Biotecnologa

UNASAM Facultad de Ingeniera de Industrias Alimentarias

Huaraz, Setiembre 2012

Es la aplicacin de la ciencia y la ingeniera en el uso directo o indirecto de organismos vivos o partes de ellos, en sus formas naturales o modificadas para la produccin de bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales.

Las tcnicas biotecnolgicas utilizadas se agrupar en tres grandes reas:

Fementaciones: involucra el uso de microorganismos para la obtencin de productos mas estables y con mejores cualidades nutritivas u organolepticas. Cultivo de tejidos: Trabaja a un nivel superior a la clula e incluye clulas, tejidos y rganos que se desarrollan en condiciones controladas.
Tecnologa del ADN: Involucra la manipulacin de genes a nivel del ADN, aislamiento de genes, su recombinacin y expresin en nuevas formas, etc.
ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

La lista de usos y aplicaciones de la biotecnologa aumenta da con da (medicina, ganadera, agricultura, etc). Su impacto en la sociedad es tan grande, que incluso se prev que sta ser la revolucin tecnolgica de mayor envergadura para la humanidad en el sigo XXI.

Biotecnologa
El desarrollo de la ciencia bsica y el entendimiento de los procesos que gobiernan la biologa y a los seres vivos es fundamental.

Biotecnologa
Con el desciframiento de la estructura del ADN, los avances en biologa y bioqumica y, por ende, en la biotecnologa, han dado un salto cualitativo sin precedentes.

DEFINICIN

Microbiologa Biologa Molecular Ingeniera Gentica ORGANISMOS

BIENES

Biotecnologa
PARTES
Bioqumica Bioingeniera Medicina

SERVICIOS

HOMBRE

Biotecnologa
La biotecnologa moderna utiliza diversas tcnicas para acercarse a su objeto de estudio:

Microbiologa Ingeniera gentica

Biologa molecular
Bioqumica Genmica Bioinformtica Protemica

Se utiliza en:
Industria Alimenticia: Arroz dorado Industria Farmacolgica: Antibiticos Agroindustria: Nuevas variedades Minera: Biolixiviacin bacteriana Medicina: Marcadores moleculares

Genmica:
En estos momentos es una promesa con grandes proyecciones cientficas y comerciales.

Sin un conocimiento y desarrollo en ciencias bsicas no es posible realizar desarrollos en biotecnologa. Invertir en educacin cientfica es el pilar de la generacin de nuevos desarrollos biotecnolgicos.

HISTORIA

Robert Hooke 1664

Una de las pimeras descripciones de una clula eucariota.

L. Pasteur 1864 derroc la teora de la generacin espontnea y produjo varias vacunas

R. Koch 1868 escribi los postulados de Koch para la clasificacin y cultivo de bacterias.

Ferdinand Cohn 1872 escribi un tratado que dio origen a la Microbiologa como ciencia.

1928 Griffith encontr que bacterias no patgenas podan ser transformadas a patgenas usando restos celulares de otras bacterias 1940s Avery encontr que el factor transformante era el ADN, lo cual dio inicio a la era de la Microbiologa Molecular. 1953 James Watson and Francis Crick dilucidaron la estructura del ADN

1970s Fred Sanger hizo posible la secuenciacin y Kary Mullis la amplificacin de DNA (PCR). 1980s Tecnologa del DNA recombinante y la Biotecnologa moderna y sus productos (Insulina, Francisco Bolvar).

1980 Moseley realiz el primer diagnostico molecular identificando una cepa patgena de E. coli. (E. coli 0157:H7)

En la actualidad ni todo el avance en la biotecnologa ni en la microscopa, han hecho posible el poder crecer al 98% de los microorganismos y las clulas en un medio de cultivo.

Sin embargo, estos avances s han hecho posible cambiar una caja Petri y un medio de cultivo, por un tubo Eppendorf y una reaccin de PCR, evitando la necesidad de cultivar al microorganismo en cuestin.

PROTENA

FUNCIN

INSULINA

GLUCOSA

APLICACIONES

AGRICULTURA a).-Produccin de plantas resistentes a plagas, enfermedades, sequas y sal b).-Propagacin en masa de clones vegetales c).-Desarrollo de insecticidas biolgicos d).-Mejoramiento de caractersticas nutricionales

GANADERA

a).-Control de la fertilidad
b).-Produccin de ganado genticamente mejorado c).-Diagnstico de enfermedades bacterianas

APLICACIONES
MEDICINA

a).-Produccin de vacunas y hormonas en microorganismos recombinantes

b).-Diagnstico molecular de enfermedades c).-Terapia gnica de enfermedades hereditarias

AMBIENTE a).-Biorremediacin de agua y suelos contaminados con: -petrleo

-solventes
-desechos orgnicos -metales

LA BIOTECNOLOGA COMO UN MEDIO ADECUADO Y SEGURO PARA ALIVIAR ENFERMEDADES Y MITIGAR EL HAMBRE

Tratamiento para la Diabetes mellitus Tratamiento para el Cncer Terapia Gnica

Maz transgnico resistente a plagas

Arroz con sobreproduccin de Vitamina A

Plantas resistentes a sequas

LA HUMANIDAD SIN BIOTECNOLOGA

Periodo de vida reducido por la falta de: vacunas

medicamentos
alimentos suficientes contaminacin excesiva diagnstico oportuno de enfermedades infecciosas

REALIDADES Y MITOS

REALIDADES -Produccin de Insulina, Hormona de Crecimiento, Interfern -Biorremediacin de agua y suelos contaminados -Produccin de plantas resistentes a enfermedades y a sequa -Diagnstico oportuno de enfermedades infecciosas

MITOS

-Carne, frutas y verduras txicos

-Leche y agua contaminada -Vacunas y hormonas inseguras

-?

NORMATIVAS Y TICA EN BIOTECNOLOGA

-Cada pas tiene sus normas de lo que se
puede y no se puede hacer. -Colombia tiene su normativa con respecto al maz transgnico -La utilizacin de clulas embrionarias para la clonacin de humanos -La ley para el uso y produccin de organismos transgnicos -La ley para el aprovechamiento y proteccin de la biodiversidad

-La tica depende de cada quien: principios morales y religiosos

Ingeniera Gentica y Biotecnologa

Ingeniera gentica:
modificacin deliberada de la informacin gentica de un organismo que resulta en un cambio heredable de su genoma

Aplicaciones:
- medicina (diagnstico y caracterizacin de enfermedades) - agricultura (plantas transgnicas) - industria farmacetica (produccin de protenas con fines terapeticos) - industria alimentaria (mejoramiento de cepas, aditivos alimenticios (ej. vainillina)) - industria qumica (productos naturales, biopolmeros, etanol)

Biotecnologa
La produccin industrial de bienes o servicios por procesos que utilizan organismos, sistemas o procesos biolgicos

Ingeniera Gentica

Biotecnologa + Biotecnologa = Molecular

Biotecnologa Molecular Microbiana

La produccin de insulina humana en E. coli (1980) y su aprobacin para uso clnico (1982) revolucionaron la biotecnologa
Esto fue posible por el desarrollo de tcnicas que permitieron -transferir informacin gentica de un organismo a otro -expresar esa informacin en el organismo husped

Biotecnologa Molecular Mtodo tradicional

Tcnicas que permitieron transferir informacin gentica de un organismo a otro

Cmo se logra introducir y perpetuar ADN forneo en otro organismo? Necesidad de un vehculo que lleve el ADN y sea capaz de autoreplicarse. - desarrollo de vectores

Cmo se logra introducir ADN forneo en ese vector?

- el uso de enzimas de restriccin permite generar molculas recombinantes Cmo se introduce el vector portador del ADN de inters en la clula husped? - desarrollo de tcnicas de transformacin

Las enzimas de restriccin reconocen secuencias palindrmicas especficas generando extremos complementarios que pueden ser ligados por medio de una ligasa
EcoRI reconoce la secuencia GAATTC y corta el ADN

Dos molculas de ADN cortadas con la misma enzima de restriccin pueden ser unidas por una ligasa generando una molcula de ADN recombinante

Los vehculos o vectores de clonado deben ser capaces de portar secuencias de ADN forneo y de mantenerlo en forma estable en la clula husped.

Vectores de clonado:

- plsmidos (10 kb) - bacterifagos (20 kb) - csmidos (50 kb) - YAC (200 - 800 kb) (yeast artificial chromosome)

Qu precisa tener un vector para mantenerse estable en la clula husped?

Caractersticas generales de los plsmidos como vectores de clonado: Sitios de restriccin nicos

Marcadores genticos
(permiten seleccin de transformantes)

pBR322 4361 bp

Orgen de replicacin Tamao pequeo

(mayor eficiencia de transformacin)

Proceso de clonado: -se corta el ADN de inters y el vector con la misma enzima de restriccin -se ligan los fragmentos generndose un vector recombinante -se transforman clulas del organismo husped
La presencia de marcadores - se seleccionan las que portan genticos, ej resistencia a el plsmido antibiticos, permite seleccionar las clulas que portan el plsmido

Transformacin: - CaCl2 - electroporacin

Seleccin de transformantes que portan el plsmido

La seleccin se realiza en medio slido La seleccin puede basarse en alguna caracterstica aportada por el plsmido: resistencia a antibiticos
caractersticas nutricionales (marcadores auxotrficos) ejemplo: sntesis de aminocidos resistencia a compuestos txicos

La seleccin permite crecer a las que portan un plsmido con el marcador gentico adecuado. El medio puede hacerse diferencial para distinguir un plsmido recombinante del plsmido original, o puede hacerse una segunda seleccin.

Los marcadores genticos permiten la seleccin de transformantes:

En pBR322 la insercin de un molcula de ADN resulta en la prdida de la resistencia a Ampicilina (a) o Tetraciclina (b)

a b

Otros vectores slo presentan resistencia a un antibitico que permite su seleccin y otro mecanismo para ver presencia de inserto

Bacterifagos: ejemplo fago lambda modificado

Caractersticas de los csmidos como vectores de clonado:

a) derivados del fago l, sin regiones codificantes b) permite el clonado de grandes fragmentos de ADN c) la presencia de sitios cos permite su encapsulamiento in vitro d) La infeccin (transduccin) es ms eficiente que la transformacin e) Se mantiene como plsmido en E. coli

Cromosomas artificiales como vectores de clonado: Los YACs (yeast artificial chromosomes) fueron muy usados para el clonado de ADN con fines de secuenciacin Caractersticas:

- muy estable (se replica como un cromosoma)

- permite el clonado de grandes molculas de ADN

Tambin existen los BAC (bacterial artificial chromosome)

Cmo identificamos la secuencia de ADN que nos interesa clonar? - secuenciado en el caso de algunos organismos la informacin de inters existe pues se ha secuenciado el total o parcialmente el genoma de dicho organismo - genotecas coleccin de vectores representativos de todo el genoma del organismo en estudio Cmo aislamos el gen o la regin especfica que nos interesa? - amplificacin de genes por la reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Genoteca: - se fragmenta randmicamente el ADN del organismo en estudio y se clonan los fragmentos - representa todo el genoma de un organismo - las colonias obtenidas se analizan en bsqueda del gen de inters

Existen varios mtodos para rastrear una genoteca

a) Por hibridacin con sondas de ADN sonda: oligonucletido especfico para la secuencia buscada

Otros mtodos de rastreo se basan en la expresin de la protena codificada por el gen de inters: b) inmunodeteccin: utilizacin de un anticuerpo especfico para la protena de inters asociado con un anticuerpo que de una reaccin colorimtrica c) Deteccin de una actividad enzimtica caracterstica

Una vez que se identifica el gen o la secuencia de inters se lo puede amplificar y aislar por la reaccin en cadena de la polimerasa PCR Este mtodo permite obtener grandes cantidades de ADN con la secuencia deseada Mediante este mtodo se pueden introducir, en ambos extremos de la secuencia amplificada, secuencias especficas para enzimas de restriccin que faciliten su clonado

Hemos visto a) como clonar fragmentos de ADN e introducirlos en una clula husped

b) como identificar y aislar el gen o la secuencia de inters

Cmo se logra la expresin de dicha informacin gentica en la clula husped de forma que esta produzca la protena de inters?

Aplicaciones de la Expresin de Protenas Con fines comerciales - industriales - terapetica Mejoramiento gentico de cultivares: transgnicos Terapia gnica

Para que una protena sea expresada en un husped dado el gen debe ir acompaado de las secuencias especficas que permitan su transcripcin y traduccin En procariotas: Seal de Sitio de unin Promotor terminacin del ribosoma

En eucariotas es similar pero con los componentes que permiten la transcripcin y traduccin eucariota

Estas caractersticas son aportadas en un Vector de Expresin Debe contener: - un promotor - un terminador - un sitio de unin a ribosoma (en procariotas) - sitios de corte de enzimas de restriccin en posicin adecuada - marcadores genticos
(seleccin de transformantes)

- orgen de replicacin - tamao pequeo

La expresin de genes eucariotas requiere el procesamiento de intrones, proceso que no se da procariotas (E. coli)

Se debe clonar una copia del gen de la cual se hayan removido los intrones

Para ello se utiliza la enzima transcriptasa reversa

ARN ADNs ADNd

El clonado y la expresin de protenas heterlogas no est limitado a procariotas como hospederos, tambin se han utilizado eucariotas (Ej. S. cerevisiae, P. pastoris, A. niger) La ingeniera gentica tambin se aplica a plantas y animales Los principios bsicos son similares La ingeniera gentica no queda restringida a la expresin de protenas sino que tambin utiliza otras herramientas como: - delecin de genes

- desregulacin de rutas metablicas

- generacin de diversidad

Otras tcnicas utilizadas en ingeniera gentica: Mutagnesis sitio dirigida:

Mutagnesis dirigida en casette: delecin, interrupcin o desregulacin de genes

Tendencias actuales:
a) produccin heterloga de protenas ( industria farmacetica: protenas con aplicacin vacunas)

terapeticas,

b) ingeniera metablica (industria alimenticia: produccin de vino, aditivos, conservadores) (industria qumica: produccin de etanol, biopolmeros) c) evolucin dirigida de protenas (industria qumica: desarrollo de lipasas o estearasas termoestables, desarrollo de enzimas con tolerancia a solventes)

Algunas de las Aplicaciones en Medicina

Aplicaciones: produccin comercial de vacunas, frmacos y agentes de diagnstico

Vacunas: Antgeno de superficie - Hepatitis B Malaria protena de la envuelta de HIV-1 Factor de crecimiento epidrmico Insulina Factor de crecimiento de plaquetas Factor de coagulacin VIIIa Antgeno HIV-1 Hepatitis C

Frmacos:

Agentes de diagnstico:

Produccin de Indigo en E. coli recombinante que expresa una dioxigenasa (naphtalene dioxygenase) de Pseudomonas sp.

Ingeniera Metablica: Alteracin de rutas metablicas existentes para: a) favorecer la produccin del compuesto de inters
materia prima
Diverge materia

b) introduccin de nuevas rutas metablicas Ej: Produccin de vainillina a partir de glucosa en E. coli

prima a productos secundarios

Delecin de genes
Producto deseado

La tecnologa de evolucin dirigida de protenas se ha utilizado con xito en el mejoramiento de enzimas Ej. desarrollo de estearasas termoestables

Plantas transgnicas
Se han desarrollado muchas con distintos fines: - resistencia a insectos - resistencia a herbicidas

- resistencia a salinidad
- Resistencia a sequa - mejor calidad alimenticia Uso de Agrobacterium tumefaciens - clonado en plsmido Ti - la secuencia de inters pasa a la clula vegetal a travs de un proceso similar a la conjugacin bacteriana. Pasa el T-ADN lineal con capacidad de integracin (simil transposn)

El nivel de expresin depende del promotor y del nmero de copia del vector de expresin

Nmero de copia del vector de expresin: depende del orgen de replicacin que tenga puede ir desde una copia hasta cerca de 100 (1-4: bajo nmero de copia; 10-100: alto nmero de copia)
Promotores Constitutivos: siempre estn transcribindose Regulables: se mantienen apagados y son inducidos por algn cambio en el medio (inductor, cambio de T) Fuerza del promotor: determina el nivel de transcripcin La mejor produccin de protena no est necesariamente asociada a un promotor fuerte y un vector con alto nmero de copia. Si el sistema es muy pesado para la clula, esta lo pierde y la poblacin que lo pierde crece ms rpido disminuyendo el rendimiento

Posibles sistemas de expresin Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Picchia pastoris Baculovirus Cultivos celulares (lneas celulares de mamferos) Animales o plantas transgnicos Criterios de seleccin de un sistema de expresin Rendimiento Facilidad de purificacin Necesidad de modificaciones post-traduccionales Preferencias de uso de codones Costos Diseo experimental

La ingeniera gentica tambin se aplica a plantas y animales Los principios bsicos son similares Ej: produccin de a-1AT en la leche de cabra u oveja

La biotecnologa puede ser clasificada en cinco amplias reas.

Biotecnologa en Salud Humana.( donde

se incluye la B. Alimentara)
Biotecnologa Animal.
Biotecnologa Industrial Biotecnologa Vegetal Biotecnologa Ambiental
ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

Desarrollo en tecnologas para el diagonstico de enfermedades infecciosas o de desordenes genticos.

LINEAS DE INVESTIGACIN:
Clonacin de clulas madre: James Thonson, Unv.

Wisconsin (1998).
Reprogramacin de cellas adultas sin necesidad de

clonar.
Esclarecimiento

y manipulacin del mecanismo gentico que dispara la formacin de rganos y extremidades en el embrin.
ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

Su aplicacin es dirigida a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, etc. reas en las cuales esta influyendo la biotecnologia para produccin animal
El uso de tecnologas reproductivas Nuevas vacunas y

Nuevas bacterias y cultivos celulares que producen

hormonas.
ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

Biotecnologa Industrial es la disciplina que hace uso de

los conocimientos cientficos campos de biologa

molecular, microbiologa, bioqumica e ingeniera

bioqumica,

para

contribuir

al

desarrollo

de

la

agricultura, la medicina y las ciencias ambientales

(Hernndez M 2000 www. Uprm.edu.es)

ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
BENEFICIOS
Alimentos con ms vitaminas, minerales y protenas, y menor contenido en grasas Cultivos ms resistentes al ataque de virus, hongos insectos sin la necesidad de emplear productos qumicos, lo que supone un mayor ahorro econmico y menor dao al medio ambiente

ENCONTRA
Aparicin de alergias insospechadas Desaparicin de avifauna que no se adapte a las nuevas condiciones de plantas mejoradas.

Mayor tiempo de conservacin de frutas y verduras Cultivos tolerantes al sequa y estrs

ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

La biotecnologa ambiental se refiere a la aplicacin de los procesos biolgicos modernos para la proteccin y restauracin de la calidad del ambiente. El uso de microorganismos en procesos ambientales se encuentra desde el siglo XIX. Hacia finales de 1950 y principios de 1960, cuando se descubri la estructura y funcin de los cidos nucleicos La biorremediacin (uso de sistemas biolgicos para la reduccin de la polucin del aire o de los sistemas acuticos y terrestres)

ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

Directiva del Consejo 90/219/CEE, de 23 de Abril de 1990, relativa a la utilizacin confinada de microorganismos modificados genticamente. Directiva del Consejo 90/220/CEE, de 23 de Abril de 1990, sobre la liberacin intencional en el medio ambiente de organismos modificados genticamente. Directiva 98/81/CE del Consejo, de 26 de Octubre de 1997 por la que se modifica

la Directiva 90/219/CEE relativa a la utilizacin confinada de microorganismos

modificados genticamente. Directiva 1999/10/CE de la Comisin de 8 de Marzo de 1999, por la que se

establecen excepciones a las disposiciones del artculo 7 de la Directiva

79/112/CEE del Consejo en lo relativo al etiquetado de los productos alimenticios.

ESPECIALIZACIN EN INGENIERIA AMBIENTAL

Cdigo de Nuremberg (Tribunal Internacional de Nuremberg) Publicado

en 1946 como respuesta a las atrocidades cometidas por los mdicos

investigadores nazis.Declaracin de Helsinki de la Asociacin Mdica

Mundial.
Recomendaciones para orientar a los mdicos en la investigacin con

seres humanos. Adoptado en 1964 y varias veces revisado. Ultima

revisin, ao 2000.
Principios de tica Mdica. Detallados en el texto de la Resolucin

37/194 adoptada por la Asamblea General de la Naciones Unidas en 1982.

Fin de la primera parte del Curso Gracias