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Ingegneria genetica

e
applicazioni del DNA ricombinante
Lievitazione: aumento di volume per azione dei gas durante la
fermentazione dovuta
al lievito.

L’anidride carbonica prodotta induce un aumento di volume dell’impasto,


che viene
contrastato dalla struttura glutinica della farina che, essendo elastica, si
oppone
all’espansione del gas di anidride carbonica, racchiudendolo all’interno
degli alveoli.
Con questo processo si ottiene un impasto poroso che, durante la cottura
in forno, si Pasta acida: miscela eterogenea di lieviti e
Processo di
trasforma in prodotto morbido batteri
lievitazione: e soffice, conservando a lungo queste
qualità che sono
- Naturale lattici
Bicarbonato di sodio, bicarbonato di
la caratteristica ammonio…
- Chimico dei prodotti ottenuti con le paste
Fermentazione lievitate.
delle melasse:monocoltura
- Di birra pura di
S.cerevisiae
1)garanzia di una fermentazione rapida e costante
nel tempo
2)possibilità di avere a disposizione il lievito in
Lievito di Fermentazion qualunque momento della giornata
birra: e alcoolica 3)sofficità del prodotto e quindi una più facile ed
uniforme cottura (il pane risulta con crosta sottile
e mollica meno acquosa)
4)diminuzione dei tempi di lavorazione
5) svantaggio: minore durata di conservazione del
pane
impasto formato da farina ed acqua lasciato
fermentare senza l'ausilio di lieviti incorporati
Lievito Fermentazion volontariamente, per un periodo di tempo più o
naturale: e meno lungo.
acido-lattica Il lievito naturale è dunque un composto ottenuto
dalla fermentazione spontanea di un impasto, nel
quale sono presenti microrganismi di specie
diverse: in particolare lieviti del genere
Saccaromiceti e batteri lattici; questi ultimi sono,
in prevalenza, Lactobacilli e Streptococchi.
Colture pure o miste in forma liquida,
Temperatura e pHsemi liquida,
sono secca
fattori (disidratata
importanti in
o liofilizzata). quanto influenzano l’attività microbica.
Questa forma di inoculo non è molto diffusa anche se i vantaggi legati
al suo utilizzo sono svariati:
Colture •una più facile organizzazione della produzione
starter: •diminuzione della quantità di lievito
•ottimizzazione e standardizzazione del processo di lievitazione
(scelta di ceppi selezionati sulla base di criteri tecnologici e
 La preparazione dei derivati del latte si basa
sull'utilizzo dei batteri lattici.
 Nella produzione dei formaggi intervengono due
passaggi fondamentali: la coagulazione delle
proteine del latte e la successiva maturazione
per i formaggi semi-stagionati e stagionati.
 La coagulazione avviene grazie ad un enzima, la
rennina, estratto dallo stomaco dei vitelli, che
caglia il latte.
 La cagliata è sottoposta poi a maturazione in
centinaia di modi differenti, che consentono di
produrre i diversi formaggi.

Formaggio Formaggio stagionato


giovane
Proteine intatte amminoacidi ammoniaca ammine Acidi grassi
Batteri e funghi

Formaggi Formaggi
a pasta dura teneri
 Nella preparazione del burro occorre separare il grasso dalla panna;
per far ciò è necessaria una iniziale acidificazione della panna ad
opera dei batteri lattici (streptococchi). Questi batteri producono
anche piccole quantità di acetoina, una proteina che si ossida
spontaneamente e forma il diacetile, un composto che conferisce al
burro un odore gradevole.

 Poichè ceppi diversi di streptococco danno diversi tipi di acetoina nella


produzione del burro è pratica comune quella di inoculare la panna
pastorizzata con colture selezionate di streptococco.
Yogurt: viene prodotto inoculando il latte con colture selezionate di batteri latti
Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus.

La fermentazione determina:

galattosio
Lattosio
glucosio Acido piruvico Acido lattico, responsabile dell’acidità
e della parziale coagulazione del latte
(consistenza cremosa)
 La produzione di vino si basa sulla fermentazione di zuccheri
(glucosio e fruttosio) presenti nel succo d'uva ad opera di lieviti.

S. cerevisiae è il ceppo di lievito utilizzato per fermentare gli zuccheri


del mosto in etanolo e anidride carbonica e non viene inibito dalle
concentrazioni di solfito impiegato per inibire la crescita di altri
microorganismi.

Temperatura di
fermentazione:21°-24°C.
La fermentazione dura 3-5 giorni
I lieviti contribuiscono direttamente ed indirettamente alle caratteristiche
aromatiche di un vino.

In natura esistono diversi generi di lievito;


quelli appartenenti alle specie S. cerevisiae e S. bayanus possiedono
una serie di caratteristiche enologiche positive e pertanto si considerano
buoni fermentatori.
Tuttavia, sulla superficie delle uve queste due specie sono poco presenti
(10/100 ufc/g), mentre prevalgono altri generi di lievito potenzialmente
dannosi per la qualità del vino.

Dall'analisi del genoma della vite è emerso che la pianta contiene


meno geni rispetto ad altre sequenziate finora come il riso e che
possiede molte grandi famiglie di geni che corrispondono e sono
responsabili delle caratteristiche organolettiche del vino (sono i geni
coinvolti nel metabolismo di tannini e terpeni che danno aroma e
sapore al vino).

Dalla disamina del DNA della vite è emerso che ci sono ben 43 geni per
la produzione di resvertrolo, la molecola antiossidante divenuta
famosa per i suoi effetti allunga-vita su animali.
L'alcool prodotto ha anche la capacità di estrarre il colore dalle
bucce dell'uva.

 Durante il primo anno, i vini intraprendono una seconda fermentazione,


cosiddetta malo-lattica (ad opera di diversi batteri, tra cui Pediococcus,
Leuconostoc, Lactobacillus):
                                          
 acido malico acido lattico ed anidride carbonica.
Il vino perde così acidità e diventa più gradevole.

 Un di utilizzo di tecnologie aggiuntive nella produzione del vino è


rappresentato da alcuni vini dolci francesi; prima della vendemmia le
uve vengono irrorate con un fungo: Botrytis cinerea.
L'infezione causa la perdita d'acqua dagli acini, che quindi diventano
più dolci. Il mosto dolcissimo che si ottiene viene trattato da lieviti
selezionati che fermentano il glucosio ma non il fruttosio che resta
intatto e conferisce al vino il sapore dolce che lo rende adatto al
dessert.
Una pratica divenuta usuale nelle aziende vitivinicole è l’utilizzo
di ceppi di lievito selezionati per uso enologico: i produttori si
assicurano in questo modo condizioni standard di
fermentazione, buoni parametri qualitativi del vino ottenuto e
riproducibilità del prodotto da un anno all’altro.

mosto

coltura su
terreno
selettivo
diluizioni seriali

isolamento
purificazione

collezione
 Batteri lattici: fermentazione lattica
f.malolattica, positiva nei vini rossi da
invecchiamento

 Batteri acetici: ossidano l’etanolo ad acido acetico. Spunto o


acescenza

 Lieviti aerobi: ossidano l’etanolo ad acetaldeide. Fioretta.

 Ceppi diversi di lievito influenzano le caratteristiche


organolettiche del vino (es. ceppi produttori di H2S, esteri etilici,
acetato di isoamile etc).
 La produzione della birra avviene a partire
dall'orzo; in alcuni paesi si utilizzano anche il
riso ed il mais.
 Questi cereali, a differenza dell'uva, non
contengono zuccheri fermentabili ma solo
amido. L'amido deve essere saccarificato, scisso
cioè in maltosio e glucosio che saranno poi
fermentati. Tale scissione avviene grazie ad un
enzima: l'amilasi, presente nei semi d’orzo
 germinati.
Preparazione della birra:
I chicchi d’orzo vengono ripuliti, messi in acqua per 48h per attivare l’amilasi, trasferiti poi
in una camera di germinazione (pH e temp. costanti) per 5-7gg. Chicchi germinati di
dimensioni richieste vengono trattati al calore:80°C per un colore chiaro; 105°C per una
colorazione scura; 200°C per un colore molto più scuro. Questo orzo germinato secco si
chiama malto.
Il malto viene miscelato con acqua, grano o riso; quindi la miscela viene posta in forno per
la bollitura; quindi viene passata in una vasca dove la temperatura viene ulteriormente
innalzata per stimolare l’attività enzimatica di maltasi e proteasi. La parte liquida
(mosto di malto) è trasferita in bollitori di rame dove dopo l’aggiunta del luppolo
(un'infiorescenza della rampicante Humulus lupus) viene mantenuta per 30min. Il
luppolo rilascia una resina la quale, sciogliendosi, conferisce il tipico sapore
amarognolo alla birra. Dopo filtrazione, sedimentazione, raffreddamento, il mosto di
malto viene messo in fermentatori nei quali vengono introdotti i lieviti. La birra verde
viene separata dai lieviti e trasferita in un contenitore a 0°C per settimane o mesi. La
birra matura viene filtrata, arricchita con CO2, pasteurizzata e imbottigliata.
 Nel caso della birra, al contrario di quanto avviene per il vino, la
fermentazione parte sempre grazie all'aggiunta di lieviti da parte
dell'uomo.

 I lieviti utilizzati derivano da lievitazioni precedenti e sono del genere


Saccaromyces cerevisiae: nel corso dei secoli i birrai hanno selezionato
però ceppi con caratteristiche ottimali (ora chiamati lieviti da birra) che
non esistono in natura.

 I lieviti utilizzati sono di due tipi:

-i lieviti che fermentano al fondo: richiedono temperature tra 6° e 12°C,


in 8-10gg

-I lieviti che fermentano in superficie: richiedono temperature tra i 14° e i


23°C, 5-7gg.
 E' possibile ottenere dall'amido, utilizzando microrganismi
fermentanti, etanolo e metano; quest'ultimo può essere
utilizzato come carburante ecologico per i veicoli.

 Dal mais è anche possibile ottenere il cosiddetto biodisel, un


carburante che abbassa drasticamente le emissioni di
sostanze nocive nell'atmosfera e che viene già utilizzato in
alcune città per alimentare i mezzi pubblici.
Le Biotecnologie

Cambiamento dell'informazione genetica di un organismo vivente


mediante modificazione diretta del suo acido nucleico o introduzione di
uno o più geni esogeni, attraverso una serie di metodologie, definite
nell'insieme "Tecnologia del DNA ricombinante", per ottenere sostanze
o prodotti utili all’uomo, oppure per modificare le caratteristiche di altri
organismi, o anche per sviluppare microrganismi per usi specifici.

Si basa sulla possibilità di:

• tagliare il DNA, in corrispondenza di siti specifici, con enzimi di restrizione


(endonucleasi),

• identificare geni di interesse, trasferirli ed inserirli in opportuni vettori


(clonaggio),

• introdurre tali vettori modificati (DNA ricombinante) in ospiti, che ne


consentano la
propagazione ed espressione, con produzione della proteina codificata dal
naggio genico può essere suddiviso in 5 passaggi:

lamento e frammentazione del DNA.

Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio mediante la DNA

1. Introduzione nell'ospite con la trasformazione o mediante


l’infezione con particelle fagiche. L`incorporazione del DNA
nell'ospite generalmente genera una miscela di cloni (genoteca).

 
4. Isolamento e purificazione del clone desiderato.

 
5.  Produzione di un elevato numero di cellule o batteriofagi
contenenti il clone desiderato per l'isolamento e lo studio del DNA
clonato.
 
Isolamento del DNA.

Demolizione della struttura cellulare per liberare il DNA dall’involucro


nucleare.
Per permettere al DNA di uscire dalla cellula e srotolarsi senza perdere
la sua struttura a doppia elica occorre sia demolire pareti e membrane
cellulari, sia eliminare gli istoni.
Precipitazione del DNA: una volta ottenuto il DNA libero in soluzione lo si
può separare sfruttando la sua proprietà di precipitare in etanolo,
addensandosi in una gelatina trasparente.
Frammentazione del DNA.
Le endonucleasi di restrizione riconoscono una specifica sequenza di
DNA (palindromi di 4, 6 o 8 nucleotidi) e tagliano simultaneamente i
due filamenti a livello della sequenza riconosciuta.
Richiedono Mg2+come cofattore.
Il taglio con gli enzimi di
restrizione produce una estremità
3’-OH e una 5’-P

Frequenza di taglio da parte di enzimi di restrizione


(DNA a composizione in basi casuale):
Per enzimi che riconoscono 4 bp: (1/4)4= 1/256 (1 sito ogni 256 bp)
Per enzimi che riconoscono 6 bp (1/4)6= 1/4096 (1 sito ogni 4096 bp)
Per enzimi che riconoscono 8 bp (1/4)8 = 1/65536 (1 sitoogni 65536 bp)(rare
cutters)
Ricordarsi che il DNA non ha in realtà una composizione casuale!
Clonaggio di geni eucariotici

Mentre geni batterici e virali possono essere tagliati e clonati


direttamente in un vettore, spesso i geni eucariotici sono interrotti da
introni; si preferisce allora ottenere il gene completo (cDNA) a partire da
mRNA maturo

Nella trascrizione primaria tutto il gene viene


trascritto (RNA trascritto primario), poi subisce
un processo di maturazione (“splicing”),
durante il quale le sequenze introni che
vengono rimosse.
L’mRNA maturo può essere retrotrascritto per
ottenere una molecola di cDNA che contiene il
PCR
Polymerase Chain
Reaction
Reazione a catena della
polimerasi
Scopo
Mullis e Faloona, 1987
Ottenere in vitro numerose copie di un gene o di un frammento di DNA
uguali al DNA stampo.

o DNA stampo
(anche 1 sola
copia!!!)
o Primers (inneschi)
oligonucleotidi sintetici (12-15 basi)
complementari alle estremità 5’ e 3’ del
frammento
o dNTP (ATP, TTP, CTP, GTP)
 E’ un termostato automatico
capace di modificare la
temperatura dei tubi di
o Taq polimerasi reazione in tempi molto brevi
(DNA polimerasi da Thermus
aquaticus)
100 bp 2 4 6 100
bp bp
1 3 5 7
ladder K- ladder

1500

1250
1031
900
800
700
600
500
La PCR ha trovato molte applicazioni pratiche.

•  La PCR permette, prima del clonaggio, di amplificare con


degli
inneschi il gene o i geni di interesse, identificati tramite
ibridazione.
•  La PCR può essere estremamente
utile anche
•  La PCR può anche essere utilizzata per il sequenziamento del DNA.
per
produrre grandi quantità di DNA
mutato.
• Poiché gli inneschi utilizzati non devono essere
perfettamente
complementari, la PCR è usata per studi comparativi o
evolutivi per
isolare da diversi campioni geni già clonati (e
sequenziati) da un
•  La PCR può essereorganismo.utilizzata anche per
amplificare quantità
molto piccole di DNA presenti in un campione.

•  La PCR è stata anche utilizzata per sviluppare il DNA


"fingerprinting”,
una potente tecnica che può permettere l'identificazione
di individui
Vettori di clonaggio

- Plasmidi  
- Cosmidi
- Batteriofagi
- Virus

Caratteristiche dei vettori di clonaggio:

(1)   origine di replicazione indipendente, in modo tale che la


replicazione nella cellula proceda indipendentemente dal controllo
diretto del cromosoma;

(5)presenza di siti di taglio, possibilmente singoli,su cui possano agire


le endonucleasi così da consentire l’inserimento del DNA estraneo
senza che siano alterate le sue funzioni essenziali,come la
replicazione.

(3)  dimensioni ridotte che facilitano la penetrazione nella cellula ospite;

(4)  elevato numero di copie nella cellula che rende possibile


l'amplificazione del DNA;
Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio
mediante la DNA ligasi.
Ospiti per i vettori di clonaggio

Le caratteristiche ideali di un ospite per il clonaggio dei geni sono:

5. crescita rapida,
6. capacità di crescere in terreni di coltura poco costosi,
7. non patogenicità,
8. capacità di essere trasformato con DNA
9. stabilità in coltura.
Tecniche di trasferimento genico in cellule :

Trasformazione in cellule procariotiche Trasfezione in


cellule eucariotiche

In particolari condizioni fisiologiche, che in laboratorio coincidono con


la fase di crescita esponenziale, i batteri divengono competenti.

Molte specie batteriche non naturalmente competenti possono essere


trasformate artificialmente in laboratorio. Per fare ciò, bisogna
permettere alle molecole di DNA di attraversare la membrana
rendendola temporaneamente permeabile.

Ciò si può fare mediante metodi chimici (CaCl2) o fisici (


elettroporazione).
•Elettroporazione

L’intesità e la durata dell’impulso vanno stabiliti empiricamente in base


al tipo cellulare da trasformare o da trasfettare
Il metodo tra i più usati è la
elettroporazione, che consiste
nell'applicare una
differenza di potenziale ai lati della
cuvetta che contiene la soluzione
con le cellule e il DNA da inserire:
lo shock elettrico provoca la
formazione di pori nella
membrana che permettono
l'ingresso del materiale genetico.
Ha come difetto l'alta percentuale
(%) di cellule che non
sopravvivono in seguito al
trattamento.

cuvette
Trasfezione stabile:
Il DNA esogeno trasfettato all’interno della cellula viene mantenuto in
maniera stabile e propagato alle cellule figlie.
Tecnica idonea per esperimenti a lungo termine.
L’efficienza dell’integrazione è molto bassa, quindi le cellule transfettate
stabilmente devono essere selezionate

Trasfezione transiente:
Il DNA esogeno viene trasfettato all’interno della cellula, ma non si
integra nel genoma; non contenendo un’origine di replicazione rimarrà
all’interno della cellula per un periodo di tempo limitato (verrà o
degradato o perso durante le divisioni cellulari).
Metodologia semplice, utile per esperimenti di breve tempo con cellule
in coltura.
Efficienza di trasfezione:molto alta.
Metodi fisici:
Elettroporazione

•Iniezione diretta:

• Efficienza del 100%


• Numero limitato di cellule da trasfettare per ogni singolo esperimento
• Utilizzata per cellule grandi (es.: ovociti di Xenopus) e per generare
animali transgenici
• Trasfezione stabile

• Gene
Gun
Il DNA viene accoppiato ad un solido inerte (solitamente particelle
di oro) e sparato direttamente nella cellula.
Può essere utilizzato anche su interi organismi e per la
trasformazione delle piante.
Trasduzione:
Il DNA può infine essere inserito per trasduzione. Per questo
vengono di solito utilizzati adenovirus, retrovirus e lentivirus.
Metodi chimici
Uno dei metodi più semplici e
meno costosi è quello che utilizza
il calcio fosfato.
La procedura prevede il
mescolamento di una soluzione
tampone HEPES contenente ioni
fosfato insieme a una soluzione di
cloruro di calcio (CaCl) e il DNA da
trasfettare. Il mescolamento delle
due soluzioni produce un
precipitato di calcio fosfato, che
andrà a legare la molecola di DNA.
Il precipitato viene prelevato,
risospeso e aggiunto al terreno di
coltura (di solito una coltura mono
strato). Con un processo ancora
non ben noto le cellule legano il
precipitato e permettono
l'ingresso del DNA.
Un altro metodo biologico molto efficace
sfrutta i liposomi, piccole vescicole lipidiche
che inglobano il DNA e sono indotte ad
entrare con esso nella cellula simulando i
processi di endocitosi cellulare.

Altro metodo prevede l'uso di dendrimeri,


molecole altamente ramificate che si legano
al DNA e lo trasportano nella cellula.
Selezione dei ricombinanti

Il DNA ricombinante ottenuto, che porta la


resistenza per un antibiotico, viene introdotto in
una cellula ospite (es. E. coli) sensibile; le
cellule in cui entra il DNA ricombinante
diventano resistenti e possono formare colonie
su terreni contenenti l’antibiotico (selezione dei
ricombinanti).
Selezione dei geni clonati
Medicina e farmacologia

Diagnostica
Produzione farmaci
Produzione altre sostanze

Terapia genica
Nella ricerca di base
 Un esempio di come le biotecnologie vengano usate nella ricerca di
base è quello della creazione di topi transgenici, utili nella ricerca di
base in campo biomedico.
 Utilizzando le nuove tecniche della genetica molecolare, è possibile
introdurre un gene esterno (transgene) nella linea germinale di una
cavia, in modo che la progenie risulti portatrice del carattere
transgenico.
 Diversi metodi sono stati utilizzati nel tempo per la generazione di
topi transgenici.

Schema di
generazio
ne
di un topo
transgenic
o.
o Quando i ricercatori isolano un gene umano dalle funzioni ignote,
per comprenderne la funzione inseriscono nel topo una sequenza
inattiva del gene isolato, rimpiazzando quello stesso gene
presente nell'animale. In questo modo viene creato un particolare
tipo di topo transgenico, il topo knock-out, privo cioè di quella
certa funzione genica.
Basterà quindi osservare il topo knock-out per comprendere la
funzione del gene in questione (ad esempio, se il topo perde
l'udito, si deduce che il gene in questione è coinvolto nei
meccanismi dell'udito, e la sua alterazione provoca la sordità).

o L'uso del topo per questi scopi nasce dalla particolare similitudine
tra il genoma umano e quello del roditore.
Produzione di anticorpi
monoclonali
Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati nella diagnostica di
laboratorio

uno dei sistemi


per il dosaggio
della molecola
X
In precedenza, i farmaci venivano prodotti per sintesi
chimica o estratti da fonti naturali come, piante e
microrganismi. Altre sostanze, come ormoni, venivano
ricavate da animali, cadaveri o da sangue umano,
ottenendo quantità molto esigue, a costi elevati e col
pericolo di contaminazione virale.

L’uso indiscreto e indeterminato di farmaci, inoltre, ha


causato il fenomeno della resistenza batterica,  facendo
aumentare la richiesta di nuovi farmaci.

Con l’avvento dell’ingegneria genetica, grazie a batteri e


piante transgeniche, si sono ottenuti nuovi farmaci, vaccini
e ormoni, a bassi costi e in grandi quantità.
Principali proteine ottenute con batteri geneticamente
modificati

Ormoni:

Somatotropina

La somatotropina è l’ormone della crescita, il cui deficit provoca


forme di nanismo. Per ottenere 0,5 milligrammi di somatotropina
pura è necessario estrarla dal cervello di mezzo milione di pecore,
mentre, con l’ausilio di un fermentatore e di batteri modificati,
basterebbero solo pochi litri di coltura per produrre centinaia di
grammi di somatotropina.
Insulina

Gli individui diabetici hanno un difetto di produzione di insulina,


una proteina prodotta dal pancreas che gioca un ruolo cruciale nel
metabolismo del glucosio.

L’ insulina, indispensabile per la vita dei pazienti diabetici, veniva


ricavata dal pancreas di mucche e maiali, con il rischio di
contaminazione virale.
Oggi viene prodotta biotecnologicamente con batteri ricombinati e
con il vantaggio di essere identica a quella prodotta nell’uomo.
La strategia di clonazione prevede la
produzione della catena A e B
separatamente. La catena B è stata
sintetizzata in2 tempi:prima la porzione N-
terminale, poi quella C-terminale.

Ciascuno dei geni prodotto sinteticamente è


stato inserito in un vettore plasmidico, fuso
con il gene lacZ e introdotto in E.coli.
L’informazione relativa alle catene
dell’insulina è stata separata da lacZ
mediante un codone codificante la metionina

Il sistema lacZ/β-galattosidasi ha numerosi


vantaggi:

 il sistema è inducibile

 le catene fuse con la β–galattosidasi


sono protette dalla demolizione
proteolitica.
I plasmidi ricombinanti e le cellule batteriche vengono mescolati. I
plasmidi entrano nelle cellule batteriche per trasformazione. Quando le
molecole di DNA ricombinante sono entrate con successo nell’ospite
batterico si replicano creando molte copie. Quando il batterio si divide il
plasmide si divide nelle due cellule figlie e continua a riprodursi. Le cellule
batteriche si dividono rapidamente (una volta ogni 20 minuti), un batterio
che contiene il cDNA umano (per esempio che codifica l’insulina) genererà
rapidamente un milione di cellule simili (cloni) conteneti lo stesso gene
umano. 

- I peptidi vengono trattati con bromuro di cianogeno.


- Purificati.
- Mescolati insieme per permettere la formazione spontanea dei
ponti disolfuro
Immunomodulatori:

Interferoni
Gli interferoni sono  proteine prodotte da particolari cellule del sistema
immunitario, queste proteine sono presenti in piccolissime quantità e
sono solo estraibili dall’uomo, poiché quelli estratti da animali sono
strutturalmente diversi ed sono inutilizzabili per la difesa immunologia
nell’uomo.
Con batteri transgenici si possono produrre ingenti quantità, senza
particolari processi di lavorazione. (Es.: Interferone α-2a (E. coli),
Interferone α-2b (E. coli), Interferone β-1a(cellule CHO).

Enzimi:
DNasi umana (cellule CHO))

Farmaci ottenuti da piante transgeniche


Sono di gran lunga più sicuri di quelli prodotti da animali, perché non
esiste il pericolo di contaminazione virale.

Proteine del sangue:


Attivatore tissutale del plasminogeno (E. coli, S. cerevisiae)
Fattore VIII di coagulazione (S. pombe, cellule CHO)
Vaccini
Un vaccino è un farmaco in grado di indurre immunità nei confronti di un
agente infettivo.
Un tempo venivano utilizzati ceppi indeboliti o uccisi nei quali però è
sempre insita la possibilità che il virus non sia stato completamente
inattivato e quindi possono essere potenzialmente dannosi per il
paziente.
Poiché le proteine virali di superficie rappresentano la parte attiva del
virus inattivato, oggi vengono utilizzati batteri GM, nei quali sono stati
inseriti i geni virali, che sintetizzano la parte proteica del virus.
Successivamente, la proteina viene inoculata nell’organismo umano,
provocando la produzione di anticorpi resistenti.
Utilizzando quest’ultima tecnica, si ha il vantaggio di ottenere vaccini
purificati, più sicuri e che manifestino effetti collaterali più controllati.
In commercio, sono gia in uso, come il vaccino per l’epatite B (S.
cerevisiae, P.pastoris, H. polymorpha).

Vaccini a DNA.
Introduzione nell’organismo di DNA ricombinante contenente uno o più
geni che codificano per antigeni che vengono prodotti nell’organismo e
stimolano una risposta immunitaria protettiva
Alcuni importanti composti biotecnologici
prodotti con le tecniche del DNA ricombinante
Prodotto Funzione
Applicazioni Proteine del sangue  
Attivatore del Dissolve i trombi
pratiche plasminogeno tissutale  
dell’ingegneri Fattori VII VIII, IX Promuovono la coagulazione
Eritropoietina Stimola la crescita degli eritrociti
a genetica Urochinasi Dissolve i trombi
Ormoni  
Insulina Trattamento dei diabete
Ormone della crescita umano Trattamento dei nanismo
Fattore di crescita cicatrizzazione delle ferite
epidermico  
Ormone paratiroideo Regolazione del calcio
P-Endorfina Antidolorifico
Fattore di crescita osseo Osteoporosi
Atriopeptina Diuretico, antipertensìvo
Immunomodulatori  
Interferoni Agenti antivirali e potenzialmente antitumorali

Interleuchina 2 Stimolatore dei linfociti T


Fattore di necrosi tumorale Agente antitumorale
Fattore di stimolazione delle Trattamento delle infezioni e del cancro
colonie di granulociti e macrofagi

Lisozima Antinfiammatorio
Voccini  
Epatite B Prevenzione delle epatiti da siero
Citomegalovirus Prevenzione delle infezioni
Morbillo Prevenzione dei morbillo
Colera Prevenzione dei colera
AIDS Prevenzione dell'AIDS
Rabbia Prevenzione della rabbia
Esempi di prodotti
industriali ottenuti
mediante l’impiego
di microrganismi
Xenotrapianti: Potenziali donatori di organi per il trapianto
in uomo

Gli xenotrapianti sono trapianti di organi o tessuti animali


“umanizzati”, nell’uomo.
Questi animali transgenici sono frutto dell’ingegneria genetica, con
la quale si inseriscono geni umani negli embrioni di alcuni animali, i
quali fanno sviluppare una proteina sulla superficie delle cellule,
capace di prevenire il rigetto.
È molto pericoloso operare gli xenotrapianti perché esiste il rischio
di contaminazione da nuove malattie, causate da virus inattivi
presenti in questi organi, sviluppando in questo modo malattie
molto pericolose,  che colpirebbero l’uomo.
Terapia genetica

Uno dei più grandi obiettivi della medicina genetica è quella di curare
malattie genetiche, provocate da alterazioni di uno o più geni o da malattie
ereditarie, come la talassemia, la distrofia muscolare di Duchenne e la
fibrosi cistica.
Una volta individuato il gene difettoso, si disattiva e si sostituisce con
quello funzionante (Immunizzazione genica).
Questa operazione viene effettuata su cellule somatiche ma potrebbe
essere effettuata anche su quelle germinali modificando il patrimonio
genetico dei discendenti.
Fermentazioni microbiche.
Numerosi prodotti, soprattutto antibiotici, vengono prodotti
industrialmente usando microrganismi. Le tecniche dell'ingegneria
genetica possono essere sfruttate per manipolare gli organismi in
grado di produrre antibiotici, al fine di aumentarne la resa o
produrre molecole modificate, più efficaci e meno tossiche,
abbassando i costi.

- Oltre 6000 antibiotici isolati da vari microrganismi


- 100/200 antibiotici scoperti all’anno, di cui solo 1% entra
in commercio.
- Streptomyces: principale organismo utilizzato per
produrre antibiotici.
La composizione del terreno influenza
enormemente la produzione degli
antibiotici: ilterreno ideale è quello che
risulta più vantaggioso in termini di
costi per unità di prodotto.

Il terreno deve contenere una sorgente di:


- Carbonio
- Energia
- Azoto
- Fosforo
- Oligoelementi

Temperatura, pH e sterilità dell’ambiente


devono essere costantemente
controllati
Secrezione del prodotto

Alcuni microorganismi non sono capaci di secernere le


sostanze da loro prodotte, si sta cercando di ottenere,
mediante ingegneria genetica, ceppi microbici forniti di
membrane cellulari maggiormente permeabili.

Purificazione del prodotto

Le molecole prodotte devono essere separate da ogni altra sostanza.


La separazione può avvenire per affinità
Clonaggio dei geni della biosintesi di antibiotici

La biosintesi degli antibiotici richiede da 10 a 30 reazioni


enzimatiche.

È difficile clonare tutti i geni per la sintesi di un antibiotico.


Strategie utilizzate:
2. Complementazione
3. Identificazione/purificazione di un enzima
chiave
Ceppo selvaggio
DNA cromosomale Analisi biochimiche
Digestione
Identificazione e purificazione
trasformazione
Ceppo di un
mutante
Selezione dei cloni che enzima del percorso
Determinazione
biosintetico della
producono sequenza
antibiotico
Utilizzo del DNA dei cloni positivi amminoacidica
Preparazione di sonde per il
come sonda
gene in
Sceening di un’altra genoteca
esame
del Screening di una genoteca
ceppo selvaggio
Costruzione del cluster genico
Manipolazione genetica di Streptomyces

+ PEG

Protoplasti
Sintesi di nuovi
antibiotici

Un microorganismo che viene a contatto frequentemente con un


antibiotico tende a sviluppare resistenza allo stesso, per cui si
cerca sempre di produrne di altri.

Antibiotici naturali Antibiotici


semisintetici

Tramite introduzione in un unico organismo di vie di sintesi di altri


antibiotici appartenenti alla stessa famiglia.

I nuovi antibiotici costituiscono lievi varianti strutturali degli antibiotici


preesistenti e sono sintetizzati perché l’intermedio di una via
biosintetica può divenire substrato per un’altra via.
Piante e animali transgenici.
Oltre alla produzione da parte dei microrganismi di molecole utili,
l'ingegneria genetica permette di modificare geneticamente piante ed
animali. Si ritiene che questi organismi, detti transgenici, possano
essere molto utili per lo sviluppo delle attività agricole grazie alla
possibilità di alterare la qualità nutrizionale di carni e vegetali, e di
ottenere proteine che non vengono facilmente prodotte mediante
microrganismi geneticamente manipolati. Introducendo il DNA clonato
in uova fecondate o direttamente in cellule vegetali, è possibile
produrre organismi superiori geneticamente modificati.
Piante resistenti agli erbicidi
Piante resistenti all’attacco degli insetti
Piante resistenti a funghi, muffe e virus
Piante con caratteristiche nutrizionali migliori e maggiore
conservabilità
Piante resistenti alle malattie infettive
Piante resistenti agli stress ambientali

Miglioramento della produzione di alimenti


In campo agroalimentare

■ E' senz'altro nel settore agro-alimentare che le biotecnologie


hanno conosciuto il loro sviluppo più controverso e dibattuto.
La produzione di organismi geneticamente modificati a scopo
alimentare rappresenta in effetti un ambito di ricerca,
produzione e discussione attiva, anche sul piano legislativo.

■ Una pianta transgenica è una pianta nella quale è stata


inserita artificialmente una sequenza di DNA contentente uno
o più geni esogeni.

■ Tali geni possono provenire da un'altra pianta o anche da


organismi diversi, come batteri o animali.

Le principali modifiche rigardano la resistenza agli erbicidi (73%),


agli insetti (18%) o alla combinazione di entrambi (8%)
• Una delle tecniche maggiormente utilizzate per inserire un gene
esogeno in una pianta è quella che sfrutta un "ingegnere genetico"
naturale: Agrobacterium tumefaciens è un microrganismo presente
in natura che infetta le piante, inserisce alcuni frammenti del suo DNA
nel DNA della pianta che produce così alcune proteine batteriche; il
microrganismo cresce, formando sulla pianta un tipico callo. E' un
esempio di scambio di DNA tra batteri e piante che avviene
spontaneamente in natura.
• Con le tecniche del DNA ricombinante è possibile inserire in
Agrobacterium tumefaciens un gene esogeno; il microrganismo verrà
poi messo a contatto con la pianta, svolgerà il suo ruolo naturale di
trasferimento di DNA in quello della pianta trasferendovi anche il gene
esogeno.
Con la tecnica dell’infezione con Agrobacterium tumefaciens fu prodotta nel 198
la prima pianta transgenica:
una pianta di tabacco resistente ad un antibiotico (Herrera-Estrella et al., 1983).

LIMITI:

• casualità

• invasività del materiale transgenico


 Classico esempio di biotecnologia è rappresentato dall'inserimento
nelle piante di mais del gene cry proveniente dal batterio Bacillus
thuringiensis: Il gene conferisce la resistenza ai bruchi dei
lepidotteri che attaccano le piante. Le piante transgeniche non
hanno più bisogno di essere irrorate con i pesticidi.

Vantaggi: - riduzione del tasso di pesticidi immessi nell'ambiente,


- selettività dell'azione (i pesticidi uccidono tutti gli insetti, la
pianta
transgenica solo i bruchi patogeni),
- costo più basso per il coltivatore,
- frutto privo di pesticidi sulla superficie.
• Oltre a piante resistenti agli insetti possono essere create
piante resistenti agli erbicidi; la crescita delle erbacce
rappresenta un serio problema per le colture intensive,
diminuendo sia la quantità che la qualità del raccolto. L'uso
degli erbicidi, d'altro canto, danneggia anche la coltura.

E' possibile creare piante transgeniche con enzimi in grado di


degradare gli erbicidi: in questo modo l'erbicida può essere
usato senza danneggiare le piante, che, a loro volta,
contribuiscono a renderlo biodegradabile.

Es di resistenza ad erbicidi.: - al glufosinate d’ammonio


- al glifosate
patogeni

 inserimento nel genoma


vegetale di sequenze di DNA
virale, codificanti per la
proteina di rivestimento del
virus stesso (CP, coat
protein).
Sembra che l'espressione
delle proteine virali CP nella
pianta interferisca con uno
dei primi steps della
replicazione virale, cioè la
perdita delle proteine di
rivestimento da parte del
virus appena entrato nella
cellula.

 inserimento, nel genoma di


organismi vegetali, di
sequenze virali che
codificano per l’enzima
replicasi. In questo caso
sembra che l’espressione del
gene virale possa
Alimenti transgenici

La sicurezza d’uso dei prodotti agroalimentari che si ottengono


da organismi transgenici viene valutata tramite la suddivisione
in tre classi:

Classe 1: Alimenti o ingredienti alimentari sostanzialmente


equivalenti all’alimento o ingrediente alimentare tradizionale di
riferimento, cioè la trasformazione genetica ha modificato
qualità del prodotto non inerenti al consumo alimentare;

Classe 2: Alimenti o ingredienti che siano sufficientemente


simili all’alimento tradizionale di riferimento, cioè la
trasformazione genetica ha modificato lievemente le sue
qualità inerenti al consumo;
Classe 3: Alimenti o ingredienti alimentari che non sono né
sostanzialmente equivalenti né sufficientemente simili al
prodotto tradizionale di riferimento.
Alimenti
transgenici
Gli alimenti transgenici Resistenza a insetti
più diffusi e le loro Mais Tolleranza a diserbanti
caratteristiche modificate Resistenza a virus
Tolleranza alla siccità
Pomodo Produttività
ro Resistenza a virus, insetti
o funghi
Amido modificato
Patata Resistenza a insetti
Produzione fruttani
Melanza Resistenza a insetti
na
Soia Tolleranza a diserbanti
Zucchin
Resistenza a virus
o
Olivo Resistenza a funghi
patogeni
Cotone Resistenza ai diserbanti
Nelle fasi di stoccaggio e trasporto della frutta e degli ortaggi si
possono avere perdite ingenti a causa di ammaccature, danni causati
dal freddo o dal calore, eccessiva maturazione, sapori e odori
sgradevoli e così via. Molti di questi cambiamenti sono legati ad attività
di enzimi presenti nei prodotti stessi.

Nel pomodoro, l'enzima


poligalatturonasi degrada i
componenti della parete
cellulare così che,
maturando, il frutto diventa
più molle.

La trasformazione delle piante di


pomodoro con una copia "antisenso" del
gene della galatturonasi fa diminuire
l'espressione di questa proteina del 90%.
Per creare il gene antisenso è stato fuso
un cDNA del gene della galatturonasi, con
orientamento invertito, con un promotore
forte. Questo gene invertito, o antisenso, è
stato saldato ad un plasmide Ti per Degradazione
Agrobacterium tumefaciens ed introdotto
in piante di pomodoro.
• Un'altra applicazione è rappresentata dal riso transgenico nel
quale viene inserito il gene per la produzione di beta-
carotene.
Il riso non contiene una vitamina fondamentale per la
nutrizione umana: la vitamina A; circa due miliardi di persone
nel mondo, soprattutto in alcune zone povere del pianeta,
hanno un'alimentazione basata sul riso e soffrono di carenza di
questa vitamina (che provoca cecità notturna, affezioni della
cornea che portano alla cecità totale, aumento della mortalità
infantile).
Il riso transgenico produce beta-carotene, che viene
trasformato dal nostro organismo in vitamina A.
L'ingegneria genetica offre inoltre i seguenti mezzi per ridurre l'uso dei
fertilizzanti e l'impoverimento del terreno:
- la produzione dei batteri azoto-fissatori ad esempio può essere raggiunta
modificandoli in modo che si adattino a convivere in simbiosi con ogni tipo di
pianta e non solo con le leguminose;

- si possono produrre piante transgeniche da coltivazione in grado di fissare


esse stesse l'azoto; in questo caso i geni batterici responsabili della
fissazione dell'azoto dovrebbero essere trasferiti direttamente nel corredo
genetico delle piante diventando autofertilizzanti.
Con l'aiuto delle biotecnologie si sta cercando di creare piante
resistenti agli stress ambientali in modo da ridurre le perdite di
produzione.
Recupero ambientale
Le piante transgeniche trovano anche impiego per la fitorimediazione;
con questo termine si indica l'utilizzo di organismi vegetali per la
riduzione dell'inquinamento ambientale (da petrolio e metalli pesanti).
Alcune piante infatti mostrano interessanti attività fito-estrattive,
questa capacità può essere potenziata con la creazione di piante
transgeniche che producano grandi quantità di biomassa e al contempo
abbiano la capacità di accumulare ioni metallici inquinanti.
L’introduzione di batteri GM nei normali
depuratori industriali e civili ha permesso
di velocizzare i processi di smaltimento,
contenendone la richiesta.

L`ingegneria genetica sfrutta queste risorse per


processi di decontaminazione ambientale. Spesso
i geni utilizzati vengono isolati da ceppi batterici
selezionati da siti contaminati; ad esempio i geni
per la biodegradazione dei pesticidi clorurati,
come l'acido 2,4,5triclorofenossiacetico (2,4,5‑T),
clorobenzeni e clorofenoli, naftalene, toluene,
aniline e diversi idrocarburi. Questi geni isolati
soprattutto da batteri appartenenti ai generi
Pseudomonas e Alcaligenes, vengono clonati in
plasmidi. Sono stati costruiti plasmidi contenenti
Bioindustriale

 La produzione di molti composti chimici, in precedenza prodotti


dall’industria del petrolio, vengono prodotti biotecnologicamente. I
principali motivi economici, che hanno accelerato l’espansione in
questo settore, sono legati all’alto costo del petrolio.

Alcuni dei prodotti, ottenuti biotecnologicamente:


o l'acido ossalico, impiegato nei processi di stampa e di tintura;
o l'acido propenoico, utilizzato come intermedio nella produzione
di alcune materie plastiche;
o l'acido lattico, aggiunto come acidificante ad alcuni alimenti;
o le sostanze antigelo.

 I microrganismi producono, inoltre, molti tipi diversi di enzimi, che,


essendo dei catalizzatori, permettono alle reazioni chimiche di
procedere in condizioni molto più blande di quanto non
avverrebbe, invece, in loro assenza.
 La produzione industriale di enzimi utilizzati nei detergenti
per rimuovere le macchie ne è un esempio: enzimi ottenuti da
organismi opportunamente modificati svolgono un'azione
proteolitica (demolizione di proteine) e lipolitica (demolizione
di grassi), rendendo possibile un proficuo lavaggio della
biancheria anche a basse temperature, con notevole risparmio
energetico e basso impatto ambientale.

 Nell'industria cartaria gli enzimi ottenuti con metodi


biotecnologici vengono invece utilizzati per la lavorazione e la
tintura della carta.
Il blu originale veniva prodotto per fermentazione dell’ Indigofera
tinctoria da parte di Clostidium.

-Decolorazione: un gene per la perossidasi fungina è stato clonato in


lievito. I cloni
sopravvissuti alle condizioni di lavaggio sono stati selezionati.
-Tessitura: il poliestere ecologicamente sostenibile viene ottenuto con
batteri geneticamente modificati che convertono , utilizza ndo un
enzima batterico, gli zuccheri in glicerolo, che sarà poi convertito in
trimetilen-glicole, grazie ad un enzima di lievito.
- Colorazione blu: E. coli diventa blu quando viene clonato in esso il gene
della conversione dell’indolo a indaco proveniente da P. putida.
Altri ricercatori hanno sviluppatouna coltura fungina mutata che produce
lo stesso colorante.
-Plastica: i microorganismi possono essere utilizzati per produrre
cerniere e altri materiali da imballaggio fatti imballaggio.
 Un intenso dibattito tra favorevoli e contrari è in corso
nel mondo. La questione sembra comunque essere
limitata al cibo. Sarebbe interessante interrogarsi sul
perchè il dibattito sia suscitato solo da uno dei tanti
possibili campi di applicazione della tecnica di
produzione di organismi GM.

 Le principali questioni in campo riguardano

 - la sicurezza dei cibi transgenici per la salute


dell'uomo e
 - la sicurezza per l'ambiente
I cibi transgenici possono provocare allergie?

Possono contribuire all'incremento delle resistenze agli


antibiotici?
Possono esserci rischi legati alla struttura dei geni inseriti?
Le piante resistenti agli insetti possono danneggiare
l'ecosistema?
Le piante GM possono "contaminare" piantagioni vicine non
GM?
La coltivazione delle piante GM può danneggiare la
biodiversità?
Ma le multinazionali del Golden Rice Importante per ridurre la
settore biotecnologico, si cecità cui
arricchiranno??? 50.000 bambini/ mese vanno
incontro nel sud del mondo.

 4.000.000 di piccoli coltivatori stanno utilizzand


il cotone resistente agli insetti

 La resa è maggiore di circa il 20%


rispetto alle colture tradizionali

 I costi per gli antiparassitari sono stati ridotti


di circa il 70%
Sfide per il
futuro

Un settore in fase di avanzata


sperimentazione è quello degli xenotrapianti, come
vengono definiti i trapianti fra specie diverse:
produzione di animali transgenici modificati per
renderli donatori d’organi compatibili con gli esseri
umani.

Sono già in vendita alcuni farmaci ricavati da


bio-reattori, ovvero prodotti impiegando animali
transgenici. Vengono definiti bio-reattori quegli
organismi, che siano piante o animali, i cui geni sono
stati modificati al fine di produrre farmaci o proteine
umane.