INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA CLNICA

Microbiologa Clnica: Tema 1

MICROBIOLOGA CLNICA

Diagnsticos etiolgicos preliminares. Utilizacin racional de las tcnicas diagnsticas. Correcta obtencin de muestras. Fundamentos de tcnicas y mtodos diagnsticos. Evaluacin correcta de los resultados.

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MISIN DE UN SERVICIO DE MICROBIOLOGA

Informacin necesaria para tomar una decisin clnica y adopcin de medidas preventivas. Normas de obtencin de muestras para un correcto diagnstico microbiolgico. Identificacin de microorganismos. Estudio de sensibilidad a antimicrobianos. Facilitar recepcin de muestras. Envio rpido de resultados. Valoracin de las tcnicas diagnsticas. Puesta al da de los conocimientos.
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FASES DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

Fase preanaltica:

Proveer informacin sobre conservacin de las muestras. Interpretacin de los resultado. Utilizacin de la prueba.
Producir resultados de calidad.

recogida/transporte

Fase anltica:

Fase postanaltica:

Revisar exactitud del resultado. Evaluar la relevancia clnica.

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NO PIDAS NADA QUE SI ES POSITIVO, NO SEPAS QUE HACER

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UTILIZACIN DE UNA TCNICA DIAGNSTICA

Valoracin previa de que un paciente presente o no la enfermedad. Planteamiento inicial antes de solicitar una prueba diagnstica de cual va a ser nuestra actitud y decisin despus del resultado de la misma. Conocimiento de la eficacia de una prueba a utilizar.
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NORMAS GENERALES PARA LA TOMA DE MUESTRAS CLNICAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS EE.II. La muestra debe ser representativa del cuadro clnico. Debe obtenerse antes de la instauracin del tratamiento antimicrobiano. En determinados procesos infecciosos (p. ej. septicemia) el momento de la obtencin puede ser importante. Debe transportarse rpida y adecuadamente al laboratorio. Debe rotularse correctamente y venir acompaada de una orientacin o juicio clnico que permita realizar las tcnicas adecuadas al microorganismo sospechado.
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MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO: TIPOS

Muestras de obtencin directa de localizaciones estriles. Alta rentabilidad. Muestras de obtencin indirecta de localizaciones estriles. Rentabilidad dependiente de la flora saprofita. Muestras obtenidas de localizaciones con flora microbiana. Muestras para el diagnstico virolgico. Alta rentabilidad por ausencia de flora viral.
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PRINCIPALES MUESTRAS CLNICAS PARA AISLAMIENTO DE VIRUS

Cuadro clnico Meningitis y Encefalitis V. de la parotiditis Enterovirus Herpes simple Respiratorios Gripe y V. parainfluenzae Adenovirus Exudado farngeo LCR Orina Heces Vesculas Otros

(++++) (+++) (+/-)/(++++) (++++) (++++)

(++) (++) (+/-) (-) (-)

(+) (-) (-) (-) (-)

(-) (+++) (-) (-) (+++)

(-) (-) (+) (-) (-)

Biopsia (++++)

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MTODOS DIAGNSTICOS

Mtodos directos:
Visualizacin del microorganismo. Aislamiento del microorganismo. Deteccin de antgenos. Deteccin de metabolitos, componentes y cidos nucleicos.

Mtodos indirectos:
Deteccin de anticuerpos: D. Serolgico. Deteccin Respuesta Inmune Celular.

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PRINCIPALES TCNICAS MICROSCPICAS USADAS PARA LA VISUALIZACIN DE MICROORGANISMOS EN MUESTRAS CLNICAS

Tcnica
Microscopa ptica: Fresco Microscopa ptica: Tincin Microscopa campo oscuro Microscopa contraste de fases Microscopa luz ultravioleta Microscopa electrnica

Utilidad
Hongos, parsitos y virus (efecto citoptico) Bacterias, hongos y parsitos. Treponemas (chancro sifiltico) Hongos y parsitos (poca utilidad diagnstica) Inmunofluorescencia(bacterias, hongos y parsitos. Virus (poca utilidad diagnstica)

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VISUALIZACIN DEL MICROORGANISMO

Microscopa: diferentes tipos Examen en fresco Tinciones:

Tincin de Gram Tincin de Ziehl-Neelsen

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TINCIN DE GRAM: APLICACIONES

LCR y otros fluidos estriles Esputo Exudado uretral Exudado vaginal Exudados inflamatorios Orina

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INFORMACIN QUE APORTA UNA TINCIN DE GRAM EN MUESTRAS CLNICAS (EXUDADOS INFLAMATORIOS Y FLUIDOS ESTRILES)

Permite evaluar la calidad de la muestra. Presencia de:

Clulas inflamatorias muestra adecuada Clulas epiteliales posible contaminacin

Permite visualizar la morfologa, su disposicin y localizacin intra o extracelular de las bacerias Permite diferencias bacterias Gram + y Gram Permite detectar la presencia de flora contaminante Permite cuantificar el nmero de bacterias
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AISLAMIENTO DEL MICRORGANISMO

Cultivo en medios artificiales:

Nutritivos Selectivos Diferenciales

Cultivos celulares:
C. de rgano C. secundarios

C. primarios Lnea celular

Inoculacin animal
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CARACTERSTICAS UTILIZADAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

Crecimiento en distintos medios de cultivo Caractersticas bioqumicas Produccin de toxinas Estructura antignica Estructura genmica

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DETECCIN DIRECTA DE ANTGENOS MEDIANTE TCNICAS DE AGLUTINACIN

Antgenos bacterianos
H.influenzae S.pneumoniae N.meningitidis

Antgenos fngicos

C.neoformans

Antgenos vricos
Rotavirus Adenovirus

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DETECCIN DIRECTA DE ANTGENOS MEDIANTE TCNICAS DE ELISA

Antgenos bacterianos

Antgenos vricos

S.pyogenes L.pneumophila C.trachomatis C.difficile (toxina)

Adenovirus Herpesvirus V.respiratorio sincitial Rotavirus

G.lamblia C.parvum E.histolytica

Antgenos fngicos

Antgenos parasitarios

C.neoformans A.fumigatus

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VENTAJAS DE LAS TCNICAS DE AMPLIFICACIN

Sensibilidad extrema (detectan hasta 1-10 microorganismos) Alta especificidad (diseo de cebadores en funcin de secuencias especficas del microorganismo) Rapidez de realizacin (mximo 24 horas) Deteccin de microorganismos viables y no viables Automatizables
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INCONVENIENTES DE LAS TCNICAS DE AMPLIFICACIN

Posibles falsos positivos Acondicionamiento especial del laboratorio Alto nivel de entrenamiento del personal Elevado coste inicial

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VENTAJAS DE LA DETECCIN RPIDA DE LA RESISTENCIA MEDIANTE TCNICAS MOLECULARES

Reducir el tiempo requerido para instauracin tratamiento definitivo Evitar tratamientos incorrectos Deteccin de portadores infectados con microorganismos resistentes Reduccin de costes y tiempo de estancias hospitalarias
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INCONVENIENTES DE LAS TCNICAS MOLECULARES DEN LA DETECCIN DE RESISTENCIAS

Desconocimiento de la secuencia del gen/es implicados Casos con mltiples genes implicados Diferente grado de expresin de los genes en condiciones ambientales diferentes Los microorganismos de la flora saprofita poseen tambin genes de resistencia

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DIAGNSTICO MEDIANTE BIOCHIPS-MICROARRAYS

Se fundamenta en una tcnica de afinidad utilizando sondas de cidos nucleicos para hibridacin soportadas en un chip. Es una aplicacin de la Bioinformtica. Un microarray es una herramienta para analizar la expresin de los genes que consiste en una membrana o vidrio que contiene adheridos muchos genes dispuestos de una forma organizada predeterminada.

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Un esperimento con Microarrais de ADN

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DETERMINACIONES SEROLGICAS BASADAS EN LA REACCIN PRIMARIA

Inmunofluorescencia
Directa Indirecta Mediada por complemento

Radioinmunoanlisis Enzimainmunoanlisis
ELISA tipo1 ELISA tipo2 ELISA tipo3 (captura)

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DETERMINACIONES SEROLGICAS BASADAS EN LA REACCIN SECUNDARIA

Precipitacin
Medio slido Medio lquido

Aglutinacin
Directa Hemaglutinacin Ltex

Fijacin de complemento
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DETECCIN DE RESPUESTA INMUNE CELULAR

Pruebas cutneas Activacin linfocitaria Inhibicin de los macrfagos Linfotoxicidad

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PARMETROS DE UNA TCNICA DIAGNSTICA

Sensibilidad Especificidad V.P.Positivo V.P.Negativo Eficiencia Relevancia clnica

Verdadero positivo Verdadero negativo Falso positivo Falso negativo

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SENSIBILIDAD (S)
Verdadero positivo (VP)

S=

X 100

(VP) + Falso negativo (FN)

ESPECIFICIDAD (E)
E= Verdadero negativo (VN) (VN) + Falso positivo (FP)
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X 100

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EFICIENCIA

VP + VN
Total X 100

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VALOR PREDICTIVO POSITIVO (VPP)

(VP) VPP =

(VP) + (FP)

X 100

VALOR PREDICTIVO NEGATIVO (VPN)

VPN = (VN)

(VN) + (FN)
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X 100
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VALOR PREDICTIVO DE UNA PRUEBA CON UN 95% DE S. Y UN 95% DE E. VARIACIONES EN FUNCIN DE LA PREVALENCIA DE LA ENFERMEDAD

Prev. Enfermedad (%) 1 2 5 10 15 20 25 50

Valor Predictivo (%) 161 279 50 679 77 826 864 95

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FLORA MICROBIANA NORMAL IMPORTANCIA DE SU ESTUDIO

Deteccin de alteraciones cualitativas: disbacteriosis. Detectar alteraciones cuantitativas. Conocer microorganismos que pueden infectar zonas determinadas. Conocer origen y significacin de determinados aislamientos.

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TIPOS DE FLORA MICROBIANA

Flora

residente. Flora transitoria.

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FUNCIONES FLORA MICROBIANA VENTAJAS

Efecto sobre la digestin/nutricin. Biotransformacin de cidos biliares y colesterol Produccin de nutrientes y vitaminas: K, E, B12, cido flico. Interferencia microbiana. Estimulacin de los mecanismos de defensa.

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FUNCIONES FLORA MICROBIANA INCONVENIENTES

Facilitar colonizacin de otras especies. Infecciones endgenas. Reservorio de resistencias a antimicrobianos. Papel de la flora en pacientes hospitalizados.

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FLORA MICROBIANA DE LA PIEL

S. epidermidis y otros ECN. Propionibacterium spp. Clostridium spp. Corynebacterium spp. Levaduras.

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FLORA MICROBIANA NASOFARINGE Y OROFARINGE

Fosas nasales:

Flora cutnea + S. aureus (25-30%) Flora oral+:

Nasofaringe:

N.meningitidis S.pneumoniae H.influenzae M.catharralis

Orofaringe:

Flora nasofarngea +:

Estreptococos alfa hemolticos Neisseria saprofitas

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FLORA MICROBIANA CAVIDAD ORAL (I)

Cocos Gram positivos:

Estreptococos alfa y no hemolticos (30-50% del total) S. mutans y S. sanguis: dientes S. Salivarius: lengua

Cocos Gram negativos:

Veillonella spp. (Actualmente se considera que existen 600 especies diferentes)

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FLORA MICROBIANA CONJUNTIVA

S. epidermidis (50-90%) Corynebacterium spp (20-75%) Propionibacterium spp (50%)

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FLORA MICROBIANA DEL APARATO DIGESTIVO

Esfago:

Flora deglutida
Casi estril en condiciones normales (pH) 103 (duodeno) a 108 bac/ml (ileon) Predominan Gram +: enterococos, difteroides, Lactobacillus spp. Al descender R a bilis: enterococos, bacteroides y enterobacterias (Proteus)I
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Estmago:

Intestino delgado:

FLORA MICROBIANA INTESTINO GRUESO

Nmero: 108 1011 bac/ml a 1012 ml/heces Efecto de la dieta Composicin:

96-99% anaerobios:

Bacteriodes spp (grupo fragilis) Fusobacterium spp Clostridium spp

Enterococos Enterobacterias ( E. Coli)

1-4% aerobios facultativos:

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GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL INTESTINO GRUESO (I) BACILOS ANAEROBIOS

Gram neg.:

Bacteroides Fusobacterium Porphyromonas Leptotrichia Butyrivibrio Campylobacter Desulfomonas Succinomonas Succinivibrio Lachnospira Cytophaga
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GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL INTESTINO GRUESO (II) BACILOS ANAEROBIOS

Gram pos.:

Actinomyces Arachnia Propionibacterium Bifidobacterium Eubacterium Lactobacillus Clostridium Bacillus

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GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL INTESTINO GRUESO (III) BACILOS GRAM NEGATIVOS

Facultativos Escherichia Klebsiella Proteus Morganella Enterobacter Citrobacter Vibrio Pseudomonas

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GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL INTESTINO GRUESO (IV)

Cocos Gram + Facultativos Streptococcus Enterococcus Staphylococcus Cocos anaerobios Acidaminococcus Streptococcus Coprococcus Gemminger Megasfhaera Peptococcus Peptostreptococcus Ruminococcus Sarcina Veillonella
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FLORA MICROBIANA DEL APARATO GENITOURINARIO

Uretra anterior: Flora perineal

Estafilococo coagulasa negativo Estreptococos no hemolticos Corynebacterium spp Lactobacillus spp Prepuberal y postgmenopasica: mixta (piel + colon) Posgtpuberal

Vagina:

Lactobacillus spp Bifidobacterium spp Peptostreptococcus spp Bacteroides spp Levaduras

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TIPOS DE MICROORGANISMOS A LOS QUE ES APLICABLE LA DETECCIN M EDIANTE TCNICAS DE AMPLIFICACIN

No cultivadas De crecimiento lento Carfentes de mtodos de diagnstico eficaces De manejo peligroso Cultivos muy costosos

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DIAGNSTICO SEROLGICO: UTILIZACIN

Agente causal:
No cultivable Peligroso su cultivo Crecimiento lento

Cambiar el diagnstico o el tratamiento Comprender el proceso de la enfermedad Beneficio al paciente o a otros

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