MARTINEZ OLIVARES Jose SULLCA LLANOS, Joohnny Wilder FLORES QUISPE, Milton PACORI COANQUI, Fredy FLORES YUCRA,

Ruben

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS OPORTUNISTAS LEVADURIFORMES DEL GENERO Candida EN MUESTRAS BIOLOGICAS
PONENTES: SULLCA LLANOS, Joohnny Wilder MARTINEZ OLIVARES, Jose Antonio FLORES YUCRA, Ruben FLORES QUISPE, Milton PACORI COANQUI, Fredy Martin

INTRODUCCION

Candida es un gnero de levaduras. Clnicamente, la ms significativa del gnero es Candida albicans, causante de numerosas infecciones fngicas (candidiasis) en humanos y en otros animales, especialmente en pacientes con inmunosupresin Compuesto por ms de 150 especies Muchas de estas especies forman parte de nuestra flora normal aproximadamente un 10% Debido a su amplia distribucin, puede originar infecciones de distinta localizacin y gravedad, generalmente asociadas a factores predisponentes del husped, por lo que se le considera como un microorganismo patgeno oportunista.

La enfermedad micotica ms frecuentes es la candidiasis, en ocasiones, cuadros ms graves con manifestaciones invasoras en el paciente crtico o inmunodeprimido.

Otras especies de Candida de inters en patologa humana

Candida tropicalis Candida dubliniensis Candida glabrata Candida guilliermondii Candida krusei Candida parapsilosis El papel del laboratorio de microbiologa es de gran importancia, siendo la identificacin de especie algo fundamental para la eleccin de un tratamiento adecuado.

OBJETIVOS
Objetivos generales Aislar e identificar hongos oportunistas levaduriformes del gnero Candida

Objetivos especficos Identificar especies de Candida a partir de muestras biolgicas Cuantificar especies de Candida que fueron identificadas

ANTECEDENTES

Segn. M.T. MUJICA*, J.L. FINQUELIEVICH, V. JEWTUCHOWICZ, C.A. IOVANNITTI.

Prevalencia de Candida albicans y Candida no albicans en diferentes muestras clnicas. Perodo 19992001

Se estudiaron 1006 aislamientos provenientes de una amplia gama de muestras clnicas durante el periodo 1999-2001.

Candida albicans con 40,3% mayor frecuencia de aislamiento, Candida no albicans con 54,9% resultaron de mayor prevalencia 4,8% fueron otras levaduras.

En los hemocultivos Candida parapsilosis con 34,9%, C. albicans con 30,2%, C. tropicalis con 25,6%, C. glabrata se present con un 2,3%.

En las secreciones mucosas C.albicans con 60%-80%. Las infecciones del tracto urinario por levaduras se detectaron en mayor frecuencia en individuos hospitalizados, resultando C. albicans con 47,7%, Candida no albicans , C. glabrata con 24,8% y C. tropicalis con 20,0%.

Los estudios de sensiblidad al fluconazol de las especies de Candida nos permiten concluir que C.albicans es una especie sensible y que los mayores porcentajes de resistencia se observaron en C. glabrata (21,41%) y and C. krusei (69,23%).

La Candida se alimenta de azcar, hidratos de carbono, comidas fermentadas como la cerveza, el vinagre y los embutidos.

Muchas de estas especies forman parte de nuestra flora normal de la piel, tracto gastrointestinal, genitourinario respiratorio;
Aproximadamente un 10% de stas se relaciona con enfermedades infecciosas.

UBICACIN

Se encuentra en las membranas superficiales y en las mucosas.

En cantidades pequeas es indemne pero cuando su crecimiento aumenta drsticamente puede estar devastando su salud. Es considerada una de las enfermedades todava no-reconocidas que ms prevalece del hombre moderno.

Esto crea una variedad de sntomas como:

- deseo de comida (dulces, bebidas alcohlicas, chocolate, etc.) - alergias excesivas - problemas vaginales - depresin - alergias a ciertos alimentos - cansancio extremo - migraas - irritabilidad - falta de memoria - obesidad o prdida de peso excesiva - gases e hinchazn abdominal - diarrea o estreimiento - PMS- sndrome premenstrual - dolores de odos - entumecimiento y dolor de articulaciones - mente nublada - entre otros mas no suficientemente demostrados.

Las infecciones por Cndidas pueden causar vaginitis.

Esto produce quemazn de los genitales externos e internos y a menudo un flujo blanquecino que puede ser espeso.

Los suplementos de lactobacillus tomados durante el uso de antibiticos pueden reducir el riesgo de vaginitis por Candida tras la ingesta de antibiticos Las drogas hormonales: los contraceptivos Orales y los esteroides contribuyen a menudo a infecciones de Candida.

Epidemiologa

La candidiasis afecta normalmente las zonas hmedas y clidas de la piel y las mucosas, como las axilas, la boca, uas, el glande y la vagina. Representa un 25% de las micosis cutneas.

La candidiasis es la ms frecuente causa de vaginitis; se estima que una de cada cuatro mujeres experimenta esta enfermedad durante su vida.

Candida albicans es parte de la flora normal de la vagina, sin embargo, hay que recurrir a tratamiento mdico si adquiere la condicin de patgena cuando se transmite de una persona a otra por contacto sexual, esto es fcil de identificar dado que luego del contacto el hombre o la mujer presenta un color rojo en sus genitales y/o picor intenso que posteriormente desaparece transformndolo en paciente asintomtico y en transmisor aparentemente sano hasta que adquiere la condicin de invasiva en un promedio de 6 meses;

La condicin patgena es totalmente diferente. Las probabilidades de contraer candidiasis aumentan en pacientes obesos y diabticos; el consumo de antibiticos y anticonceptivos tambin incrementa el riesgo, as como alteraciones hormonales debidas al embarazo.

En pacientes con deficiencia inmunolgica, neoplasias, diabetes, lupus eritematoso, y linfomas, la infeccin puede extenderse, con consecuencias bastante graves.

Etiologa
Los hongos estn siempre presentes en el cuerpo humano, pero la presencia natural de otros microorganismos previene su crecimiento descontrolado.

Sin embargo, perturbaciones externas, como el uso de ciertos detergentes, variaciones del pH, o internas, como cambios hormonales o fisiolgicos

Sntomas

Los sntomas se caracterizan por lesiones cutneas (enrojecimiento o inflamacin de la piel) acompaadas de prurito y sarpullido. En las infecciones vaginales, puede presentarse flujo blanquecino, con un caracterstico olor a levadura. Su periodo de incubacin es de 8 a 15 das.

Complicaciones y Expectativas.

La candidiasis patogenica no es un buen pronstico dado que una enfermedad venerea que viene acompaada de VPH e infeccin bacteriana por lo general, es muy difcil de tratar y puede reaparecer con el tiempo. En individuos con compromiso del sistema inmunolgico una infeccin cutnea, vaginal u oral puede complicarse derivando en una candidiasis generalizada e invasiva o en una infeccin que afecte al sistema digestivo cuando no se trata a tiempo (candidiasis esofgica).

FORMAS CLNICAS
Mucosa oral: LESIONES HUMEDAS. Se forman puntos blancos caracterizados por placas o membranas con fondo eritematoso, inflamado y a veces sangrante, lengua, cara interna de las mejillas, encas, paladar y amgdala

Mucosa vaginal:
Presenta eritema, hay formacin de placas blancas o pseudomembranosa. Hay abundante flujo plurito y ardor. Puede comprometer la regin bulbar y perianal.

Mucosa uretral:

Presenta balanitis, hay formacin de vesculas y pstulas, se aprecia una marcada erosin y placas enrojecidas a veces recubiertas de escamas.

Pliegues o intertrigos:
Presenta zonas eritematosas con maceracin por el calor y el sudor. La piel se presenta como escaldata, hmeda con base eritematosa recubierta con una pelcula blanquecina.

Onicomicosis:

Afecta las regiones axilares, sub e intermamario, intergluteo, interdigitales de manos y pies, regiones retroauricular y umbilical

Onixis Candidiasica
Lesin: la ua presenta ADELGAZAMIENTO, como resultado de la oniclisis que se puede presentar con o sin perionixis, que es la inflamacin de la matriz ungueal. Hay desprendimiento del lecho y acumulacin de detritus subungueales.

Candida tropicalis
Es el 2do mas patogeno despues de la Candida albicans llegando a ser el responsable del 14% del total de infecciones producidas por levaduras de su gnero. Es el mayor agente causal de septicemia y candidiasis diseminada con especial importancia en pacientes con linfoma, leucemia y diabetes.

Tambin se encuentra como parte de la flora mucocutnea humana normal.

Es un patgeno oportunista que produce infecciones exgenas a enfermos inmunodeprimidos o diabticos en los que se ha producido una alteracin de los mecanismos de defensa. Su importancia patolgica se relaciona con infecciones en membranas mucosas y profundas en individuos inmunocomprometidos

Otras especies de Candida de inters en patologa humana

Candida glabrata Candida dubliniensis Candida guilliermondii Candida krusei Candida parapsilosis

IV. MATERIALES Y METODOS IV.1. MATERIALES EQUIPOS Autoclave Incubadora Refrigeradora Microscopio Estufa Balanza MATERIALES DE LABORATORIO Tubos de ensayo Placas petri Mecheros Asas de siembra Glass Alcohol Cloro Isopos Porta y cubre objetos

MATERILES DE CULTIVO Agar Sabouraud Agar Arroz MATERIALES DE USUARIO Mandil Guantes Barbijo Gorro Estuche de diseccin Campo de trabajo

REACTIVOS Glicerina KOH Suero fisiolgico

MUESTRAS BIOLOGICAS Muestras de Esputo Muestras de secrecin vaginal

IV.2. METODOS

1) Mtodos Basados En El Cultivo La mayora de los organismos levaduriformes crecen en el laboratorio con gran facilidad en un gran nmero de medios de cultivo convencionales. El medio Sabouraud (Asb), con o sin antibitico aadido (Cloranfenicol), es el ms indicado para realizar el aislamiento y para una posterior identificacin. La incubacin se realiza a temperatura ambiente cuando se trata de medios con inhibidores, y a 37C en el caso de medios enriquecidos. El cual concluye con la lectura macroscpica y microscpica. Al cabo de las 2448 h se pueden observar las colonias.

2) Observacin Macroscpica Y Microscpica

Observacion macroscpica Identificacin mediante criterios morfolgicos Al cabo de las 24-48 h se pueden observar las colonias caractersticas de color blanco o crema, de consistencia opaca, elevadas, lisas, brillantes o mates, y con un dimetro de 1 a 3 mm.

El aspecto de la colonia tiene gran inters, ya que es caracterstica de cada especie en los distintos medios y a partir del color, olor y consistencia nos facilitar su posterior identificacin.

La observacin microscpica De las muestras remitidas para su estudio micolgico es una tcnica sencilla y recomendable, ya que permite el diagnstico presuntivo en muchas ocasiones.

Examen en suero fisiolgico facilita la observacin

3) Mtodos Independientes Del Cultivo: a) Tubo germinativo Llamado tambin fenmeno de Reynolds-Braude. La produccin de tubo germinativo es una prueba muy rentable para identificar la especie (C. albicans y C. dubliniensis), siendo adems una prueba sencilla y rpida, con el inconveniente que pueden ser confundidos los tubos germinativos con hifas, necesitando experiencia previa para su interpretacin.

Antes de emitir un resultado negativo se debe tener presente la existencia de, aproximadamente, un 5% de cepas de C. albicans que no producen tubo germinal, y tambin la posibilidad de falsos positivos en el caso de C. tropicalis. La produccin de clamidosporas en los medios antes sealados es ms rentable para la confirmacin de C. albicans cuando la prueba del tubo germinativo es negativa.

Morfologa de las coloniasDE IDENTIFICACIN

Se presentar colonias cremosas de color blanco amarillento, lustroso, poco elevado y de bordes bien definidos
.

ESPECIES DEL GNERO . caracterizan CANDIDA por

Examen microscpico Se observan clulas redondas u ovaladas de tres a siete micras de dimetro, que se reproducen por blastoconidias y forman pseudomicelio en la mayora de las especies.

Pruebas fisiolgicas para identificacin Tubo germinativo Permite diferenciar las especies de Candida albicans de las no albicans. Procedimiento Se cultivo en 10 placas petri y 13 tubos en el cual se inculo de la cepa pura de Candida con 24 horas de desarrollo en 0,5 mL de suero humano o de conejo. Incubar a 35 37 C por 2h y 30 min. Colocar 2 3 gotas de la suspensin en una lmina portaobjeto y cubrir con lmina

Interpretacin: La prueba es positiva al visualizar una estructura elongada que se origina a partir de la levadura. Realizar esta prueba empleando cepas controles en paralelo a la cepa en estudio. Control positivo: C. albicans. Formacin de tubo germinativo

Desarrollo a 37 C Produccin de clamidosporas, blastoconidias y artrosporas. Procedimiento En las placas petri de cultivo de C. albicans de las colonias aisladas, sacar con un poco de sustrato y ponerlo con glicerina junto a un porta objeto, y observar el crecimiento vegetativo y produccin de clamidosporas, etc.

CUADRO N 01. TIPOS DE MUESTRAS BIOLOGICAS

NMEROS 4 2 4 4 1 TIPOS DE MUESTRA Mucosa vaginal Embarazadas Mucosa vaginal No embarazada Esputo Esputo tuberculoso Mucosa oral % 25 12.5 25 25 6.25

1
Total 16

Escamas piel

6.25
100%

CUADRO N 02. Muestras biolgicas positivas y negativos

MUESTRA POSITIVO 4 0 % 25 0 NEGATIVO 0 2 % 0 12.5

Mucosa vaginal Embarazada

Mucosa .vaginal No embarazada

esputo
esputo tuberculoso mucosa oral escamas de piel total

0
4 1 1 10

0
25 6.25 6.25 62.5%

4
0 0 0 6

25
0 0 0 37.5%

CUADRO N 03. Muestras biolgicas positivas para Candida albicans

MUESTRA mucosa vaginal embarazaba esputo tuberculoso mucosa oral escamas de piel total

NUMERO

POSITIVO

NEGATIVO

4 4 1 1 10

2 4 1 1 8

20 40 10 10 80%

2 0 0 0 2

20 0 0 0 20%

CUADRO N 04. Muestras biolgicas por especies identificadas

MUESTRA NUMERO C. albican s 2 4 1 1 8 % C.tropicali s %

mucosa vaginal embarazada esputo tuberculoso mucosa oral escamas de piel total

4 4 1 1 10

20 40 10 10 80%

2 0 0 0 2

13.3 0 0 0 20%

CUADRO N 05. CUANTIFICACIN DE HONGOS OPORTUNISTAS LEVADURIFORMES

MUESTRA Mucosa vaginal embarazada

NUMERO

POSITIVO + 2

POSITIVO ++ 2

POSITIVO +++ 0

22.2

22.2

esputo tuberculoso
mucosa oral escamas de piel

3
1 1

2
0 1

22.2
0 11.1

1
0 0

11.11
0 0

0
1 0

0
11.11 0

total

56%

33%

11%

CUADRO N 06. IDENTIFICACION DE OTRAS ESPECIES EN LAS MUESTRAS BIOLOGICAS

MUESTRA

NUMERO

OTRAS ESPECIES

Mucosa vaginal No embarazadas

bacterias

33.3

Esputo

Mucor sp

66.6

total

100%

DISCUSIN

Frente al estudio de (Mujica et al) donde se aisl a Cndida albicans con un 40,3%, a comparacin con los resultados obtenidos en este estudio se pudo apreciar tambin con mayor frecuencia la presencia de Candida albicans, podemos decir que es la especie con mayor frecuencia debido a que es parte de la flora que se encuentra normalmente en la piel, boca, garganta, la vagina, el colon; adems existen tambin otras especies presentes que producen candidiasis como es C. tropicalis con una frecuencia de 20 %, concordando con la bibliografa que lo describe como 2do causante de la Candidiasis.

CONCLUSIONES

En conclusin, las pruebas realizadas que fueron rpidas nos permiten la deteccin de C. albicans, aproximadamente en 72 horas, por ser un microorganismo que se caracteriza por producir tubos germinales, clamidosporas y observar sus tpicas colonias de color crema en Agar Sabouraud.

RECOMENDACIONES

Como siempre que la primera y posiblemente ms eficaz, medida de prevencin consiste en la seguir un buen programa de higiene, horario y de manejo de materiales, as como un control o uso adecuado de la fichas, no obstante, el uso o aplicacin de este tipo de medidas no siempre puede evitar la aparicin de problemas que puedan interrumpir o entorpecer el avance normal del proyecto.