CURSO: ANALISIS POR INSTRUMENTACION

TEMA:

En este artculo se presenta el desarrollo de dos mtodos de anlisis para la determinacin de los antibiticos ciprofloxacina y norfloxacina, mediante espectrofotometra de absorcin visible. La optimizacin de los parmetros experimentales, fue realizada siguiendo metodologa multivariante de superficie de respuesta y comparada con el mtodo clsico univariante

Los mtodos estn basados en la reaccin entre los analitos y el verde de bromocresol en medio acuoso cido, para formar pares inicos extrables con cloroformo. Los pares inicos exhiben una absorcin mxima a 420,0 nm. La ley de Beer fue obedecida en el intervalo de concentracin de 2,0-40,0 g/mL en el caso de la ciprofloxacina y entre 2,080,0 g/mL para la norfloxacina.

Los mtodos desarrollados fueron aplicados para la determinacin de ciprofloxacina y norfloxacina en tabletas y en soluciones intravenosas

Las fluoroquinolonas son antibiticos sintticos derivados de la quinoleina En los ltimos aos, se han incrementado considerablemente sus usos tanto en medicina humana, como en veterinaria debido a que poseen un amplio espectro de actividad antibacteriana La ciprofloxacina y la norfloxacina son fluoroquinolonas de segunda generacin que exhiben un amplio espectro frente a bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.

actan sobre los microorganismos sensibles, inhibiendo la replicacin del ADN de las bacterias. Estos antibiticos estn indicados en el tratamiento de infecciones respiratorias, oftlmicas, genitourinarias y gastrointestinales, entre otras

la mayora de stos mtodos de anlisis de ciprofloxacina y norfloxacina son costosos y no estn disponibles para el control de calidad en muchos laboratorios. El presente artculo describe el desarrollo, optimizacin y validacin de dos mtodos espectrofotomtricos en la regin visible; para la determinacin de ciprofloxacina y norfloxacina en productos farmacuticos.

Los mtodos estn basados en la formacin de los pares inicos ciprofloxacina-verde de bromocresol y norfloxacinaverde de bromocresol. La optimizacin de los parmetros experimentales de cada uno de los mtodos, se realiz siguiendo las metodologas clsica univariante y de superficie de respuesta

Las lecturas de absorbancias se realizaron en un espectrofotmetro UVVisible Agilent, modelo 8453 con arreglo de diodos.

Se emple agua destilada-desionizada para la preparacin de todas las disoluciones. Las soluciones madre de 1.000 g/mL de ciprofloxacina y norfloxacina se prepararon disolviendo 100 mg de los reactivos slidos en agua desionizada y en cido actico 0,01 M respectivamente, y aforando hasta 100 mL. Las soluciones se mantuvieron estables durante cuatro semanas, al ser guardadas en la oscuridad a 4C en un frasco de vidrio color mbar. Las soluciones de trabajo fueron preparadas diariamente por dilucin de las soluciones madre. La disolucin del verde de bromocresol (VBC) 1.43 103M se prepar pesando 1,00 g del indicador (Riedel-DeHan), aadiendo agua desionizada y NaOH 6 M gota a gota hasta disolucin total; luego se enras la solucin hasta 1000 mL con agua desionizada. Los dems reactivos utilizados fueron de grado analtico. Se emple Statgraphics versin 3.1 para el anlisis de los diseos de superficie de respuesta y los anlisis estadsticos.

En un embudo de separacin de 50,0 mL se colocaron 2,2 mL de solucin de verde de bromocresol 1.43 103M, 5,0 mL de muestra o de solucin patrn de ciprofloxacina, 2,0 mL de solucin amortiguadora Britton-Robinson (BR) 0,1 M de pH 2,8 y 4,0 mL de CHCl3; seguidamente, se agit por 90 segundos a 1.800 rpm empleando una varilla de vidrio acoplada a un motor elctrico y se dej en reposo para separar las fases. La extraccin se repiti 2 veces ms utilizando alcuotas de 3,0 mL de CHCl3. Los extractos se mezclaron y se obtuvo su absorbancia a 420 nm empleando el blanco como referencia. El blanco analtico fue preparado siguiendo el procedimiento anterior pero sin la presencia del analito. En el caso de norfloxacina, el procedimiento aplicado fue igual al descrito anteriormente slo que se emplearon 2,5 mL del amortiguador Britton-Robinson 0,1 M de pH 2,3 y 2,5 mL de solucin de verde de bromocresol 1.43 103 M.

A las muestras en tabletas, se les determin su peso antes de pulverizarlas minuciosamente en un mortero de porcelana. Para preparar 100 mL de una solucin con una concentracin de 500 g/mL en el compuesto activo, se pes la cantidad necesaria de muestra pulverizada. Para disolver la muestra, se coloc en un beaker con suficiente agua desionizada (para ciprofloxacina) o cido actico 0,01M(en el caso de norfloxacina) con agitacin magntica durante 30 minutos. La mezcla resultante se verti en un baln aforado de 100 mL y se complet hasta la marca del aforo con agua desionizada. Seguidamente, se filtr con un papel de filtro Whatman 42 en un sistema de filtracin al vaco.

En el caso de la muestra para inyecciones intravenosas, simplemente se tom el volumen necesario para preparar 100 mL de una disolucin de 200 g/mL en el compuesto activo, se verti en un baln aforado y se complet con agua desionizada.

A valores de pH cidos la mayora de las fluoroquinolonas, tales como la norfloxacina y la ciprofloxacina se encuentran cargadas positivamente, debido a la protonacin del nitrgeno bsico ubicado en el grupo piperazinilo. Asimismo, los indicadores sulfoftaleinicos se encuentran bsicamente en forma aninica a pH > 2,0 debido al carcter de cido fuerte del grupo sulfnico. se realizaron ensayos preliminares con algunos indicadores sulfoftalenicos que por su estructura presentan la probabilidad de formar pares inicos con la ciprofloxacina y la norfloxacina a pH cido como son: rojo de clorofenol, purpura de metacresol, verde de bromocresol, azul de timol y rojo de fenol. Bajo esas condiciones se encontr que en medio acuoso estas fluoroquinolonas forman pares inicos con el verde de bromocresol; que debido a sus neutralidades elctricas pueden ser extrados con un solvente orgnico no polar, tal como el CHCl3. La formacin y extraccin de los pares inicos pueden representarse como sigue:

donde HR+ y VBC representan a las fluoroquinolonas y al verde de bromocresol respectivamente

Para la determinacin de ciprofloxacina y norfloxacina en el extracto orgnico por espectrofotometra visible, fue necesario conocer previamente la longitud de onda de mxima absorcin, que presentan los pares inicos en cloroformo, formados previamente en un medio acuoso a diferentes valores de pH (3,0-4,0 y 5,0).

Para los ensayos se utilizaron soluciones patrn de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 g/mL y de VBC 1,43 103 M.
Se colocaron alcuotas de 5,0 mL de disoluciones de cada fluoroquinolona por separado en embudos de separacin, se les adicionaron 2,0 mL de VBC, 2,5 mL de amortiguador y 10,0 mL de CHCl3; seguidamente, se agitaron por 5 minutos y se dejaron en reposo hasta separar la fase orgnica de la acuosa. El procedimiento se repiti para los diferentes pH.

El extracto orgnico en cada caso se coloc en una celda de vidrio, y empleando un espectrofotmetro UV-Visible se realiz un barrido de longitud de onda entre 340 y 500 nm. Los espectros resultantes para ambos pares inicos mostraron una absorbancia mxima a 420 nm. El espectro de absorcin y la longitud de onda de mxima absorcin de los pares inicos formados, no variaron con los distintos pH estudiados. Estos resultados indican que solo se form un tipo de par inico y que el mx. es independiente del pH. Para los siguientes estudios se emple una longitud de onda de 420 nm.

se variaron los valores de un factor mientras que se mantuvieron constantes el resto de los factores experimentales. Siguiendo esa metodologa de optimizacin,

se estudi la influencia del tipo de disolucin amortiguadora empleando 2,5 mL de los sistemas cido actico/acetato de sodio, cido ftlico/ ftalato cido de potasio y BrittonRobinson a concentraciones 0,1 M. El pH se fij a 3,00; mientras que el resto de los factores se mantuvieron a los mismos valores utilizados en el procedimiento descrito para la seleccin de la lmx. Se obtuvieron los mayores valores de absorbancia cuando se utiliz el sistema Britton-Robinson 0,1 M. En consecuencia este regulador se emple para el resto de las experiencias. Al avaluar la influencia del pH sobre la absorbancia de los pares inicos en el intervalo de 2,40 a 4,55, se encontr que valores de 3,20 y 2,70 maximizan las absorbancias de los pares inicos de ciprofloxacina y norfloxacina respectivamente; por lo tanto, se fijaron estos valores de pH para continuar la optimizacin univariante. El efecto del volumen de la disolucin amortiguadora BR fue examinado entre 0,5 y 3,0 mL. Los resultados obtenidos mostraron seales mximas de absorbancia al utilizar 2,0 mL en el caso de ciprofloxacina y 1,0 mL para norfloxacina. Estos volmenes se fijaron en las siguientes experiencias de optimizacin. La influencia del volumen del VBC 1,43 103 M, fue evaluada mediante ensayos con 0,5 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 y 5,0 mL. Se encontr que 3,0 y 2,0 mL generan las mayores absorbancias para ciprofloxacina y norfloxacina, respectivamente. En la optimizacin de la secuencia de agregado de los reactivos, se vari en seis experimentos el orden en que fueron mezclados; encontrndose las mximas absorbancias con las secuencias: VBC-ciprofloxacina- solucin BR y norfloxacina-VBCsolucin BR.

Para evaluar la eficiencia de extraccin de los pares inicos, se compararon los efectos de realizar una extraccin con 10,0 mL de CHCl3, dos extracciones con 5,0 ml de CHCl3 y tres extracciones empleando alcuotas de 4,0-3,0 y 3,0 mL de CHCl3. El tiempo de agitacin fue fijado en 5 minutos y el resto de las condiciones experimentales utilizadas fueron las seleccionadas como ptimas. A partir de los resultados obtenidos, se seleccion la extraccin triple por favorecer la respuesta analtica. La influencia del tiempo de agitacin de las fases acuosa y orgnica sobre la transferencia de los pares inicos se examin al realizar mediciones de absorbancia de los extractos empleando tiempos de agitacin de 45, 90, 180, 540 y 720 s. Se encontr que la absorbancia es constante a partir de los 90 s, razn por la cual se fij este valor como tiempo de agitacin. Para determinar la influencia del efecto salino sobre la solubilidad de los pares inicos en los extractos orgnicos se realizaron cinco pruebas en los cuales se aadi entre 0 y 3,0 g de NaCl a la fase acuosa. Se observ una disminucin de la absorbancia con el incremento de la sal agregada. En consecuencia se excluy aplicar el efecto salino. Las condiciones ptimas obtenidas se resumen en la Tabla 1.

se emple inicialmente un diseo factorial de superficie de respuesta Box-Behnken utilizando los 3 factores que segn la metodologa univariante influyen principalmente sobre la respuesta del sistema analtico: pH, volumen del amortiguador BR y volumen del VBC. Cada factor fue estudiado simultneamente a 3 distintos niveles experimentales. Para llevar a cabo los diseos experimentales, se utilizaron disoluciones patrn de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 g/mL, de la cual se tomaron 5,0 mL para cada experimento, y se agregaron directamente en los embudos de separacin junto con el indicador y el amortiguador en el orden previamente establecido. El resto de las variables que pueden afectar el proceso analtico, se fijaron a los valores previamente optimizados y reportados en la Tabla 1. Seguidamente, se realiz la extraccin con el CHCl3 y se procedi a obtener la lectura de absorbancia en el espectrofotmetro. El punto central del diseo Box-Behnken fue repetido 4 veces para estimar la repetibilidad experimental. El orden de los experimentos fue al azar. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2.

Se aplic sobre los resultados experimentales el anlisis de la varianza, encontrndose en ambos casos que el volumen del amortiguador BR no es un factor significativo que afecte la respuesta analtica (p > 0,05). En consecuencia, el volumen del amortiguador BR fue excluido de la optimizacin multivariante. El estudio de los polinomios de segundo orden que relacionan la absorbancia con los factores experimentales mostr la existencia de puntos de silla [15]. Por consiguiente, se calcul el camino de mxima pendiente para los dos puntos de mxima absorbancia y a partir de los resultados obtenidos se procedi a utilizar diseos Doehlert con los factores pH y volumen de VBC centrados en la regin experimental, donde se esperaba las mximas respuestas de los sistemas analticos.

Para llevar a cabo los diseos experimentales Doehlert, se utilizaron 5,0 mL de disoluciones patrn de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 g/mL. Para el caso de ciprofloxacina, el pH fue variado entre 1,00 y 3,00; mientras que el volumen de VBC se estudi entre 0,5 y 4,5 mL. Para el diseo Doehlert de norfloxacina, se estudi el pH en

el intervalo entre 1,0 y 3,6; mientras que el volumen del VBC se evalu entre 0,5 y 5,5 mL. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3.

Se aplic sobre los resultados el anlisis de la varianza, encontrndose en ambas situaciones que el volumen del VBC y el pH son factores significativos que afectan la respuesta analtica (P < 0,05).

Para el caso de la norfloxacina, se obtuvo un valor de 99,5% para el R2 de la ecuacin que describe la respuesta experimental; lo que indica un excelente ajuste con el modelo. La ecuacin que describe la respuesta analtica es:

La superficie de respuesta se presenta en la Figura 2 observndose un mximo relativo para la absorbancia. Para confirmar la existencia del mximo relativo, se procedi a aplicar el criterio de Lagrange sobre la ecuacin que describe la respuesta experimental encontrndose un mximo relativo ( D1 = 0,278; D2 = 0,026) a pH = 2,48 y 4,4 mL de VBC.

En el caso de la ciprofloxacina la ecuacin que describe la respuesta analtica es:

El R2 para esta ecuacin fue de 99,2% indicando que el modelo cuadrtico parece ser adecuado para explicar los datos experimentales. La superficie de respuesta se presenta en la Figura 3. Se confirm la localizacin del mximo relativo mediante la aplicacin del criterio de Lagrange encontrndose el mismo a valores de pH = 2,3 y 2,3 mL de VBC.

Para comparar los resultados de las metodologas utilizadas en la optimizacin de los mtodos de anlisis de ciprofloxacina y norfloxacina, se hizo una prueba midiendo la absorbancia de disoluciones de 10,0 g/mL de ciprofloxacina y norfloxacina obtenidas a las condiciones ptimas de las metodologas univariante y multivariante. Los resultados se presentan en la Tabla 4, donde se evidencian mayores valores de absorbancia

trabajando a las condiciones ptimas obtenidas en la optimizacin multivariante de superficie de respuesta.

Las curvas de calibracin fueron obtenidas aplicando el procedimiento optimizado descrito en la parte experimental. Para ciprofloxacina la curva de calibracin result ser lineal en el intervalo entre 2,040,0 g/mL; mientras que para norfloxacina se obtuvo linealidad entre 2,0-80,0 g/mL. Para el clculo de los lmites de deteccin y de cuantificacin, se emple el criterio de tres y diez veces respectivamente, el valor de la desviacin estndar correspondiente al blanco analtico. Los lmites de deteccin encontrados fueron 0,45 y 0,55 g/mL para ciprofloxacina y norfloxacina respectivamente. La precisin de los mtodos analticos se evalu a partir de la reproducibilidad obtenida para disoluciones de tres distintas concentraciones, preparadas por duplicado diariamente durante un perodo de cinco das. Se obtuvieron desviaciones estndar relativas (DER) de 0,40-1,20 y 3,20% para concentraciones de 60,0-30,0 y 2,0 g/mL de norfloxacina. En el caso de ciprofloxacina, se obtuvieron DER de 0,90-1,40 y 5,88 % para concentraciones de 20,010,0 y 2,0 g/mL. Los parmetros analticos se presentan en la Tabla 5.

mtodos analticos desarrollados para la determinacin de ciprofloxacina y norfloxacina mediante espectrofotometra de absorcin visible, se aplicaron a muestras de medicamentos comerciales. Para estas muestras se compararon las pendientes de las curvas de adicin de patrn con las pendientes de las curvas de calibracin,

encontrndose que no existe diferencias significativas entre las pendientes de los calibrados, por lo tanto no existe evidencia de la presencia de error sistemtico

proporcional originado por la matriz de las muestras evaluadas, razn por la cual; las muestras pueden ser directamente cuantificadas empleando las curvas de calibracin. La validacin de los mtodos propuestos para las muestras estudiadas fue realizada mediante un estudio de recuperacin, aplicando la prueba de la t-student. En todos los casos los valores de p son mayores de 0,05, por lo cual la hiptesis nula puede ser aceptada y los porcentajes de recuperacin no difieren significativamente del 100% (Tabla 6).

El mtodo propuesto fue aplicado para determinar ciprofloxacina y norfloxacina en muestras de medicamentos de seis diferentes laboratorios farmacuticos, disponibles en Venezuela. Para realizar esta experiencia las muestras fueron previamente tratadas segn lo descrito en la seccin experimental. La cuantificacin de los mg de ciprofloxacina y norfloxacina presentes en cada muestra se realiz a partir de la curva de calibracin. Los resultados obtenidos, se presentan en la Tabla 7 junto con el contenido del antibitico declarado en cada muestra.

Los resultados obtenidos por el mtodo propuesto en las presentaciones farmacuticas fueron comparados con los de un mtodo por electroforesis capilar. La aplicacin de la

prueba de medias (t-student), demostr no existir evidencias de diferencias significativas entre los resultados de los mtodos (p > 0,05).

Se han desarrollado dos nuevos mtodos de anlisis de

ciprofloxacina y norfloxacina mediante espectrofotometra de absorcin visible, basados en la formacin de pares inicos con el verde de bromocresol. Los mtodos fueron optimizados empleando metodologa de superficie de respuesta encontrndose condiciones ptimas de mayor sensibilidad a las halladas con la optimizacin clsica.

Los mtodos fueron validados y aplicados sobre muestras de presentaciones farmacuticas y representan una alternativa econmica y sencilla que brindan adecuada exactitud y precisin en los anlisis.