Salud LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA BIOLOGIA MOLECULAR

CLONACION E INGENIERIA GENETICA

Lic.TM. Hctor E. Herrera Reynoso Esp: Citogentica y Biologa Molecular

INTRODUCCION
Dado que estas tcnicas se basan en procesos que ocurren naturalmente en organismos vivos, es conveniente explicar la funcin biolgica de estos elementos de la llamada "ingeniera gentica". Las herramientas ms bsicas usadas son las enzimas de restriccin, cuyo conocimiento es absolutamente necesario para comprender la biotecnologa.

Clonacin
Es la manipulacin gentica que permite copiar al ADN in vivo produciendo numerosas molculas idnticas o clones del mismo. Con las tcnicas de biologa molecular actuales es posible aislar un ADN con la secuencia de inters y propagarlo en un organismo adecuado. Esto permite obtener cantidades ilimitadas del gen de inters, lo que facilita enormemente su estudio.

Clonacin
Copia de especmenes idnticos Practicada en plantas (reproduccin vegetativa) Gemelos univitelinos Manipulacin in vitro (ingeniera gentica) Importancia: mantenimiento de animales en extincin, produccin contnua de protenas para la salud, terapia gnica, etc.

Clonacin por manipulacin Gentica

Clonacin molecular: insercin de segmentos de DNA en vectores de otra especie. Ejm. gen de hemoglobina humana en bacteria E. coli., en cerdos. Clonacin somtica: Produccin de organismos genticamente idnticos sin reproduccin sexual. Ejm. Dolly originada de una clula epitelial en cultivo.

Clonacin Molecular
Enzimas de restriccin, ligasas, fosfatasas, polimerasas, etc. Vectores: vehculo del segmento exgeno (inserto), tienen origen de replicacin y gen de resistencia a antibiticos. Ejm. Plsmidos, bacteriofagos. Hospedero: clula que contiene al vector, por ejemplo E. coli modificada.

ENZIMAS DE RESTRICCIN

Enzimas de Restriccin
La ingeniera gentica es una tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a travs de las enzimas de restriccin que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al ADN que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extrao con un ADN receptor. Por ejemplo, la integracin de un ADN vrico en un ADN celular.

Enzimas de Restriccin
Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevar adems el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias) en los que se podr expresar la informacin de dichos genes: si por ejemplo es el gen que regula la fabricacin de insulina, lo que haramos al ponrselo a una bacteria es obligar a sta a que fabrique la insulina.

Enzimas de Restriccin
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que reconocen una secuencia de entre 4 - 8 pb en una molcula de ADN de doble hebra. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restriccin y la enzima rompe un enlace fosfodister en la hebra gua y otro enlace fosfodister en la hebra complementaria. Las nucleasas son enzimas que poseen todos los organismos vivos, cuya funcin es degradar el ADN o ARN mediante la digestin, es decir el corte de su cadena en puntos mas o menos especficos.

Enzimas de Restriccin
Existen muchos tipos de nucleasas que actan de diversas maneras, y cada organismo es capaz de sintetizar las suyas propias. Las bacterias son capaces de sintetizar una amplia gamma de unas nucleasas llamadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.

Se indica el lugar en el que corta la enzima de restriccin. Se aprecia la actuacin en ambas hebras.

El resultado de la actuacin de la enzima de restriccin. Ha quedado rota la molcula de ADN, quedando bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

 Secuencias Palindromicas:
Secuencias determinadas de 4-8 nucletidos, que tienen la misma lectura en una hebra y en la complementaria en la misma direccin. Por ejemplo: 5ACCTAGGT3 3TGGATCCA5

Enzimas de Restriccin
La funcin de las enzimas de restriccin es la de proteger al organismo del DNA extrao. Cuando una porcin de DNA forneo ingresa a la clula, las enzimas de restriccin se encargan de degradarlo cortndolo en pequeos fragmentos, siempre y cuando ste no est modificado.

TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION

Sistemas tipo I Una sola enzima (multimrica que posee 3 sub-unidades) reconoce la secuencia especfica de ADN, metila y restringe. Pero la restriccin no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento por ello no se suelen emplear para ADN recombinante. Cortan en un sitio cercano al sitio de restriccin.

TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION

Sistemas tipo II
Enzimas diferentes realizan la restriccin y modificacin. La restriccin ocurre en el sitio de reconocimiento adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en gentica molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios especficos, y as, recuperar secuencias conocidas.

TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION

Sistemas tipo III Es similar al sistema tipo II en cuanto a la precisin del lugar de corte, pero se diferencian de stas que solo cortan entre nucletidos del mismo tipo por ej. entre dos adeninas. Utilizan una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas, y rompen el DNA 25-27 pb, ms all del sitio de reconocimiento.

 Existe otro tipo de ER de doble funcin, denominadas Endoexonucleasas, las cuales son capaces tanto de aadir nucletidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas tambin son muy especficas y reconocen secuencias exactas pueden tener un papel fundamental en la reparacin del DNA y/o en la muerte de clulas defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endoexonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, clulas de mono y clulas leucmicas de humano (Fraser 1994). Las potenciales aplicaciones en la medicina de estas enzimas podra llevar a curar varias enfermedades

PRINCIPALES ENZIMAS DE RESTRICCION

TIPOS DE CORTES
1. Cohesivos o pegajosos: dejando productos con
extremos complementarios. Ej. Eco RI y Pst I
GAATTC CTTAAG GGATCC CCTAGG AAGCTT AACGAA

EcoRI

BamHI

HindIII

2. Abruptos: dejando productos con extremos ciegos Ej:

Pvu II
AATAAT TTATAA CCCGGG GGGCCC

Sspl

Smal

PRINCIPIOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION

Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica de nucletidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restriccin.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ER

1. Pureza del ADN : la reaccin de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, inhiben la endonucleasa. 2. Temperatura y pH : las enzimas son muy sensibles a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad. 3. DNAsas : Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++. 4. Contaminantes con carga (-).

5. DNA contaminado con otro DNA. 6. Grados de metilacin : algunas endonucleasas son inhibidas por metilacin. 7. Tipo de molcula de DNA : si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material gentico (ej. si el DNA est superenrrollado el lugar de restriccin no va a estar accesible para la enzima). 8. Buffer adecuado : este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones ptimas.

APLICACIONES DE ENZIMAS RESTRICCIN

1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. 2. Fragmentar ADN genmico para la separacin de electroforesis y Southern blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southern y Northen Blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin del ADN recombinante.

USOS EN FUTURO DE ENZIMAS DE RESTRICCION

En ingeniera gentica, los cientficos utilizan estas enzimas de restriccin para aislar segmentos de ADN que contiene un gen de inters, por ejemplo, el gen que regula la produccin de insulina.
Un plsmido extrado de su bacteria y tratado con la misma enzima de restriccin puede formar un hbrido con estos extremos pegajosos' de ADN complementario. El plsmido hbrido se reincorpora a la clula bacteriana, donde se replica como parte del ADN celular. Se puede cultivar un gran nmero de clulas hijas y obtener sus productos genticos para uso humano.

ENZIMAS DE RESTRICCION
Estas enzimas se encuentran en la naturaleza en numerosas especies de bacterias, en las cuales desempean un papel defensivo que, en cierta manera, puede ser equiparado al de un prototipo de sistema inmunitario. Las enzimas de restriccin se denominan as porque restringen el crecimiento de los virus parsitos de bacterias: los bacterifagos. El mecanismo se basa en que cortan la molcula de ADN de bacterifagos y, de esa manera, los eliminan. El tipo de corte del ADN que producen estas enzimas es muy especfico: cada enzima de restriccin corta solamente cuando encuentra una secuencia de bases determinada y especfica para esa enzima de restriccin.

MECANISMO DE ACCION
Muchas enzimas de restriccin actan reconociendo una secuencia especfica de bases del ADN que es palindrmica, es decir, que puede leerse, invertida, en la hlice complementaria. Estas secuencias palindrmicas tienen otras propiedades extraordinarias: Tienen un eje de simetra en cada hlice, lo cual hace que cada hlice tenga auto complementariedad en su secuencia. Estas secuencias palindrmicas en general pueden adoptar ms de una forma espacial cuando se encuentran en una molcula de ADN.

De esta manera, cada subunidad lleva a cabo un corte, es decir, una ruptura de unin fosfodiester por hidrlisis en una hlice y, en conjunto, se realizan dos cortes, uno a cada cadena; los dos cortes, en EcoRI y otras enzimas, se hacen a distinto nivel pero en forma simtrica respecto del centro de la secuencia reconocida.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restriccin. Se aprecia la actuacin en ambas hebras

Los extremos pegajosos

Para que se produzca el repegado de las dos caras de corte inferidas por una enzima de restriccin, es necesario el consumo de energa (provisto por A TP) y una enzima ligasa de ADN (p. ej., la ligasa T4). Por consiguiente, queda posibilitado el corte y repegado de molculas de ADN de diferente origen usando la misma enzima de restriccin.

Se ve el resultado de la actuacin de la enzima de restriccin. Ha quedado rota la molcula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

Formacin de una molcula de ADN recombinante 1) y 2) Algunas secuencias del ADN son reconocidas por enzimas de restriccin que lo cortan en fragmentos. 3) Un fragmento de ADN proveniente de otra fuente es agregado y se aparea con los fragmentos mediante complementacin de las hebras. 4) La enzima ADN ligasa une covalentemente las hebras dejndolas continuas.

Visualizacin de los fragmentos de ADN

Los geles de agarosa son un hidrato de carbono derivado del agar en los cuales los fragmentos de ADN "corren" con una velocidad inversamente proporcional a su tamao, es decir que los fragmentos pequeos corren con mayor rapidez. Los fragmentos de ADN se mueven en un campo elctrico simplemente porque poseen las abundantes cargas negativas de sus fosfatos, los cuales estn colocados regularmente a lo largo de la cadena. El ADN corre rpidamente y las electroforesis pueden realizarse en menos de una hora segn el voltaje aplicado. Un colorante visible a simple vista (azul de bromofenol) sirve de gua para saber cmo avanza la electroforesis.

Enzimas de Restriccin

DNA recombinante

Terminales cohesivos

Los vehculos (vectores) para transportar fragmentos de ADN: plsmidos, fagos

Los plsmidos son molculas de ADN circular de tamao moderado o pequeo generalmente se encuentra en algunos microorganismos, a los cuales favorecen en alguna funcin. Todo plsmido contiene una secuencia de nucletidos particular, denominada "origen de replicacin", que es reconocida por una polimerasa y permite la replicacin del plsmido. Esta replicacin se realiza en uno solo de los sentidos posibles del ADN circular de un plsmido. El principio para injertar un fragmento de ADN ("inserto") en un plsmido es sencillo: un fragmento de ADN conseguido con una enzima de restriccin (p. ej., EcoRI) que deja sus dos extremos "pegajosos" es puesto en contacto con un plsmido que tiene el mismo sitio de restriccin.

Tipos de Vectores

PLSMIDOS
Son molculas circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma de la clula hospedera. La inmensa mayora son circulares cerrados covalentemente (c.c.c.) y superenrollados. Poseen la capacidad de integrarse reversiblemente en el cromosoma bacteriano

PLSMIDOS
Existe una amplia gama: desde plsmidos muy pequeos (de unas 2 kb) hasta plsmidos muy grandes (ciertos plsmidos de Pseudomonas tienen 500 kb). Incluso existen "megaplsmidos" en ciertos Rhizobium que llegan a tener 1600 kb

TIPOS
Plsmidos conjugativos (autotransmisibles), que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fenmenos de conjugacin. Plsmidos no conjugativos, carentes de esta propiedad de conjugacin.

FENOTIPOS
Resistencia a antibiticos (plsmidos R) Resistencia a metales pesados ejemplo,resistencia a mercurio). Plsmidos de virulencia Produccin de bacteriocinas

(por

ESTRUCTURA DE LOS PLASMIDOS

REPLICACION DE PLASMIDOS

Son unidades de replicacin autnoma. Aprovechan la maquinaria de replicacin del huesped. Mecanismos de replicacin:

- Modelo de replicacin en theta.

- Modelo de replicacin en crculo rodante.

CUALIDADES DE UN VECTOR CLONADO

-Deben ser pequeos y con replicacin control relajado -Deben contener marcadores genticos particulares,

como genes de resistencia a antibiticos el gen que codifica la -galactosidasa.

-Deben contener uno ms sitios de restriccin nicos en una regin que no sea esencial para la replicacin del plsmido.

PLASMIDOS RECOMBINADOS:

Los plsmidos son excelentes vectores de clonaje. Puede ser "cortado" con una dos enzimas de restriccin puede incorporrsele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de restriccin. Los plsmidos as modificados se los denomina plsmidos recombinados. En ste estado, se los introduce entonces en una bacteria donde sern replicados.

El marcador de seleccin:
Es crucial el poder distinguir entre las colonias que contienen los plsmidos recombinados de aquellas que contienen ya sea plsmidos no recombinados que no contienen ningn plsmido. Varios mtodos existen para realizar sta distincin y se basan en el uso de un marcador de seleccin.(AMPICILINA).

1. El inserto de un segmento de ADN extranjero en un plsmido:

2. transformacin de bacterias por el plsmido.

3. seleccin de bacterias transformadas

Bacterifagos como vectores

Los bacterifagos tienen ciertas ventajas sobre los plsmidos como transportadores de fragmentos de ADN. En primer lugar, ingresan ms eficientemente a las bacterias, puesto que la infeccin por fagos es ms eficiente que la captacin de plsmidos (transformacin bacteriana). Adems, ciertos fagos son mayores y pueden acomodar fragmentos ms grandes de ADN El fago lambda es el ms usado; tiene 48.502 pb y puede adoptar forma circular o lineal puesto que sus extremos son pegajosos.

Una vez conocida el fragmento de ADN y su secuencia, la protena de inters inmunolgico, se asla el fragmento de ADN (1), y se inserta en un plsmido (2). Este plsmido se introduce en un vector de expresin (E. coli, Baculovirus) (3). Algunos aceptarn el gen y producirn el recombinante (4). Otros, la

Clonacin o multiplicacin de fragmentos de ADN

Los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restriccin pueden ser vehiculizados en plsmidos, fagos o CAL y por cualquiera de esos vehculos o vectores es posible introducidos en clulas (bacterianas o de levaduras) con el fin de multiplicar ese fragmento hasta obtenerlo en cantidades suficientes para estudio. La donacin de fragmentos de ADN generalmente se realiza en la bacteria E. coli, en cepas que no contengan enzimas de restriccin y no patognicas.

Genoma de Escherichia coli

Un solo cromosoma circular (4639,221 pb) Contiene muchos plsmidos Modelo para estudios de ingeniera gentica 4,289 genes Produccin de protenas recombinantes

Clonacin molecular

Construccin de una librera de cDNA

YAC (yeast artificial chromosome)

Para construir un YAC, se introduce en un plsmido las unidades funcionales principales de un cromosoma de levadura: a) Un centrmero (CEN): asegura la reparticin del cromosoma durante la divisin celular.

b) Una secuencia de replicacin autnoma (ARS Autonomous Replicating Sequence) que permite al YAC duplicarse en forma autnoma, sin integrarse en otro cromosoma de levadura. c) Dos secuencias TEL indispensables que permiten al YAC replicarse en forma de molculas lineales.
d) Varios marcadores de seleccin metablica e) Un sitio de clonaje

YAC

BAC (bacterial artificial chromosome)

Vector para clonar fragmentos de DNA (tamao de inserto promedio, 150 kb) en clulas E. coli, basado en el plsmido natural de la misma. Los BACs usados para el Proyecto Genoma Humano. El BAc integra caractersticas del factor F (de fertilidad) de E. coli. Este factor F es un plsmido de conjugacin que puede organizar con gran eficiencia su propia transferencia de una bacteria F+ a una bacteria F-. Plsmido F tiene la capacidad de integrarse en el cromosoma bacteriano (episoma)y de liberarse. Plsmido F contiene genes esenciales para su replicacin y controlar nmero de copias. Genes oriS y repE aceleran replicacin unidireccional. Genes parA y parB mantienen el nmero de copias limitado a 1 2 por clula.

Levansucrase de Bacillus subtilis

Vectores de expresin
Problema: promotores, reguladores proteicos, secuencias seales, modificaciones, etc Clonacin en bacterias para obtener protenas recombinantes a escala industrial, pero - problemas con protenas de fusin, actividad biolgica disminuda, mecanismos de secrecin, etc. Clonacin en levaduras y expresin del gen (DNA inserto) es semejante a clulas de organismos superiores y ms usado en biotecnologa - modificaciones postranscripcionales, postraduccionales, glucosilaciones, etc - S. cerevisiae, P. pastoris, etc.

polylinker promotor
marcador (gen de resistencia)

Vector de expresin procariote

ori

Procesos de manipulacin
Aislar el gen de inters Incorporar el gen en un vector (plsmido, YAC, BAC) El vector debe contener marcadores (resistencia a antibiticos, sitios de restriccin, reguladores) El vector se introduce a la clula (Ejm. Agrobacterium tumef.). Siembra de clulas en medio de cultivo con antibitico Slo las clulas que contiene el gen de resistencia al antibitico y el gen insertado se multiplican

Algunas protenas importantes en salud humana

Insulina (regul. glucosa) para diabetes Inteferones ( para hepatitis B, C y leucemias; para esclerosis mltiple) Factores VIII, IX (coagulacin sang.) para la hemofilia Activador del plasmingeno tisular ( TPA) Eritropoyetina (reproducc. eritrocitos) Hormonas del crecimiento HGH Enzimas (proteasas, lipasas)

Animales transgnicos
Animales que portan genes o secuencias de DNA exgeno (Ejm. ratones con insulina humana). Procedimiento: microinyeccin de ovocitos (lento e ineficaz para incorporar el DNA) Animales lecheros: bioreactores, facilidad de extraccin (bovinos, ovinos, etc) Mas difcil que en procariotes pero expresin correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal, etc.

Escocia, 1992:

1-AT

1-AT, 35 g. por litro

1990: Lactoferrina humana en leche de vacas transgnicas (Gene Pharming Europe)

1991: Gen TPA en leche de cabras transgnicas (Genzyme Transgenic Corporation-USA)

Ratones transgnicos
Microinyeccin del ADN exgeno a proncleos masculinos de huevos fecundados de ratonas e implantacin a madres nodrizas seudopreadas Microinyeccin de ADN a blastocisto desde embrioblastos (clulas madre) cultivadas.

 Verduras y frutas con mayor contenido de flavonoides

Alimentos con menor contenido de colesterol

Terapia gnica
1990-1995: ADA, LDLR,... Ejm.: Hipercolesterolemia familiar deficiencia de LDLR Tratamiento: - extraccin de una porcin de hgado del paciente, - separacin de clulas con colagenasa, cultivo por 2 das, - transduccin con retrovirus que transporta gen normal LDLR - inyeccin de hepatocitos transformados al paciente

Cmo clonar ?
Transferencia nuclear (usualmente de clulas embrionarias) a vulos 2 clulas :
a) recipiente (vulo no fertilizado) b) donadora ( a ser copiada) desarrollo luego de ser estimuladas

Microscopio de gran resolucin, micropipetas

Metodo de Transferencia nuclear

Transferencia de un ncleo al vulo

Ensayos en clonacin animal

R, Briggs y T.J. King (1952) Proc. Acad. Sci. USA 38:, 445: Transferencia nuclear (blastocistos) a ovocitos desnucleados => renacuajos J. Gurdon (1960) obtuvo ranas adultas a partir de clulas epiteliales de intestino de renacuajo introducidos a ovocitos de ranas No se poda obtener todava clones generados de individuos adultos

Uso de clulas en cultivo

Totipotencia y diferenciacin celular Clulas de embriones en estado temprano (laborioso y difcil de obtener) Clulas en cultivo
ms fcil manipular dura ms, se puede guardar, chequeo del producto

Clonacin de mamferos
Roslin Institute, Escocia (1995-1996) Dos clases de experimentos: A) De clulas embrionarias de oveja Megan y Morag B) De clulas de una oveja madura (epitelio de glndula mamaria) Dolly Despus, clonacin de: terneros, cabras, vacas, cerdos, felinos, aves,

Dolly

Nacimiento: 5 Julio 1996

Sacrificada: Feb 2003