ACTIVIDAD PRCTICA N 1 EMPLEO DEL MICROSCOPIO

200 mm (0.2 mm) Lmites de resolucin

Las clulas animales tpicas miden entre 10 y 120 m de dimetro Son incoloras translcidas. y

0.2 mm (real: 0.5 mm)

Se requiere el empleo de un aparato que magnifique la imagen. Se precisan sustancias que tian o confieran colores de contraste a las estructuras del tejido.

0.1 nm

MICROSCOPIO PTICO (MO)

En un microscopio ptico de campo brillante (comnmente usado en los laboratorios), el preparado o especimen, es colocado en una platina. La magnificacin final (aumento con el cual se observa) se obtiene al multiplicar el aumento del lente ocular por el aumento del lente objetivo. El poder de resolucin, es la capacidad que entrega el microscopio, para visualizar como separadas, dos estructuras contgas (muy cercanas entre s). Mientras menor sea la distancia entre las dos estructuras, que permita observarlas separadas, mayor ser el poder de resolucin del microscopio.

Platina y pinza

Revolver y lentes objetivos

Tornillos macro y micromtrico

Base y fuente de iluminacin

Microscopio electrnico de transmisin (MET)

l: en un MET que posee una velocidad de aceleracin de los electrones de 100.000 V, la longitud de onda es de 0.004 nm. Al reemplazar en la frmula de clculo del poder de resolucin, entrega un valor de D = 0.2 nm. En este microscopio, los electrones atraviesan el tejido, mostrando estructuras intracelulares e intercelulares.

MET de traquea, donde se observan clulas epiteliales ciliadas y clulas secretoras de mucus.
Note que con este microscopio, los electrones atraviesan la muestra permitiendo la visualizacin de estructuras intra y extracelulares .

Microscopio electrnico de barrido (MEB)

Nota: Los valores de D, expresan el poder de resolucin, es decir la capacidad para ver separadas dos estructuras que realmente se encuentran separadas. D = 3 - 20 nm El valor de D (lmite de resolucin) es mayor en el microscopio de barrido, respecto al de transmisin, por lo tanto su poder de resolucin es menor.

MEB de testculo, donde se observan clulas que constituyen el tbulo seminfero, con los espermatozoides en su interior. Note que con este microscopio, los electrones chocan sobre la superficie de las muestra, permitiendo visualizar en tercera dimensin de estructuras celulares completas .

Identifica los diferentes componentes del microscopio ptico.

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TCNICAS HISTOLGICAS

TCNICAS HISTOLGICAS
Procedimientos en serie visualizacin en microscopio.
Objetivo: Preservar tejido en el tiempo evitando su descomposicin, obtener una lmina delgada de tejido y aumentar su contraste.

Etapas:
Fijacin. Deshidratacin Diafanizacin o aclaramiento. Inclusin o infiltracin. Corte o seccin.

Montaje y desparafinado.
Tincin. Observacin al microscopio.

 Obtencin de la muestra. Fijacin de (formaldehdo). la muestra,

Lavado de la muestra ya fijada. Se sumerge la muestra en bateras de alcohol en grado creciente (deshidratacin). Se sumerge en Xilol (aclaramiento). La muestra se incuba en parafina liquida a 60c. Corte en un microtomo (5 - 7 mm). Se sumerge la muestra en bateras de alcohol en grado decreciente (desparafinacin). Se tie con colorantes aumentar el contraste. para

Se cubren los preparados para su observacin.

Finalidad de fijacin: Evitar la autolisis. Preservar estructuras con un mnimo de alteracin, permitiendo avanzar a los pasos siguientes. Endurecer los tejidos. Accin antisptica que evita contaminacin del operador y descomposicin del tejido.

Los tejidos fijados, son procesados en forma secuencial en un equipo automatizado.

Una vez obtenido el bloque de tejido y parafina se procede a realizar el corte.

CORTE:
Obtencin de lminas delgadas de tejido (3 a 10 mm en M.O y de 20 a 100 nm en M.E.). En M. ptica se emplea un micrtomo con navajas de acero. Para M. electrnica se utiliza un ultramicrtomo con navajas de vidrio o diamante.

Los cortes de tejido de 5m de espesor se estiran en un bao de flotacin a 37-40C, para su estiramiento y montaje sobre un portaobjetos de vidrio.

Los tejidos montados en portaobjetos se dejan secar en una superficie a 37C, para proceder a su desparafinado, hidratado y su posterior tincin.

TINCIN: Colorantes ms utilizados BSICOS: hematoxilina azul de toluidina CIDOS: eosina floxina Las estructuras que se tien con colorantes bsicos se denominan BASFILAS. Las estructuras que se tien con colorantes cidos se denominan ACIDFILAS.

(tetrabromofluorescena)

--Al+3

- -Al+3 (hematoxilina)

TINCIN:
o Genera uniones moleculares con colorante activo. o Radicales bsicos del colorante, se unen a estructuras celulares cidas. o Radicales cidos del colorante, se unen a estructuras celulares bsicas. o Hematoxilina es de color azul-morado posee pH bsico y carga (+). o Eosina es de color rojo posee pH cido y carga (-).

o Orcena tie fibras elsticas de color castao.

o Plata (argntica) tie lminas basales y fibras reticulares. o Tambin se utilizan metales pesados (Os, Pb, U) para M. electrnica.

EOSINA

HEMATOXILINA

Los elementos del tejido que presenten una afinidad qumica (por carga elctrica, pH), por alguno de los dos colorantes de la tincin, lo retendrn y se teirn con su color.
Los elementos del tejido que presentan afinidad por la Hematoxilina, presentan carga elctrica negativa, se tien de color azul/morado y se denominan basfilos. Los elementos del tejido que presentan afinidad por la Eosina, presentan carga elctrica positiva, se tien de color rojo/rosado y se denominan acidfilos.

Este preparado ha sido teido con una tincin llamada Hematoxilina y Eosina (H+E). Las estructuras que se observan de color rosado, han captado el colorante cido llamado eosina, denominndose acidfilas. Las estructuras de color azul-morado, que en este caso corresponden a ncleos de clulas, se han teido con la hematoxilina, denominndose basfilas, por su afinidad por un colorante de tipo bsico.

Otra tincin bastante empleada, es la reaccin del cido perydico-Schiff o tincin de PAS.

Ella se basa en la presencia de grupos qumicos aldehidos, los que se encuentran abundantemente en los hidratos de carbono, presentes por ejemplo en el mucus o en los cartlagos.
Si la cantidad de grupos aldehidos vecinos entre s, es alta, la reaccin ser muy intensa. Si la cantidad es menor, la reaccin ser leve.

El reactivo de Schiff en s es incoloro, pero al reaccionar con un tejido que presente estos grupos aldehidos, se torna de un color fucsia magenta muy caracterstico.

Este preparado corresponde a colon y ha sido teido con tincin de PAS; las estructuras que se observan de color fucsia, corresponden a un tipo de clulas secretoras de mucus, las clulas o glndulas caliciformes. El mucus es un material lubricante rico en hidratos de carbono. En la zona superior de la preparacin, se observa una capa, la que corresponde al contenido intestinal, mezclado con el mucus, rico en carbohidratos, producido por estas clulas.

Otro tipo de tcnicas de tincin, ms sofisticadas y especficas son las llamadas tcnicas de Inmunocitoqumica. Ellas se basan en la especificidad que poseen los anticuerpos (Ig o Ac) por sustancias denominadas antgenos (Ag) contra la cual se producen. Estos anticuerpos se colocan en contacto con el tejido a teir y si en l existen antgenos, los anticuerpos se fijarn sobre ellos en forma especfica, es decir reconocern a esa sustancia en particular.

Para poder visualizar la unin de un anticuerpo a un antgeno presente en un tejido, debe colorearse o marcarse al anticuerpo para su observacin al microscopio. Si colocamos un anticuerpo marcado en presencia del tejido con el antgeno, hablamos de una tcnica de inmunocitoqumica directa. Ag Ac Ag + Ac En A, el anticuerpo Ac, se encuentra marcado por una sustancia fluorescente, la que se visualiza en un microscopio de fluorescencia. En B, se utiliza una enzima, la peroxidasa, la que muestra un color marrn, al microscopio ptico.

En C, se ha marcado el antcuerpo con un metal pesado, el que permite visualizar la zona de unin de Ag + Ac, al microscopio electrnico.

Otra tcnica es la llamada inmunocitoqumica indirecta, en la cual el antgeno es marcado con un anticuerpo 1, el cual no est marcado y no puede ser visualizado, para poder detectar la unin al antgeno, se agrega un 2 anticuerpo el que se encuentra marcado con una sustancia fluorescente, una enzima coloreada o un metal pesado.

Primer anticuerpo (Ac1), preparado en conejo, contra antgeno (Ag) X del tejido.

Segundo anticuerpo (Ac2) contra el anticuerpo de conejo Ac1, preparado en oveja (u otra especie distinta a conejo), que est unido a una molcula que resulta visible al microscopio.

Inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos fluorescentes anti-actina y anti ADN

Inmunocitoqumica con anticuerpos anti-enolasa (mtodo peroxidasa). La zona que entrega presencia de la sustancia en estudio, se marcar de color caf.

Una vez teido el preparado se deshidrata y se aclara la muestra.

COLOCAR UN CUBREOBJETOS:
Permite proteger muestra frente al roce y ambiente. Permite conservar el preparado histolgico por un tiempo ms prolongado.

OBSERVACIN AL MICROSCOPIO

La observacin al microscopio se debe iniciar con el aumento menor, para obtener una visin panormica del preparado y luego ir aumentando al objetivo medio y mayor, segn se requieran obtener detalles.