TECNICAS DE COLORACION.

PREPARACION DE MUESTRAS

Objetivos
Diferenciar y explicar el fundamento de las distintas coloraciones. Realizar coloraciones con muestras biologicas

Por qu colorear las muestras?

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal (100 u- 105nm) que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el campo microscpico , el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.

IMPORTANCIA
Gracias a las tinciones podemos examinar mejor la forma y el tamao de los microorganismos lo cual es tarea difcil en una observacin directa. Nos permite adems, por medio de tinciones especiales, estudiar diferentes estructuras de las clulas tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas

COLORANTE: DEFINICIN
Son compuestos orgnicos cuyos iones tienen alguna afinidad especfica por fijarse a algn componente de la clula.

Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste Cristal Violeta COLORANTES DE MAYOR APLICACIN Eosina, wright Son derivados de las anilinas Fucsina Bsica Actan mejor en presencia de mordientes Safranina (aumentan la permeabilidad de la pared y membrana, Azul de Metileno penetran a la celula por fenomeons osmoticos) Verde de Malaquita

COLORANTES Y COLORACIONES
TIPOS DE COLORANTES
Pueden ser

CATINICOS o Bsicos
Tienen carga (+) Penetran interior celular Ej.: Azul de Metileno Cristal Violeta Safranina Fucsina Bsica

ANINICOS o cidos
Tienen carga (-) No penetran interior celular Tincin negativa Ej.: Nigrosina Eosina Fucsina cida Rosa de Bengala

LIPOSOLUBLES

Se mezclan con lpidos celulares Ej.: Negro Sudn

COLORACIONES
Son tcnicas que permiten

OBSERVAR MICROORGANISMOS
Qumicamente es la unin de las molculas del colorante (iones) con los elementos constituyentes de la clula

Depende de carga de clula y colorante

TIPOS DE TINCIONES
Pueden ser

SIMPLES
Un solo colorante Tie o no la clula Ej.: Azul de Metileno Safranina Nigrosina

DIFERENCIALES
Ms de un colorante Clulas con diferente composicin qumica Importancia taxonmica Ej.: Tincin GRAM Tincin AAR

SELECTIVAS
Uno o ms colorantes Estructuras celulares con distinta composicin qumica Ej.: Tincin de Esporas Tincin de Flagelos Tincin de Paredes Cel. Tincin de Corpsculos Metacromticos

TIPOS DE PREPARADOS PARA OBSERVACIONES MICROSCPICAS Preparados en fresco ("entre porta y cubre")
Muestra

Tomar la muestra con el asa de siembra o un gotero

Porta objeto

Enfocar con el objetivo de 10x o 40x

Son preferibles en las situaciones siguientes: La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y tien (espirilos), deben, por lo tanto, examinarse en estado vivo. Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la divisin celular Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

Observacin microscpica en fresco

1. Observacin en fresco : (SSF) Parsitos : Trofozoitos, larvas.

2. Observacin en fresco Hongos: Levaduras

3. Observacin en fresco con modificaciones Hongos NaOH 10% (hifas)

PREPARADOS EN SECO PARA COLORACION

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias (Las clulas son visibles mas claramente despus de teidas) Diferenciacin de microbios entre clulas de especie diferentes y dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).

Los pasos esenciales para un preparado en seco (fijo) y teido son:

a) Frotis o pelcula (extensin)

b) La fijacin c) Coloracin.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin)

Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

b) La fijacin: Es el proceso por el cual se conservan y fijan en su
Normalmente, durante la fijacin se mata al microorganismos ( coagula las sustancias proteicas) y se fija firmemente al portaobjetos.

posicin las estructuras internas y externas de las clulas de los microorganismos.

TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH) FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter)

CON CALOR

Metanol

FROTIS FIJADO

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

c) Coloracin. Simple o compuesta
Nos permite distinguir formas de los microorganismos y diferenciar entre tipos de microorganismos

TINCIN DE GRAM

Tincin de Gram (Componentes)

Cristal-violeta

Alcohol-acetona

Lugol

Safranina

Lunes Tincin

L-3.2.3.- Tincin de Gram (Procedimiento)

Frotis y fijacin

MUESTRA

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.- Cubrir la preparacin con Cristal Violeta 1

2.- Aadir Lugol (mordiente) durante 1

3.- Decolorar con Alcohol 96 hasta que no suelte colorante

4.- Lavar con agua

5.- Teir con Safranina 1

6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio con objetivo de 100x y aceite de inmersion

Coloracin Gram

Diferencias en las estructura de la pared celular en Gram Positivas y Gram Negativas

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas Cocos Gram-positivos

Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos.

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Espiralados: espiroquetas

PARTE EXPERIMENTAL Practica No 01

III. MATERIALES - Microscopio ptico - Safranina - Pipetas pasteur - Eosina - Goteros - Violeta de genciana - Agua destilada - Wright - Mechero - Fucsina - Azul de metileno - Verde de Janus - Giemsa - Hematoxilina IV. PROCEDIMIENTO PREPARADOS EN FRESCO 1. Colocar una gota de agua estancada en una lamina 2. colocar una laminilla cubreobjetos 3. observar

PREPARADOS EN SECO 1. Colocar la muestra en la lamina 2. Realizar la coloracin respectiva 3. Secar al medio ambiente 4. observa la microscopio

III. MATERIALES
Encontrars en el laboratorio: Microscopio ptico - Alcohol acetona Soluciones para la tincin: - Fucsina o safranina - Violeta de genciana - Aceite de inmersin - Lugol - Mechero de alcohol IV. PROCEDIMIENTO La tincin Gram se realizar sobre las muestras de yogur, sarro dentario y vinagre, que los alumnos traern

Referencias Bibliogrficas
Microbiologa de Brock, 2008 BCM, DE ROBERTIS, 2009

Hay alguna pregunta? o de lo contrario

seguimos con la practica !!!