Electroforesis

La electroforesis es una tcnica que se basa en la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico. Tipos: De frente mvil (en solucin) De zona (sobre un medio soporte)

En papel

Slice

Geles (a travs de una matrz porosa)

Agarosa (DNA)

Poliacrilamida

(DNA y protenas)

v Ctodo

Fel nodo

Fresist

Fel = Q . E = Q . V/d

Fresist = f . v

Q = carga E = potencial elctrico V = voltaje d = distancia entre electrodos f = coeficiente de friccin v = velocidad v partcula = Q . E f

Tamao y forma de la partcula

A v constante

Fresist = Fel m=v=Q E f

Movilidad de la partcula

La movilidad del DNA depende de: Factores extrnsecos a la partcula [agarosa] o [poliacrilamida] Voltaje

Buffer
Tiempo Temperatura pH

Factores intrnsecos a la partcula

Relacin carga/masa Conformacin Tamao

Factores extrnsecos

[ ] Agarosa

Log(PM o Kbs)

% de agarosa 0,5% 0,7% 1% a b

m
1,2%

mb>ma

A > % de agarosa la movilidad de la partcula disminuye

A > % de agarosa la resolucin de partculas de PM similar aumenta

% agarosa
poliacrilamida 0,5 0,8 1 1,2 1,5

Rango separacin
1-5 pb a 500 pb 700 pb a 25 Kpb 500 pb a 15 Kpb 250 pb a 12 kpb 150 pb a 6 kpb 80 pb a 4 kpb

* Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante

Poliacrilamida
Alta resolucin NO para fragmentos grandes Difcil de armar

Agarosa
Baja resolucin (poros grandes) SI fragmentos grandes Fcil de armar Si el % es muy bajo el gel es frgil

Voltaje aplicado

V tpico = 10 V / cm de gel

y geles de 10 15 cm

100 V 130 V

Mejor resolucin

Voltajes menores (70 V)

(mxima resolucin fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)

OJO,

difusin

Buffer de corrida

Da la fuerza inica al medio de corrida Al la [ ] de iones, la resolucin

TAE Composicin

Ms usado. No puede reciclarse mucho.

Mayor capacidad buffer

TBE
TPE

Tiempo
Depende del tamao de los fragmentos a separar A tiempo resolucin OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)

Temperatura
Temperatura y la m

OJO! (Se puede fundir el gel)

pH
Evitar modificaciones en la carga y conformacin del DNA y las protenas

Hay que controlar el pH

Factores intrnsecos

Relacin Q/m

Imp. para protenas:

Q/m

Ac. Nucleicos: Q/m constante!

Tamao

tamao

Conformacin del DNA

DNA circulares: 3 conformaciones posibles CA Circular abierto

Lineal

CCC

Circular covalentemente cerrado (superenrrollado)

+
0,6 a 1% agarosa

Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA

Glicerol o ficol o sacarosa

Densidad a la muestra

Loading Buffer
Colorantes de corrida (ubicar frente de corrida) Azul de bromofenol (corre como DNA 300 pb)

Xylene Cyanol (corre como DNA 4000 pb) Orange G (corre como DNA 50 pb)

Revelado

Autorradiografa

DNA marcado radioactivamente (Ej. PCR radioactiva)

BrEt
(tumorignico)

- Se intercala cada 2,5 pb - Fluoresce naranja a la luz UV - Detecta hasta 10ng de DNA ds - En la agarosa o post-corrida Genera SC(+). Afecta movilidad CCC. Retrasa 15% lineal Visualizacin durante corrida - Fluoresce amarillo - Poca afinidad gel (bajo background) - Detecta hasta 20 pg DNA ds - Seguro (no tumorignico) - Caro

Agentes intercalantes

SyBR Gold

cualitativos

sintticos

Marcadores de peso molecular

cuantitativos

DNA fagos o plsmidos digeridos por ER

Sintticos comerciales

Cuantificacin DNA Muestra Tamao DNA fagol = 48,5 kb

Marker Lambda EcoR1/HindIII

48,5 kb 3,53 kb

100% 7,28%

Intensidad similar

Si sembr 500 ng marker DNA: 100% 7,28% 500 ng 36,4 ng

% por el vol de DNA muestra sembrado para obtener la [ ]

Tipos de geles de agarosa

Analticos Comunes Preparativos

Alcalino (c/NaOH)

Para cDNA

Para RNA

Con formaldehdo (desnaturaliza RNA)

PGFE (en campo pulsante)

Separacin de fragm. > a 50 kb

Recuperacin del DNA del gel

- Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa - Colocar trozo de gel en bolsa de dilisis - Kits de slica gel - Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extraccin con fenol.

- Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA cae en el pocillo