FIJACIN La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que

se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima. Fijacin de la muestra. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan para tal fin.

Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.). 2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.). 5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella. 6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

FIJACION DE LA MUESTRA

Clases de fijadores Existen muchas clases de sustancias fijadoras. Una clasificacin de los diferentes tipos de fijadores es la propuesta por Backer (1960): Aldehidos. Son algunos ejemplos: el paraformaldehido, el glutaraldehido, la acroleina y el glioxilato Agentes oxidantes. Los ms utilizados: el tetrxido de osmio, el permanganato potsico y el dicromato potsico. Agentes desnaturalizantes de proteinas. Algunos ejemplos: el cido actico, el alcohol metlico y el alcohol etlico Fijadores que actan por mecanismos poco conocidos. Pertenecen a este grupo el cido pcrico y el cloruro de mercurio.

Cmo se elige un fijador La decisin de emplear un fijador u otro es siempre funcin del tipo de estudio histolgico que deba realizarse. Existen soluciones fijadoras que son ms adecuadas que otras para cada tipo de procesamiento y estudio. Distinguimos entonces: Fijacin para microscopa ptica Fijacin para microscopa electrnica Fijacin para estudios topogrficos o morfolgicos Fijacin para demostracin de productos especficos Fijacin para estudios histoqumicos Fijacin para estudios inmunocitoqumicos Los mtodos fsicos de fijacin ms empleados son: Fijacin por calor Fijacin por microondas

Forma de actuar de los fijadores Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos (en su mayora, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula de hidrgeno con su cromforo).

Fijadores qumicos Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitucin. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos. b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica. c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.). d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%.

FIJADORES COMPUESTOS: En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica. b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica. c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.

FIJADORES FSICOS: 1. Desecacin. 2. Calor seco. 3. Calor hmedo. 4. Fro. 5. Congelacin y desecacin.

Los mtodos qumicos de fijacin ms empleados son: Fijacin por inmersin. Este mtodo consiste en tomar o extraer una muestra del tejido u rgano que se vaya a procesar y sumergirlo en una solucin fijadora. Normalmente, se introduce la pieza de tejido en un frasco que contiene la cantidad adecuada de fijador. Fijacin por vapores. Este mtodo consiste en exponer la muestra que se pretenda fijar a la accin de los vapores del fijador. Fijacin por perfusin. Este mtodo consiste en realizar una perfusin de la solucin fijadora utilizando el torrente vascular. Es el mtodo empleado normalmente con animales de experimentacin en los que se practica una perfusin cardiaca o artica. Con la utilizacin de este mtodo se consiguen las mejores fijaciones (y por lo tanto las mejores observaciones histolgicas) puesto que: Se facilita el proceso de penetracin del fijador al interior de las muestras. Se evita la deformacin del tejido durante la manipulacin de extraccin preservndose mejor la estructura de los tejidos blandos. El proceso de fijacin comienza inmediatamente y se ha comprobado que de esta forma el nmero de clulas picnticas que se observa en los tejidos es menor que utilizando otros mtodos de fijacin. Tambin se ha observado que el nmero de mitosis observado es mayor que utilizando otros mtodos. Tras la perfusin, usualmente se completa el proceso de fijacin disecando las piezas objeto de estudio y fijndolas seguidamente por inmersin. En ocasiones, pueden combinarse los mtodos fsicos y los qumicos ya sea secuencialmente o simultneamente. Por ejemplo se puede fijar con microondas una pieza sumergida en un fijador qumico.

Propiedades de los fijadores Mecanismos de Fijacin Los mecanismos de accin de ciertos fijadores son poco conocidos. Es el caso de los fijadores basados en el uso de sales de mercurio. La mayor parte de los fijadores establecen entrecruzamientos con protenas solubles y estructurales formndose, como consecuencia, un gel que mantiene una estructuracin muy parecida a la observada in vivo Algunos fijadores interaccionan con los cidos nucleicos. Fijacin de las protenas Formaldehido: entrecruzamiento con aminocidos externos (especialmente con la lisina). Reacciones reversibles durante las primeras 24 horas. Preserva bastante tanto la capacidad antignica como la actividad enzimtica. La morfologa suele ser ptima pero la ultraestructura puede ser deficiente. Glutaraldehido: formacin de polmeros que establecen entrecruzamientos con las protenas. Con el paso del tiempo los polmeros se van uniendo entre s. Reacciones rpidas e irreversibles. Puede inhibir tanto la actividad enzimtica como la capacidad antignica. Se obtiene una muy buena preservacin ultraestructural.

Factores implicados en la fijacin 1. Concentracin del fijador La capacidad de fijacin de la solucin fijadora que empleemos vendr determinada por la concentracin del fijador utilizado. A mayor concentracin mayor fijacin. Sin embargo conviene elegir la concentracin adecuada para impedir que la interaccin del fijador con el tejido (efecto barrera) sea un impedimento para la entrada del fijador hacia la parte central de la muestra. Concentraciones muy elevadas del fijador pueden provocar malas fijaciones El formol comercial (35%) se utiliza normalmente diluyndolo 10 veces para preparar la formalina. El paraformaldehido suele utilizarse en concentraciones del 2 al 4% El glutaraldehido (que se comercializa al 25%) puede utilizarse a concentracin entre el 0,1 y 2,5 % 2. Tampn y pH Pueden utilizarse los fijadores en soluciones acuosas, pero para trabajos ms finos es necesario que el vehculo est tamponado a un pH determinado (en funcin del tipo de tejido o de la actividad enzimtica que se desea determinar). La morfologa y ultraestructura se mantienen aceptables dentro de un margen de pH de 6 a 8. Para tejido nervioso se recomienda generalmente un pH de 7.4

Tampones ms utilizados El tampn fosfato, el tampn cacodilato, o el tampn veronal Hay ciertas precauciones que hay que tener en cuenta: Evitar interacciones entre el fijador y el tampn (Por ejemplo: el tampn tris y los barbituratos reaccionan con los aldehidos) Algunos tampones inhiben ciertas actividades enzimticas mientras que otros las favorecen (Por ejemplo: el tampn fosfato inhibe la glucosa 6'-fosfato deshidrogenasa; el tampn trizma-maleato favorece la determinacin enzimtica de las fosfatasas)

Temperatura Para muchos de los estudios que se realizan en Microscopa ptica las fijaciones suelen realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, para estudios Histoqumicos o Inmunocitoqumicos o cuando el objetivo es realizar un estudio en Microscopa electrnica, las fijaciones conviene realizarlas en nevera a temperatura de 0-4 grados C. En general, incrementando la temperatura, se acelera el proceso de fijacin. Cuando se utilizan bajas temperaturas, hay que aumentar los tiempos de fijacin.

Penetracin de los Fijadores Cada fijador tiene un coeficiente de difusin intrnseco que indica el grado de penetracin que posee, expresado en milmetros por hora. Para facilitar la penetracin de los fijadores, se han de retirar todos los obstculos que impidan su penetracin (Por ejemplo, para fijar el cerebro hay que retirar las meninges). Para facilitar la fijacin, las muestras se han de trocear en rebanadas lo ms delgadas posibles: Para microscopa ptica, son suficientes rebanadas de 5 mm. de grosor. Para microscopa electrnica se recomienda que estas rebanadas tengan un grosor menor a 1 mm. Volumen Para asegurarnos buenas fijaciones por inmersin es necesario que el volumen del fijador exceda en una proporcin de 10:1 el volumen de las muestras. Es conveniente cambiar el fijador una o varias veces a lo largo de la fijacin. Osmolaridad Es importante ajustar la presin osmtica de la solucin fijadora. Si la solucin fijadora es isotnica (340 mOsm) o hipotnica, se produce vacuolizacin celular. Si la solucin fijadora es muy hipertnica se produce una contraccin del tejido con retraccin celular. Los mejores resultados se consiguen con una solucin ligeramente hipertnica de 400 - 450 mOsm.

Para ajustar la la osmolaridad de las soluciones fijadoras se recurre a la adicin de determinadas sustancias como: dextranos, polivinilpirrolidona, sucrosa (>5%) o Cloruro sdico (0,9%) Tiempo de Fijacin Hay que ajustar cuidadosamente el tiempo de fijacin en funcin del fijador utilizado, de su concentracin, de la temperatura y del objetivo del estudio. Una fijacin excesiva produce efectos adversos como: Retraccin del tejido; endurecimiento excesivo que dificulta la ulterior obtencin de cortes; extraccin de algunas molculas; inhibicin de actividades enzimticas; prdida de caractersticas antignicas; y degradacin general del tejido por oxidacin de las protenas.

Obtencin de muestras y proceso histolgico Toda muestra, ya sea procedente de una biopsia, una autopsia, o de un trabajo experimental (utilizando animales de experimentacin) que deba estudiarse en el laboratorio de Histologa debe estar bien identificada desde el principio. Todos los recipientes que la contengan deben estar convenientemente etiquetados con una referencia adecuada. Una vez las muestras han sido convenientemente fijadas se ha de proceder con el desarrollo del proceso histolgico adecuado que permitir la obtencin de cortes. En funcin de las tcnicas de tincin que se pretendan emplear y del tipo de estudio que se quiera realizar, las muestras se procesarn de una forma u otra. En ocasiones (cuando se ha de realizar un diagnstico rpido de una biopsia, o cuando la tcnica lo requiere) puede ser necesario o conveniente obtener secciones histolgicas sin realizar una fijacin previa. En estos casos las muestras se congelan rpidamente y se cortan con un microtomo de congelacin En trminos generales puede decirse que el proceso histolgico pretende dar soporte o endurecer lo suficientemente las muestras para permitir la obtencin de cortes delgados.

DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA Deshidratacin Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente. Se dispone una lmina en un cassette de deshidratacin. Deshidratacin en alcoholes sucesivos. Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol. Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blancolechoso es que la deshidratacin no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto cerciorndonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de xilol no debe enturbiarlo.

Se dispone una lmina en un cassette de deshidratacin.

Penetracin de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina. Penetracin de la parafina a 56-58C. Inclusin definitiva o formacin del bloque En moldes de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.

OBTENCIN DE CORTES El objeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones.

Deshidratacin en alcoholes sucesivos.

Penetracin de la parafina a 56-58C.

Barras de Leuckart

Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelacin, y el cristato o critomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. - Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta. Corte en micrtomo tipo Minot. - Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

Corte en micrtomo tipo Minot.

- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la disposicin horizontal de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos ms modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra a -60 C gracias a la existencia de una placa de congelacin instantnea. Frente al micrtomo convencional de congelacin, el cristato posee la gran ventaja de permitir la obtencin de cortes mucho ms delgados.

COLORACIN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin. Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solucin colorante. Clasificacin de los colorantes: Segn su origen se clasifican en: COLORANTES NATURALES: - Animales (carmn) - Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn) COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA): - cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos. - Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata).

CRIOSTATO

Por otro lado, las coloraciones pueden ser: - Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada. - Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado. Mtodos de coloracin: - Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto. - Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para que la coloracin tenga lugar. - Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo. - Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin. - Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (ncleo, fibras elsticas, etc.). - Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y cidos que contrastan por sus colores. - Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa). - Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros que se necesiten.

Colorantes ms utilizados en histologa humana: HEMATOXILINA: - Es un colorante vegetal. - Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.) - Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto. EOSINA: - Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo). - Presenta autofluorescencia espontnea. - Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.

Batera de Coloracin H&E.

MONTAJE Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.

PROTOCOLO GENERAL A continuacin se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra ctedra para la tcnica de Hematoxilina - Eosna para preparados de uso didctico: I. Fijacin En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs. II. Corte Se le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'. III. Deshidratacin 1) Alcohol 70, 1h30'. 2) Alcohol 96, 1h30'. 3) Alcohol 100 (l), 1h30'. 4) Alcohol 100 (ll), 1h30'. 5) Xilol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusin 1) Secado de la muestra con gasa. 2) Parafina 56 (l), 1h30'. 3) Parafina 56 (ll), 1h30'. 4) Formacin de la barra o bloque. 5) 30' de frezzer. 6) Fractura del taco V. Corte

VI. Coloracin 1) Secado de los cortes en estufa a 58C, 15'. 2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa. 3) Xilol o toluol (II), 2'. 4) Alcohol 100, 30". 5) Alcohol 96, 30". 6) Alcohol 70, 30". 7) Alcohol 50, 30". 8) Agua destilada, 30". 9) Hematoxilina, 130". 10) Agua corriente, 2. 11) Alcohol 50, 15". 12) Eosina, 30". 13) Alcohol 96, 10". 14) Alcohol 100, 10". 15) Xilol, 1 por lo menos. 16) Montaje con Blsamo de Canad sinttico.

RECOMENDACIONES TILES - Las tcnicas histolgicas pertenecen al tipo denominado "tcnicas contrarreloj". Si Ud. est apurado no las empiece, djelas para cuando su trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad. - Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios. - Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solucin. - Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo. - Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100 siempre tapados. - Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plsticos porque resultan atacados por estas sustancias. - Si debe trabajar con cidos hgalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio. - Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo despus comience con los pasajes del material.

- Si debe realizar simultneamente varios procesos de inclusin, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitar confusiones. - Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada tcnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios. - Antes de iniciar cualquier tcnica, primero lala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, rena los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y despus comience el proceso. - Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.