Aminocidos, peptdeos e protenas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Caractersticas qumicas dos aminocidos

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Os aminocidos

Os aminocidos presentes nas protenas so ismeros L

A biologia canhota

Carbono alfa

Glicina no tem isomeria ptica

Grupo R apolar e alifticos

Aminocidos apolares e hidrofbicos Ligaes de Van der Waals Ala, Val, Leu, Iso
Interaes hidrofbicas

Gly; menor aminocido Met

Possui tomo de enxofre

Pro
Iminocido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromticos
Aminocidos hidrofbicos Tirosina pode formar pontes de hidrognio com a gua Modificaes pstraducionais
Fosforilao do OH da tirosina

Fenilalanina
Mais apolar

Grupos R polares, no carregados

Solubilidade intermediria em gua Serina e treonina
Grupos hidroxil

Asparagina e glutamina
Grupo amida

Cistena
Grupo sulfidril Ligaes dissulfeto

Grupos R carregados
Aminocidos bsicos
Carga positiva Lisina, segundo grupo amino Arginina, grupo guanidina Histidina, grupo aromtico imidazol

Aminocidos cidos
Carga negativa Possuem segundo grupo cido carboxlico

Aminocidos incomuns
Modificaes ps-traducionais
4-hidroxiprolina 5-hidroxilisina 6-N-metil-lisina Gama-carboxiglutamato Fosforilao de resduos

Selenocistena
Selnio ao invs de enxofre na Cys adicionado durante a traduo por mecanismo especfico e regulado

pH e pKa
Constantes de dissociao dependem do pH do meio e so diferentes para diferentes molculas Ionizao

< pH; > [H]+

estado no-ionizado

Aminocidos so ionizveis
Substncias anfteras: possuem natureza dual

Podem funcionar assim como cidos ou bases

Doam ou recebem prtons

Titulao de um aminocidos
pKa: tendncia de um grupo fornecer um prton ao meio Aminocidos podem perder at 2 prtons para o meio

Concluso: a funo das protenas depende do pH ao qual esto submetidas

Curvas de titulao predizem a carga eltrica dos aminocidos

Alguns aminocidos podem ter tomos ionizveis tambm em sua cadeia lateral

Peptdeos e protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Polipeptdeo
>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY CN

Peptdeos tbm so ionizveis

Ou seja, possuem curva de titulao caracterstica Funcionam em faixas de pH timas

Nmero de resduos por protena

Uso de aminocidos
Varia bastante entre as protenas No permite predizer com preciso o comportamento molecular da molcula

Protenas com outros grupos qumicos

Adicionados ps-traducionalmente

Trabalhando com protenas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Protenas podem ser separadas e purificadas

Sabendo que a clula possui milhares de protenas, como purificar uma nica delas?
Basta selecionar por propriedade
Tamanho, carga e propriedades de ligao

Obter o extrato bruto

correr em cromatografia de coluna
Fase estvel (matriz) Fase mvel (soluo com tampo)

Coluna maior permite maior resoluo na separao

Cromatografia por troca inica

Polmero carregado negativamente
Protenas positivas ligam ao polmero e demoram mais a ser eludas da coluna

Afinidade da protena definido tambm pelo pH

Cromatografia por excluso de tamanho

Grnulos porosos na matriz seguram as molculas menores Molculas grandes no entram nos poros e so eludas primeiro

Cromatografia de afinidade
Adiciona-se matriz da coluna algum tipo de molcula ligante da molcula de interesse

Molcula ligadora de ATP; adiciona-se ATP matriz Elui-se com soluo de ATP

Eletroforese -- Histrico
1952, Markham and Smith
Ao estudarem hidrlise de RNA percebem que molculas de diferentes estruturas tm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo eltrico

1955, Smithies
Gis de amido funcionam bem para separar protenas do soro humano

Vou ali correr um gelzinho e j volto Tenho que ir seno vou perder meu gel

1967, Loening
Gis de acrilamida com maior resoluo e permitem separar ainda molculas grandes de DNA

1980, Schwartz and Cantor

Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes

hoje impossvel imaginar um laboratrio de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Eletroforese
Movimento de partculas dispersas num fludo sob influncia de um campo eltrico uniforme DNA, carga negativa
Tem tendncia a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo eltrico

Serve para separar molculas por tamanho/carga eltrica

Protena deve ser desnaturada com detergente (SDS)

Tcnica utilizada exausto em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas
1.Preparao do gel 2.Aplicao das amostras 3.Eletroforese 4.Colorao 5. Anlise dos resultados

Preparao do gel
Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

Aplicao das amostras

Definio do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel
Aplicao do campo eltrico Fonte eltrica gera fluxo de ons atravs da soluo tampo Terminais positivo e negativo

Tempo adequado, seno o DNA sai do gel

Colorao das molculas

Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

Melhor resoluo

Coomassie blue, etc Brometo de etdio

Agente intercalante do DNA
Cancergeno!

Composto fluorescente luz UV Gel de agarose

Eletroforese de um resultado de cromatografia

O marcador de peso molecular

Comprado de uma empresa
Possui protenas de peso molecular bem conhecido

Permite saber o peso molecular da(s) protena(s) presente(s) numa amostra

Geis bidimensionais
Corre-se o gel normalmente em uma dimenso... E depois virase-o e corre-se em outra dimenso Cada ponto representa aproximadamente uma protena original presente na amostra
Maiores gis do maiores resoluo

Protenas no separadas podem ser quantificadas

Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa Deve-se poder medir o produto da ao enzimtica Uma unidade de enzima digere 1mol de substrato por minuto a 25C

Estrutura primria das protenas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Nveis estruturais das protenas

As estruturas primrias das protenas so conhecidas

Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primria de todas as protenas para este organismo As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias proticas
E principalmente dentro da mesma

Sequenciamento de peptdeos
Degradao de Edman
Marca e remove apenas o resduo N-terminal

Mtodo ineficiente, permite sequenciamento de pequenas pores das molculas Sequenciamento do RNAm muito mais simples e preciso; permite sequenciar protenas enormes como a titina

Produo de peptdeos
Purificao a partir de tecidos Engenharia gentica Sntese qumica direta

Alinhamento de sequncias
Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas protenas (ortlogas)
Derivam do ancestral comum entre os organismos

O alinhamento permite que identifiquemos as pores mais importantes (conservadas) da protena

Evoluo molecular
Quanto mais similares as sequncias das protenas dos organismos, mais prximos eles so evolutivamente

rvore molecular da vida

Concluses
Diferentes caractersticas qumicas das cadeias laterais dos aminocidos definem caractersticas de peptdeos e protenas Os resduos de aminocidos so ligados s centenas ou milhares para formar peptdeos e protenas As protenas podem ser modificadas ps-traducionalmente As protenas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente cromatografia e eletroforese As protenas podem ser sequenciadas e sua estrutura primria (seq. de aminocidos conhecida) As sequncias das protenas so excelentes marcadores da evoluo da vida na terra