H.

FREDY ZEGARRA ARAGON

 QUE ES LA APOPTOSIS?
Por qu se dice que es una muerte celular programada ?

IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS
a) Mantencin de un nmero constante de clulas, mediante la eliminacin de las redundantes (tejidos sujetos a un activo recambio
celular: hgado, mdula sea y mucosa del tracto digestivo ), permite un balance entre proliferacin y muerte celular

b) Eliminacin de clulas potencialmente peligrosas. ( que pueden

desarrollar un proceso maligno.)

c) Funcin inmune: interviniendo en los mecanismos de defensa

especialmente en infecciones virales (donde clulas infectadas sufren apoptosis inducida por linfocitos evitando la replicacin viral y por lo tanto la propagacin de la infeccin.)

d) Remodelacin de tejidos embrionarios y organognesis:

Durante la gestacin se produce un exceso de neuronas : 50% son eliminadas por apoptosis, quedando el resto para constituir el SNC. La apoptosis tambin participa en la involucin de rganos como el timo en la pubertad, cambios celulares que inician la menstruacin y en las glndulas mamarias cuando termina la lactancia

Clula sana

APOPTOSIS
Injuria La clula intenta reparar errores

Errores genticos resultado de la injuria

Todos los errores reparados

Algunos errores permanecen

Injuria adicional

La clula programa su muerte va Apoptosis

Clula incapaz de reparar errores

TABLA N 1.- Diferencias entre los cambios morfolgicos que ocurren en la necrosis celular y la apoptosis celular

NECROSIS
Clula hinchada Orgnulos daados Cromatina alterada Clula lisada Orgnulos destruidos Cromatina destruida

APOPTOSIS
Clula encogida Orgnulos no daados Cromatina marginada Cuerpos apoptticos Orgnulos intactos Cromatina fragmentada

Contenido celular liberado Inflamacin Fagocitosis

Contenido celular retenido Fagocitosis No inflamacin

CARACTERISTICA
Participacin Celular Volumen celular Cromatina Nuclear Nucleo ADN ARN Ribosomal Orgnulos Aumenta

NECROSIS
Pasiva, carente de control gentico Condensacin laxa y localizacin difusa Fragmentado Fragmentacin irregular , patrn de barrido Degradacin irregular Se hinchan y tienden a fusionarse con lisosomas Se reduce

APOPTOSIS
Activa, controlado por un programa gentico Condensacin compacta con marginizacin nuclear Fragmentado Fragmentacin internucleosomal, patrn de escalera Fragmentacin regular, aparicin de bandas especficas Permanecen ntegros y no se fusionan con lisosomas

Membrana celular
Citoesqueleto Citoplasma Activacin de proteasas Estrs Oxidativo Metabolismo lipdico Reaccin infamatoria Cicatrizacin

Conserva asimetra de fosfolpidos y se pierde la integridad

Se desorganiza Se vierte al espacio intersticial Inespecfica y asociada a disfuncin lisosomal Presente slo en etapas tardas Activacin inespecfica de fosfolipasas Presente Presente a menudo con fibrosis

Aparicin de fosfatidil serina en la lmina extracelular y se conserva la impermeabilidad

Conserva su estructura Se conserva en los cuerpos apoptticos Especfica de la familia de las caspasas Presente desde etapas tempranas Produccin de Ac. Araquidnico , Ceramida y sus metabolitos derivados Ausente Ausente

Deshidratacin Celular

Cuerpos Apoptticos

APOPTOSIS
Condensacin de la cromatina Fragmentacin Nuclear Preservacin de la integridad de la membrana

Hinchamiento de clula y mitocondrias

Ruptura de la membrana plasmtica

NECROSIS

TABLA I. ALGUNOS FACTORES MODULADORES DE LA APOPTOSIS.

FACTORES EXTERNOS
A) Estimulantes de las apoptosis
Radiaciones ionizantes, radicales reactivos de oxgeno (ROS),
Lipoprotenas de baja densidad oxidadas. Drogas citotxicas (agentes alquilantes, antimetabolitos, antagonistas hormonales, glucocorticoides, ciclosporina A). Citocinas (TNF, TGF-b, IL-1b). Receptores transmembrana (receptor Fas/APO, rTNF, rNGF, rIFN-g).

B) Supresores de la apoptosis
Factores trficos de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-6, CSF, EGF).

FACTORES GENTICOS
A) Genes estimulantes de apoptosis:
ced-3, ced-4 (C. elegans), p53, lpr, Bax (mamferos), Bcl-xS, cmyc.

B) Genes supresores de apoptosis:

ced-9 (C. elegans), Bcl-2 (mamferos), Bcl-xL.

COMPONENTES PRINCIPALES DE LA APOPTOSIS

( PROTEINAS INVOLUCRADAS EN LA APOPTOSIS)

PROTEINAS ADAPTADORAS : FADD, TRADD, TRAF, RAIDD

PROTEINAS EFECTORAS :: Caspasas

aa aa aa aa aspartato aa aa aa aa aa .

PROTEINAS REGULADORAS :: Familia Bcl-2

CASPASAS SEGN SU FUNCIN

Inflamatorias: Participan en la maduracin de
citoquinas, como IL-1 e interfern (caspasas 1,4, y 5).

Efectoras: Participan en la degradacin de sustratos

apoptticos (caspasa 3 CPP32, caspasas 7 y 2 y CED-3).

Reguladoras: (caspasas 6 y 9 y caspasa 8, FLICE),

activan a las caspasas efectoras.

TABLA 2.- Protenas sustrato (blanco) de las caspasas

Protena blanco Sitio de hidrlisis PARP1 UI-70 Kda2 DNA-PKCS3 SREBP D4-GDI PKC-d Pro-IL1 C1 y C24 Laminina A y B Gas2 Fodrina Actina G NuMa
1Poli

Caspasa

Funcin de la protena blanco

DEDY-G DGPD-G DEVD-N DEPD-S DELD-S DMQD-N YVHD-A ? VEID-N SRVD-G DETD-S LVVD-N ?
2Pequea

3y7 3 3 3y7 3 3 1 3y7 6 ? ? ? ?

4Protena

Reparacin del ADN Procesamiento del ARN Reparacin de brechas en el ADN de doble cadena Protena que se une a elemento regulado por esterol Regulador de Rho (GTPasa) Degradado a su forma activa en apoptosis Degrada a citocina activa Procesamiento del pre-ARNm (HnRNA) Mantenimiento de la forma de la membrana nuclear Componente del sistema microfilamento Estructura del citoesqueleto asociado a membrana Estructura del citoesqueleto Mantiene la estructura nuclear
3Protena

(ADP-Ribosa) Polimerasa

ribonucleoprotena de de 70 Kda heteroribonuclear

Kinasa ADN dependiente

D(asp), E(glu), G(gli), H(his), I(Ile), L(leu), M(met), N(Asn), P(Pro), Q(gli), R(Arg), S(Ser), T(Thr), V(val), Y(Tyr).

Nombre

Dominios

Anclaje a

Funcin

membrana

Subfamilia Bcl-2
Bcl-2 Bcl-x1 Bcl-w Mcl-1 A1
BH4, BH3, BH1, BH2 BH4, BH3, BH1, BH2 BH4, BH3, BH1, BH2 BH3, BH1, BH2 BH1, BH2 Si Si Si Si No Antiapopttica Antiapopttica Antiapopttica Antiapopttica Antiapopttica

TABLA 2.- Clasificacin de los miembros de la Bax familia Bcl-2

Subfamilia Bax
BH3, BH1, BH2 Si Proapopttica

Bak
Bok

BH3, BH1, BH2

BH3, BH1, BH2

Si
Si

Proapopttica
Proapopttica

Subfamilia BH3
Bik Blk Hrk
BH3 BH3 BH3 Si Si Si Proapopttica Proapopttica Proapopttica

BNIP3
Bim L
Tomado de Adams y Cori, 1998

BH3
BH3 BH3 BH3

Si
Si No No

Proapopttica
Proapopttica Proapopttica Proapopttica

Bad Bid

FASE DE ACTIVACION
Activacin de Receptores TNF-I, APO/FAS o CD40 Activacin de Caspasas 8, 10 y 1. Produccin de cido araquidnico y ceramida

FASE DE EJECUCION
Produccin de estrs oxidativo. Cada transitoria del potencial de membrana mitocondrial. Liberacin del Cit C. Activacin de Caspasas 3, 6 y 7. Participacin de bax y Ced-4

Membrana celular

Receptor

M I T O CO N D R I A
Ligando

MUERTE CELULAR
Bloqueo por Bcl-2

MEDIO EXTRACELULAR

Bloqueo por cerpinas (crm-A)

CITOPLASMA

Representacin esquemtica de las fases de activacin y ejecucin durante la muerte por apoptosis . La activacin del receptor de muerte como el receptor de TNF tipo I, el antgeno APO/FAS o el CD40, encienden el programa de muerte. La activacin de caspasas tanto en la fase de activacin como de ejecucin , amplifican el proceso antes y despus de la induccin de cambios en el funcionamiento mitocondrial. Cada fase va acompaada de cambios bioqumicos que participan en la muerte celular.

AUSENCIA DE FACTOR TRFICO: Activacin de Caspasas

Receptor de Factor Trfico

Membrana citoplasmtica

Corte se sustratos

MUERTE

PI-3 K
12-3-3
Akt-Kinasa Procaspasa-9

Procaspasa-3

Caspasa-3

Caspasa-9

CITOSOL
Membrana Mitocondrial Externa

Apaf 1 Cit C
Bad

Cit C

Cit C

Iones

Espacio Intermambrana

Cit C

LA FALTA DE FACTORES TRFICOS PROMUEVE LA ACTIVACIN DE LAS CASPASAS

Figure 23-50. Current models of the intracellular pathways leading to cell death by apoptosis or to trophic factormediated cell survival in mammalian cells. The details of these pathways in any given cell type are not yet known. (a) In the absence of a trophic factor. Bad, a soluble pro-apoptotic protein, binds to the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xl, which are inserted into the mitochondrial membrane. Bad binding prevents the antiapoptotic proteins from interacting with Bax, a membrane-bound pro-apoptotic protein. As a consequence, Bax forms homo-oligomeric channels in the membrane that mediate ion flux. Through an as-yet unknown mechanism, this leads to the release of cytochrome c from the space between the inner and outer mitochondrial membrane. Cytochrome c then binds to the adapter protein Apaf-1, which in turn promotes a caspase cascade leading to cell death.

PRESENCIA DE FACTOR TRFICO: Inhibicin de la activacin de Caspasas

Factor Trfico

Receptor de Factor Trfico Membrana citoplasmtica

PI-3 K
Procaspasa-3

12-3-3 ATP

Akt-Kinasa

P
Bad

ADP Procaspasa-9

CITOSOL
Membrana Mitocondrial Externa

Apaf 1

Cit C

Espacio Intermambrana

Cit C

LA PRESENCIA DE FACTORES TRFICOS INHIBE LA APOPTOSIS

Figure 23-50. (b) In the presence of a trophic factor such as NGF. In some cells, binding of trophic factors stimulates PI-3 kinase activity, leading to activation of the downstream kinase Akt, which phosphorylates Bad. Phosphorylated Bad then forms a complex with the 14 - 3 - 3 protein. With Bad sequestered in the cytosol, the antiapoptotic Bcl-2/Bclxl proteins can inhibit the activity of Bax, thereby preventing the release of cytochrome c and activation of the caspase cascade. [Adapted from B. Pettman and C. E. Henderson, 1998, Neuron 20:633.] (Fuente: Lodish et al., 2000)

TNF

Toxinas, hormonas, Factores de crecimiento, citoquinas, oxido ntrico, etc

TNFR
RAID

RAIDD FADD Caspasa-2

TRADD

TRAF p50 p65

IkB

Activacin de esfingomielinasa Bcl-2

p50 p65 CERAMIDA JNK/SAPK

Caspasas Efectoras

NF-kB

Supervivencia celular

Caspasa-3 Caspasa-6 Caspasa-7

Endonucleasas

APOPTOSIS
Fragmentacin del ADN

FIGURA N 1. Apoptosis inducida por Factor de Necrosis Tumoral

Fas L

Fas
FLIP FADD
Pro-Caspasa 8

Smac/Diablo

IAP

ProCaspasa-3

FIGURA N 2. Apoptosis inducida por Fas

Caspasa-3

p18 p11 p11 p18 Caspasa-8

Cit C
Bcl-XL

Apoptosoma
ProCaspasa -9 ProCaspasa -9

Cit C

Bid

APAF - 1 Cit C

dATP
Caspasa 9
Caspasas Efectoras

Caspasa-3 Caspasa-6 Caspasa-7

APOPTOSIS

Clula Efectora Citoltica (lifocitos T citotxicos, y NK)

Degranulacin
Ca2+ Ca2+ Ca2+

Granzima B Perforina

ProCaspasa-3

Liberacin de Citocromo C

Granzima B
C
A I

A
Caspasa-3

CAD D

APOPTOSIS

HMG1 HMG2

Topo II

Clula tumoral o infectada por virus

APOPTOSIS

Fragmentacin del DNA

FIGURA N

Induccin de apoptosis por Granzima A

ADN

Luz UV Radiacin Luz UV Stress Radiacin Quimioterapia

MITOCONDRIA

Cit C

Complejo del Poro Complejo del Poro de Permeabilidad de transicional: Permeabilidad transicional: ANT, VDAC ANT, VDAC
transportador de nuclotidos de adenina canal de aniones dependiente de voltaje

ProCaspasa-9

Cit C

Cit C
dATP

APAF - 1
ProCaspasa-9

Cit C

Daos Redox de desintoxicacin Drogas / Xenobiticos

APOPTOSIS

Caspasa 9

Figura N Va Intrnseca de la Apoptosis

Reparacin del ADN daado

Luz UV Agentes qumicos

Transcripcin del gen IGF-BP3. Inhibe seales antiapoptticas

(1)

p53
GADD45
(3) (2)

(4)

Transcripcin del gen Bax. Activa la apoptosis

Transcripcin del gen GADD45

E2F

Transcripcin del gen p21

CkL
(-)

Complejo Ciclina / CdK Bloqueo de la progresin del Ciclo Celular

Rb

CdK

Figura N . p53 y detencin del Ciclo Celular. Mecanismos que reconocen el ADN daado, detienen la degradacin de p53 y modifican a la protena p53. (1). P53 estimula la transcripcin de p21 (2) y GADD45 (3). El producto de p21 inhibe el complejo Ciclina / CDK, lo cual evita la fosforilacin de Rb (Retinoblastoma) la cual continua para inhibir el Factor de transcripcin E2F, bloqueando por lo tanto la progresin celular a travs del Ciclo Celular (evitando que entre a la Fase S). p53, tambin estimula la transcripcin del gen GADD45 (Grow Arrest and DNA Damage) que cofifica para una enzima reparadora del ADN. Si el dao no es reparado, los genes apoptticos son activados (4).

Ligando de muerte Ej. FasL

Deprivacin de citoquinas

DNA daado p53 Protenas BH3 solamente

Drogas Citotxicas

Receptor de muerte Ej. Fas

Pro-sobrevivencia Miembros de la familia Bcl-2 Adaptadores

Bax/Bak Dao mitocondrial Liberacin de citocromo c Apaf-1 Activacin de caspasa 9 IAPs

FADD Activacin de caspasa 8

Activacin de caspasas iniciadoras

Activacin de caspasas efectoras

FLIP
FIGURA N

Smac/ Diablo

Protelisis de protenas vitales

APOPTOSIS

ENFERMEDAD Por inhibicin de apoptosis Cncer Colorrectal Neuroblastoma Glioma Leucemias y linfomas Hgado Prstata Enfermedades Autoinmunes Miastenia grave Lupus eritematoso sistmico Enfermedades inflamatorias Asma bronquial Enfermedad inflamatoria intestinal Inflamacin pulmonar Infecciones vricas Adenovirus Baculovirus Por Exceso de Apoptosis Sida Linfocitos T Enfermedades neurodegenerativas Enfermedad de Alzheimer Esclerosis lateral amiotrofica Enfermedad de Parkinson Enfermedades hematolgicas Anemia aplasica Sndrome mielodisplasico Dao Tisular Infarto de miocardio Accidente cerebrovascular

TABLA N 6. 4.- Enfermedades asociadas a apoptosis

Tomado de Ramrez Chamond R. y col.

Retinitis pigmentosa Epilepsia

Linfocitopenia T CD4+ Deficiencia de G6PD Dao isqumico renal Rin poliquistico

TABLA N 6.5. Tcnicas utilizadas para la determinacin de

METODO DESCRIPCION

apoptosis

Microscopia ptica y electrnica

Cambios

morfolgicos:

Condensacin

de

la

cromatina, encogimiento citoplasmtico, etc. Electroforesis del DNA en geles de Se observa el patrn en escalera del DNA degradado. agarosa.

Citometria de flujo
Cambios en el ncleo TUNEL Adicin enzimtica de nucletidos marcados con fragmentos de ADN de doble hebra.

Ioduro de propidio

Entra en las clulas por un aumento de la

permeabilidad de la membrana.

Hoescht 33342

Entra en todas las clulas. Tie el ncleo y permite observar la condensacin de la cromatina

Cambios en la membrana
Anexina V Tiene una alta afinidad por la fosfatidil serina en la superficie celular

PRINCIPALES TECNICAS USADAS PARA LA DETECCIN DE APOPTOSIS

TECNICA Microscopa ptica y electrnica DESCRIPCION Cambios morfolgicos (condensacin cromatnica, encogimiento citoplasdmtico

Electroforesis del ADN

TUNEL ISNT

Patrn en escalera de ADN degradado en uno o mltiples nucleosomas.

Adicin enzimtica TdT de nucletidos marcados en fragmentos de ADN de una doble hebra. Adicin enzimtica (ADN Polimerasa I de nucletidos marcados en fragmentos de ADN de una sola hebra.

Tincin con Yoduro de propidio

Hoescht 33342 Anexina V-FITC

Entra en la clula con aumento de la permeabilidad de la membrana (clulas necrticas y fases tardas de la apoptosis).
Entra en todas las clulas y tie el ncleo permitiendo observar una condensacin cromatnica Detecta fosfatidil serina en la superficie celular para la cual tiene gran afinidad la anexina