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Citometria: Anlise quantitativa de parmetros celulares (clulas, ncleos, cromossomas, mitocndrias, etc)
Princpio:
Fazer passar as partculas em suspenso, de uma forma alinhada, por um feixe de luz A interaco das partculas com o feixe gera sinais que so captados por detectores apropriados A informao produzida pode ser gerada: Pela disperso do feixe de luz Pela luz emitida por fluorocromos aps excitao pelo feixe de luz
Fludos
Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifcio central do fluxo (50-300 m)
As partculas fluem no centro, no se misturando com o restante lquido de envolvimento A injeco da amostra em fluxo laminar e a regulao da presso so conseguidas atravs: - Presso Diferencial - Velocidade de Fluxo - Fluxo Contnuo
Cmara de Fluxo
Agulha de injeco Lquido de
envolvimento
Laser
Disperso laser
Ponto de Hidrofocagem
ptica
Fontes de iluminao:
Lmpadas de Mercrio
Lasers
Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromtico. Produz um feixe de luz coerente
Laser
Laser
Sensor de FS
Sensor SS 900
Disperso da Fluorescncia
A fluorescncia emitida detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado A especificidade da deteco de cada sensor controlada pela seleco do comprimento de onda, atravs de uma conjugao de filtros e de espelhos.
Laser
Sensor de FS
Tipos de fluorocromos
Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)
Fluorochrome FITC Cy3 R-PE (PE) Pe-Cy5 (TC1) PerCP (BD2) PerCP/Cy5.5 (BD) Texas Red APC Cy5 Laser (nm) 488 488 488 488 488 488 595 633, 635 633, 635 Emission (nm) 525 565 575 667 675 695 615 660 667
457
488
514
610 632
600 nm 700 nm
500 nm
Texas Red
PI
Ethidium PE
FITC
Fonte de Luz
Luz Transmitida
Luz Reflecti da
Cmara de Fluxo
Filtros Dicricos
PMT
3
PMT
2
Filtros PMTBandpass
1
Fotosensores
Laser
Electrnica
Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores que traduzido num histograma ou scatter plot
O que pode ento dizer um Citmetro de fluxo de uma clula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescncia relativa. (FL1, FL2, FL3, Complexidade Antgenos celulares Tamanho Metabolismos Enzimas
Receptores
DNA Citocinas
Aplicaes
Aplicaes diversas
Deteco de apoptose
Permeabilidade membranar
Mudanas do contedo
de DNA Estudos enzimticos funcionais
0 200
G0/G1 S
G2/M
1000
Resistncia a frmacos
Granulcitos
Monocitos
Linfocitos
FACS Fluorescence-activated cell sorter Permite separar subpopulaes de linfcitos com base nas diferentes protenas expressas superfcie (B, TCD4, TCD8) Cada tipo celular marcado com um anticorpo especfico que se encontra acoplado a um corante fluorescente. O citmetro de fluxo detecta e conta individualmente as clulas que passam atravs do laser
488 nm laser
Sensor Fs
Detectores de Fluorescncias
Placas Carregadas
No exemplo, uma populao celular mista marcada com 2 anticorpos especficos de antignios de superfcie : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A so marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a populao introduzida na camara de FACS. As clulas vo ser expelidas pelo nozzle gerando microgotas, cada contendo uma nica clula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga elctrica-excitao do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescncia emitida e detectada no computador. Esta carga elctrica dirigida por 2 placas de defleco faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populaes com perfis diferentesPopulao A e Populao B. No computador cada dot representa uma clula, e as clulas que caem esquerda inferior do quadrante do scatter so consideradas background- no reagiram c/ anti-A ou anti-B.
Aplicaes clnicas: so mltiplas principalmente na deteco de antignios target nas clulas sanguneas
Classificao de leucemias Deteco de HIV Marcadores tumorais Na previso da evoluo do curso de doena Deteco microbiolgica : bactrias, fungos,parasitas e vrus Deteco e quantificao de ac.nucleicos virais e antignios virais Teste de susceptibilidade a drogas