SISTEMA FAESA EDUCAO - FACULDADES INTEGRADAS SO PEDRO - INSTITUTO SUPERIOR DE EDUCAO - ISE CURSO DE QUMICA

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) OU HPLC

Mtodos Instrumentais de Anlise

ALERANDRA MARTINS MADEIRA CHRISTIANO RODRIGUES JORGE HENRIQUE POTTI BARBOSA LUAN BARBOZA RODRIGO AMORIM SILVANA LOUREIRO GAMA

PROFESSORA - KEROLY ALAIDE PASCOAL COLATI Vitoria, 19 de Junho de 2013

1. INTRODUO .................................................................................................................................. 3 3. 4. 5. 6. VANTAGENS E LIMITAES DA CLAE ............................................................................................... 5 CARACTERSTICAS DAS FASES ESTACIONRIAS ............................................................................... 6 REQUISITOS DA FASE MVEL ...........................................................................................................7 INSTRUMENTAO ......................................................................................................................... 8
6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 RESERVATRIO PARA FASE MVEL ............................................................................................................ 9 DESGASEIFICAO DA FASE MVEL ........................................................................................................ 10 SISTEMAS DE BOMBEAMENTO ................................................................................................................ 11 SISTEMA DE INJEO DA AMOSTRA ........................................................................................................ 12 COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA................................... .........................14 DETECTORES USADOS EM CLAE ............................................................................................................... 15

AS TECNICAS DA CLAE .................................................................................................................... 17

8. COMPARAO CROMATOGRAFIA LIQUIDA X GASOSA..................................................................25 9. CROMATOGRAMA ...........................................................................................................................26 10.DICAS DO QUE NO FAZER EM HPLC ..............................................................................................27 11 .VISITA LABPETRO.... ........................................................................................................................28 12.CONCLUSO ....................................................................................................................................32 13.BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................33

Nenhum

registro

das

tcnicas fica

cromatogrficas

contemporneas

completo se no incluir a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). um tipo de cromatografia lquida que emprega

pequenas colunas, recheadas de materiais

especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas presses.
FIGURA 1: Cromatografo CLAE. FONTE:www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_cont ent.html

Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma grande

quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.

Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? Requer somente que a amostra seja solvel na fase mvel.
NO ESTVEIS TERMICAMENTE ALTO PESO MOLECULAR

NO VOLTEIS

Na anlise ambiental

Pesticidas

Na indstria farmacutica,

Aminocidos

Na anlise de alimentos, entre outros

Polmeros

Toxicologia

Protenas

Cosmticos

VANTAGENS

LIMITAES Alto custo da instrumentao Alto custo de operao Pouco usada para anlises qualitativas Falta de detector universal sensvel Necessidade de experincia no seu manuseio

Menor tempo de anlise

Alta resoluo Resultados quantitativos Boa sensibilidade Versatilidade - nico requisito a solubilidade da amostra na FM. Automao

Bons resultados quantitativos:

desvios inferiores a 5%. Boa detectabilidade

Considerando as suas propriedades fsicas, os recheios para CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos:

Slidos rgidos, semi-rgidos ou no rgidos;

Partculas porosas ou peliculares;

Partculas esfricas ou irregulares;

Partculas com diferentes dimetros.

5. REQUISITOS DA FASE MVEL

Alta pureza

A fase mvel deve ser de alta pureza,

como um solvente de grau realizar

Inerte frente a amostra

cromatogrfico,
Inerte frente a FE

permitindo

anlises de alta sensibilidade com detectores por fluorescncia ou por

Baixa viscosidade

absorbncia no ultravioleta, onde as impurezas da fase mvel podem

Compatvel com detector

absorver e diminuir a sensibilidade do

detector para os componentes da amostra.

No txica e no inflamvel

6. INSTRUMENTAO

FIGURA 1: Diagrama de blocos mostrando os componentes tpicos de um sistema para CLAE. FONTE: SKOOG. 2007

6.1 RESERVATRIO PARA FASE MVEL

Um instrumento moderno de CLAE equipado com um ou mais reservatrios de vidro, cada um deles tendo 500 mL ou mais de um solvente. Freqentemente so tomadas medidas para a remoo de gases dissolvidos e de partculas presentes nos lquidos.

Limpeza peridica do filtro essencial.

FIGURA 2: Reservatrio para fase mvel CLAE. FONTE:www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_con tent.html

6.2 DESGASEIFICAO DA FASE MVEL

Indispensvel para o bom funcionamento do sistema. Garante: Reprodutibilidade da vazo: retira ar dissolvido na FM e evita bolhas na bomba; Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam instabilidade da linha de base;

Sparging o processo pelo qual os gases dissolvidos so arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um gs inerte e insolvel.

6.3 SISTEMAS DE BOMBEAMENTO

A bomba tem que proporcionar uma vazo razovel atravs da coluna, para que a anlise no seja lenta, e uma vazo constante, para no atrapalhar o sistema de deteco. Os aspectos mais importantes para o sistema de bombeamento so: Habilidade de gerar presses de at 6.000 psi (libras/polegadas quadradas), Sada livre de pulsao, Vazes na faixa de 0,1 a 10 mL/min, Reprodutibilidade relativa da vazo de 0,5% ou melhor e Resistncia corroso por uma grande variedade de solventes.

FIGURA 3: Uma bomba recproca mais utilizada para CLAE. FONTE: SKOOG. 2007

6.4

SISTEMA DE INJEO DA AMOSTRA

A amostra, introduzida na vlvula mediante seringa, deve encher o espao interno da poro do tubo capilar de ao, a ala de amostragem (carga). Normalmente o volume contido na ala de 1 a 100 L.

A amostra injetada na coluna, ao girar a vlvula para que a posio de

entrada e sada mude (injeo na coluna). Desta forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de amostra, dependendo do tubo capilar (ala de amostragem) utilizado, com um alto grau de reprodutibilidade.

6.4

SISTEMA DE INJEO DA AMOSTRA

FIGURA 5: Sistema com ala de amostragem para a cromatografia lquida. FONTE: www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html

FIGURA 4: Sistema com ala de amostragem para a cromatografia lquida. FONTE: SKOOG. 2007

6.5

COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

As colunas so constitudas de um pedao de tubo de algum material inerte, de dimetro interno uniforme e capaz de resistir as presses em que ser usado. 0 ao inoxidvel o mais usado entre todos os materiais. Existem tambm algumas

feitas com vidro de paredes grossas, mas apresentam o inconveniente de no se

conseguir conexes adequadas, entre o vidro e o metal, que resistam a altas presses sem vazamento.

FIGURA 6: Coluna usada no CLAE FONTE: www.caseanalitica.com.br/coluna_para_hplc.php

6.6

DETECTORES USADOS EM CLAE

Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma destas solues. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes caractersticas: Alta sensibilidade e baixo limite de deteco Resposta rpida a todos os solutos Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na vazo da fase mvel.

Resposta independente da fase mvel

Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector. Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto No destruio do soluto. Segurana e convenincia de uso. Informao qualitativa do pico desejado.

6.6

DETECTORES USADOS EM CLAE

Detector de absoro UV/Vis Mais sensvel Capaz de detectar grande nmero de compostos

Detector por ndice de Refrao

Universal Sensibilidade e Reprodutibilidade baixas Detector de Fluorescncia Limitado a compostos que fluorescem Alta Sensibilidade e Especificidade Detector de Massas

Sistema de biblioteca
Alta Sensibilidade

FIGURA 2: Aplicaes da cromatografia lquida. Observe que os tipos de cromatografia direita do diagrama so mais adequados para os compostos polares. As tcnicas na parte de baixo do diagrama so mais adequadas para as espcies de alta massa molecular. FONTE: SKOOG, 2007

(b) Inseticidas organofosforados.

A cromatografia lquido-lquido (CLL) foi

desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para separao de vrios aminocidos, usando fase estacionria de gua em slica e clorofrmio como fase mvel.
(a) Aditivos em refrigerantes.

0 mecanismo de separao neste tipo de

cromatografia, ou mecanismo de distribuio

como tambm chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na fase estacionria.
FIGURA 2:. (a) Aditivos em refrigerantes. (b) Inseticidas organofosforados. FONTE: SKOOG, 2007

A fase estacionria para a cromatografia lquida com fase ligada (CLFL) surgiu como resposta aos problemas com a CLL. Como a fase estacionria quimicamente ligada

superfcie do suporte, no h mais solubilidade da fase estacionria na fase mvel.

O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio. Por outro lado, como esta fase estacionria tambm apresenta influncia de grupos ativos (polares) da superfcie (isto , tambm ocorre o mecanismo de adsoro), a maioria dos pesquisadores considera esta tcnica um mtodo separado.

Subdiviso da cromatografia por partio.

O mecanismo de separao da cromatografia lquido slido (CLS), ou adsoro, se baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). O equilbrio estabelecido :
ADSORVENTE

SOLVENTE

SOLUTO

Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (por exemplo: slica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel; por isso, no sero retidos.

Na cromatografia por troca inica (CTI), a fase estacionria possui grupamentos inicos quimicamente ligados que podem ser trocadores de ctions ou de nions. Esses grupamentos apresentam contra-ons que so deslocados pelos ons da amostra.

FIGURA 3:Cromatograma de ons de uma mistura de nions. FONTE: SKOOG ,2007

FIGURA 4: Cromatograma de ons de uma mistura de ctions. FONTE: SKOOG ,2007

A cromatografia por excluso tem sua resoluo baseada no tamanho efetivo das molculas dos componentes da amostra em soluo. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que um material til.

O primeiro o inferior, chamado de limite de permeao, abaixo do qual todas as molculas de menor tamanho so igualmente difundidas dentro dos poros do material e o segundo o superior, chamado limite de excluso, acima do qual todas as molculas so muito grandes para penetrar nos poros.

FIGURA 5: Cromatograma por filtrao em gel para glicose (G), frutose (F) e sacarose (S) em sucos enlatados. FONTE: SKOOG ,2007

A cromatografia por afinidade envolve a ligao covalente de um reagente denominado ligante de afinidade a um suporte slido. Os ligantes de afinidade tpicos so anticorpos, inibidores enzimticos ou outras molculas que se ligam

reversivamente e seletivamente com as molculas do analito na amostra.

Quando uma amostra passa atravs da coluna, somente as molculas que se ligam seletivamente ao ligante de afinidade so retidas.

A cromatografia por afinidade apresenta uma extraordinria seletividade como sua vantagem principal. O seu principal uso no isolamento de biomolculas durante a etapa preparativa.

Um avano enorme tem sido realizado nos ltimos anos em relao separao de compostos que so

imagens
sobreponveis

especulares
um do outro,

noos

chamados compostos quirais. Essas imagens especulares so denominadas enantimeros.

FIGURA 6: Cromatograma de uma mistura racmica de ster 1 de N-(1-Naftil)leucina em uma fase estacionria quiral de dinitrobenzenoleucina. Os enantimeros R e S so muito bem separados. FONTE: SKOOG, 2007

Os aditivos na fase mvel ou fases

estacionrias quirais so requeridos

para essas separaes.

Caractersticas de ambos os mtodos Eficientes, altamente seletivos, amplamente aplicados

Necessitam de uma pequena quantidade de amostra Podem ser no destrutivos da amostra Prontamente adaptados anlise quantitativa

Vantagens da CLAE Pode separar compostos no-volteis e termicamente instveis Pode ser aplicada de forma geral a ons inorgnicos

Vantagens da CG Equipamento simples e de baixo custo Rpida Resoluo incomparvel (com colunas capilares) Fcil de ser interfaceada a espectrmetros de massas

rea do pico ~ conc. do analito

Pratos tericos: n1 = 16 (tr,1/w1)2 Resoluo: Rs = 2,0 (tr,2 tr,1)/ (w1 + w2) Sendo condies timas: Rs > 1,5

Lavar um sistema com tampo usando orgnico puro: precipitao. Injetar amostras que podem precipitar na fase mvel: testar miscibilidade. Usar HCl, H2SO4 ou CCl3 degradado em sistema de ao inox: corroso do sistema. Deixar a bomba trabalhar seca: danificao dos selos.

Usar fita de Teflon para vedar conexes: sem efeito e pode causar entupimento.
Deixar o sistema parado com fase mvel contendo tampo ou cidos/bases fortes: cristalizao = danificao dos selos da bomba, injetor, entupimento do detector. PERDER A PACINCIA!!!!

COLLINS, C. H. & GUIMARES, L. F. L., Cromatografia lquida de alta eficincia. In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introduo a Mtodos Cromatogrficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, So Paulo, 1988, p 179 - 243. SKOOG, D. A. & LEARY, J. J., High-Performance liquid Chromatography In: Principles of Instrumental Analysis, 4 ed., Harcourt Brace College Publishers, Flrida, 1992, p 628 - 669. D. C. HARRIS. Anlise Qumica Quantitativa, LTC, Rio de Janeiro, 2005.