UNIDAD II Separaciones

Cromatogrficas
Octubre 2009

Temas del Contenido

Principios y Generalidades 1. Definicin 2. Clasificacin 3. Principios bsicos
Cromatografa de Gases Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin

Principios

Historia

Fue inventada y denominada as, a principios del siglo XX por el botnico ruso Mikhail Tswett. Realiz una separacin de clorofilas y xantofilas con CaO. Viene del griego chroma que significa color y graphien que significa escritura.

Definicin
Mtodo de separacin en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria para separar los componentes de una mezcla.

Tcnicas manuales de laboratorio -Cromatografa de columna -Cromatografa de capa fina TLC Tnicas instrumentales -Cromatografa de gases GC -Cromatografa de lquidos LC -Cromatografa de lquidos de alta eficacia: HPLC Clasificacin de la Cromatografa segn Mecanismo de Separacin

- Cromatografa de Reparto - Cromatografa de Exclusin - Cromatografa de Adsorcin - Cromatografa de Intercambio Inico

TAREA: En que consiste cada una?

Cromatografa de Afinidad o de Exclusin Molecular

Cromatografa de Filtracin en Gel o de Adsorcin

Cromatografa de Intercambio Inico

La fase estacionaria Fase mvil

En cromatografa de lquidos (columna, capa fina, HPLC) la fase mvil es una mezcla de disolventes: ELUYENTE En cromatografa de gases la fase mvil es el GAS PORTADOR. Slidos muy porosos con capacidad adsorbente: Gel de slice (SiO2); Almina (Al2O3), Celita La superficie del gel de slice interacciona con los compuestos orgnicos mediante interacciones de carcter polar: Puentes de hidrgeno Interacciones electrostticas

Los compuestos ms polares interaccionan ms fuertemente con la slica

Naturaleza del eluyente:

Eluyentes polares: Rompen ms eficazmente las uniones de los compuestos con la fase estacionaria. Arrastran ms rpidamente a los compuestos. Eluyentes no polares: No rompen las uniones de los compuestos con la fase estacionaria. Arrastran muy lentamente a los compuestos.

Tendencias en las Fases mviles mas empleadas y en Compuestos a Separar

Cromatografa en Capa Fina

Se utiliza para separar molculas relativamente pequeas. Consiste en una fase estacionaria y una mvil. El principio es el mismo: La sustancia de inters se adherir a la fase estacionaria o se mover con la fase mvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

Fase estacionaria: Celulosa Almidn, Azucares, Gel de slice (silicagel), xido de aluminio (almina) , Carbn activo (carbn en polvo) Lo anterior unido a una superficie slida (vidrio, aluminio, plstico o papel)

Frente del Eluyente

Factor de Retencin

Punto de aplicacin

Influencia de la estructura de los compuestos en el Rf

Influencia del eluyente en el Rf Mezclas con mayor poder de elucin (ms polares): Arrastran mucho a los compuestos Rf mayor Mezclas con menor poder de elucin: Arrastran poco a los compuestos Rf menor

Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos: Mtodos qumicos. Mtodos fsicos.

Mtodos Qumicos. Utilizacin de reactivos reveladores como: Generales: Yodo, cido sulfrico. Especficos: 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos. El ms comn: aadir al adsorbente un indicador fluorescente. Empleo de cmara de Uv-Visible

Cromatografa en Columna

t0

t1

t2

t3

t4

El movimiento de los solutos slo puede ocurrir en la fase mvil, por lo que la velocidad media a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fraccin de tiempo que reside en esta fase.

Velocidades de migracin de los solutos.

La eficacia de una columna cromatogrfica para separar dos solutos depende, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos especies.

Esas velocidades estn determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios en funcin de las cuales las especies se distribuyen entre las fases estacionaria y mvil.
Constante de Distribucin: Equilibrio de distribucin para el soluto A: A movil A estacionaria La Constante de equilibrio para este proceso es:

CS K CM

Tiempo de Retencin:
Es el tiempo ( tR) que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de la concentracin del analito alcanza el detector. tR
Seal del Detector

tM

Cromatograma caracterstico para una muestra que contiene un solo analito.

Especie no retenida

Tiempo

tM es tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector, en algunas ocasiones se denomina tiempo muerto.

La velocidad de migracin de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las molculas de la fase mvil.

La velocidad lineal promedio de migracin del soluto v es:

L tR

La velocidad promedio u del movimiento de las molculas en la fase mvil es: L u tM

Tarea:
Investigar: Definicin de altura de plato

Resolucin de una columna

Cromatografa de Gases

Clase normal de los principales parmetros a considerar en una cromatografa en columna: tR, tM, a, K, k, Rs, N, H etc.

Cromatografa de Gases

Cromatografa de Gases
La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte. La fase mvil no interacciona con el analito, su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos: Cromatografa de Gas-Lquido Cromatografa de Gas-Slido

Cromatografa de gas-lquido El Fundamento es la separacin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquida inmovilizada sobre la superficie de un empaque slido inerte o en las paredes de una columna o capilar.

Cromatgrafo de Gases

Cromatgrafo de Gases

Gas Portador o de Acarreo

Gas de acarreo
El gas de acarreo o portador o fase mvil, es el que transporta a los compuestos a travs de la columna. Debe ser qumicamente inerte, puro (>99%), seco y se aconseja colocar un filtro de carbn activo y una trampa para humedad antes de la entrada del gas al instrumento. El tipo de gas acarreador depende de la velocidad requerida para el anlisis y el tipo de detector a emplear. Los ms utilizados son helio, nitrgeno, hidrgeno o una mezcla argn con 5 % de metano.

 Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (make-up). El make-up, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector. El sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares.

Inyectores

Inyectores

Cmara de Vaporizacin Instantnea

La cmara de muestra normalmente est a unos 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra

Columnas

Es donde ocurre la separacin y es el corazn de un cromatgrafo. Se utilizan dos tipos generales de columnas: las rellenas, y las abiertas o capilares. Varan de menos de 2m hasta 50 m o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundido, aluminio tefln. Columnas capilares de slice fundida recubiertas con poliimida. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. En la prctica se requiere una temperatura = o > al punto de ebullicin promedio de la muestra para obtener tiempos de elucin razonables.

Rellenas

o Empacadas

Las dimensiones van de 2 y 4.6 mm de dimetro interno (DI) y de 1/8 a 1/4 de pulgada de dimetro externo (DO).

 Sus tubos se rellenan densamente con un material, finamente dividido y homogneo que se recubre con una delgada capa de fase estacionaria lquida (0.05 a 1 mm ) Soporte slido se prepara a partir de tierras de diatomeas de procedencia natural. Las partculas del soporte son por lo general de 260 a 170 mm o de 170 a 149 mm Los tubos se configuran en forma helicoidal con un diametro aproximado de 15 cm. Columna estable trmica y qumicamente.

Columnas de Tubo abierto capilar

W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular) Columna Abierta de Pared Recubierta

-

P.L.O.T. (Porous layer Open Tubular) Columna Abierta de Capa porosa

-

S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular)

Columna Abierta Recubierta con Soporte

F.S.O.T. (Fused Silica Open Tubular) Columna Abierta de Slice Fundida

Columnas Rellenas vs Capilares

Factores que Afectan la Eficiencia de una Columna

Longitud de la Columna Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de dimetro externo) Tamao de las partculas del empaque Grosor de fase estacionaria Temperatura de la columna Velocidad del gas portador Cantidad de muestra inyectada

Fase Estacionaria
Las propiedades deseables para una fase lquida inmovilizada en una columna cromatogrfica gas-lquido comprenden:
1. 2. 3. 4. Baja Volatilidad (Pto. Eb > a 100 de la T de trab.) Estabilidad Trmica Qumicamente Inerte Caractersticas de los disolventes tales que el factor de retencin y el de selectividad estn dentro de un intervalo conveniente.

Detectores

Caractersticas del Detector Ideal

1. Adecuada sensibilidad.(10-15 a 10-8 g de soluto/s) 2. Buena Estabilidad y reproductibilidad 3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios ordenes de magnitud 4. Intervalo de T desde la Tamb. hasta al menos 400C 5. Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal 6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. 7. Respuesta semejante para todos los solutos, o bien respuesta selectiva y altamente predecible. 8. No destructivo de la muestra.

Clasificacin de los detectores

Detectores segn su Grado de Selectividad :

Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l. Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mnimo de respuesta a otras.

Detectores Destructivos y No destructivos. Esta

clasificacin, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruida o no.

 Detectores segn su Modo de Respuesta:

Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin. Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l. Detectores segn el proceso de deteccin: Ionizacin, ptico-espectroscpico, Electroqumico, etc.

Tipos de Detectores (segn el proceso de deteccin)

Conductividad Trmica (TCD) Captura Electrnica (ECD) Ionizacin de Llama (FID) Ionizacin de Llama Alcalina (NPD) Fotomtrico de Llama (FPD) Termoinico (TID) Emisin Atmica (AED) Detector de Fotoionizacion (PID) Quimioluminiscencia de Azufre (SCD) Espectrmetro de Masas Espectroscopia infrarroja

Detector de Conductividad trmica, TCD

Utilizado particularmente con columnas empacadas, detecta H2O, CO, CO2 e H2. Mide la conductividad trmica de un analito en un gas acarreador. La velocidad de prdida de calor de un cuerpo caliente hacia un cuerpo ms fro es proporcional a la conductividad trmica del gas que separa estos cuerpos.

Detector de Captura de electrones, ECD

Utiliza un emisor beta radioactivo (electrones) para ionizar parte del gas portador y para producir una corriente entre un par de electrodos. Cuando las molculas orgnicas que contienen grupos funcionales electronegativos, tales como halgenos, fsforo y grupos nitro, pasan por el detector, capturan algunos de los electrones y reducen la corriente medida entre los electrodos.
Empleado frecuentemente para compuestos halogenados

Detector de Ionizacin de Flama (FID)

Los compuestos orgnicos se pirolizan a la temperatura de una llama de H2/aire produciendo iones y electrones que conducen la electricidad a travs de la llama. La seal depende del nmero de tomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, por lo que es ms sensible a la masa que a la concentracin. Se aplica a compuestos orgnicos pero es poco sensible a grupos como carbonilo, aminas, alcoholes y halgenos. El detector es insensible a gases no combustibles como CO2, SO2 y NOX.

Empleado para hidrocarburos, poco sensible a compuestos muy oxidados

Detector de Nitrgeno Fsforo, NPD

Es bsicamente el mismo FID, la diferencia es la adicin de un metal alcalino (Rubidio o Cesio) Detector de ionizacin de flama alcalino (AFID) Detector de ionizacin (TID), Detector termoinico de flama (FTD), Detector especfico termoinico (TSD) Al calentar el material alcalino en la zona de la llama este detector presenta una gran sensibilidad por compuestos que contienen fsforo y nitrgeno.

Detector de Azufre-Fsforo, FPD Fotomtrico de flama

Adaptado para utilizarse con una flama de un FID. Sensible a compuestos con azfre (394 nm) y con fsforo (526 nm) Mide la emisin ptica procedente del fsforo, azufre, plomo, etc. Cuando el eluato (lo que sale de la columna) pasa por una llama de H2-aire, los tomos excitados emiten luz caracterstica Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fsforo.

Detector de Fotoionizacin

La deteccin de gases por fotoionizacin (Photo Ionization Detection) utiliza luz ultravioleta (UV) para ionizar las molculas de gas y detectar su concentracin .Se utiliza para deteccin y medicin de bajas concentraciones de sustancias qumicas ionizables tales como Compuestos Orgnicos Voltiles y otros gases txicos.

Emisin Atmica (AED)

El gas de salida de la columna se introduce en un plasma de He mantenido por induccin de microondas. La alta temperatura alcanzada en el interior del plasma (varios miles de grados) es suficiente para ionizar totalmente todos los tomos de la muestra, y obtener de esta forma sus espectros de emisin. La radiacin emitida se selecciona y se refleja en una red de difraccin, descomponindose en sus longitudes de onda individuales, y se recoge en una fila de diodos, capaz de detectar en el rango de 170 a 837 nm. dicho espectrofotmetro permite detectar ms de 26 elementos.

Detector de Espectrometra de Masas, MSD

El espectrmetro de masas usa la relacin masa-carga (m/z) de molculas ionizadas. Es una tcnica muy poderosa que permite cuantificar, identificar y da informacin acerca de la estructura de compuestos desconocidos.

Espectrmetro de Masas: Analizadores de masa

*La operacin general del espectrmetro de masas es:

a) crea iones en fase gaseosa b) separa los iones en base a su relacin (m/z). c) mide la cantidad de iones de cada relacin (m/z). Una vez ionizadas las molculas, estas pasan al analizador de iones el cual los transporta hacia el detector: Existen diferentes tipos de analizadores los que son utilizados de acuerdo a las necesidades. Dentro de los analizadores podemos citar, la trampa de iones, el sector magntico, el tiempo de vuelo, el cuadrupolo, etc.

Caractersticas Detectores
Detector Lmite de deteccin g Rango lineal Comentarios Detector universal Detector universal Detector selectivo Tratamiento soluto No destructivo Destructivo No destructivo Destructivo

TCD
FID ECD FPD

10-5-10-6
10-12 10-14 10-13

103-104
106-107 102-103 102

Detector Selectivo S,P

Detector Selectivo N,P Detector universal

NPD MSD

10-8-10-14 10-12

105-107 Segn tipo detector

Destructivo Destructivo

Tarea
Investigar: Diferencias de CG con HPLC Problemas de Qumica Analtica de Skoog, West, Holler, pp 685-686. 24-15, 24-18, 24-21 al 24-27,

HPLC Cromatografa Lquida de Alta Resolucin

Campo de Aplicacin de la HPLC

La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada Las razones: 1. su sensibilidad, 2. su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, 3. su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles 4. su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters

Tipos de Cromatografa lquida

Cromatografa de Particin. Cromatografa de Adsorcin Cromatografa Inica Cromatografa de Exclusin

Los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere.

Cromatgrafo de HPLC

Esquema de un aparato de HPLC

 Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anlisis. Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por esta tcnica. El desarrollo instrumental es posterior al de la CG debido a dificultades para lograr un flujo estable en el eluyente.

 Una muestra en estado lquido es arrastrada por una corriente lquida llamada eluyente. Como fase estacionaria acta un slido finamente dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una pelcula lquida a l adherida. Dependiendo de la retencin de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocar su migracin diferencial.

Caractersticas: Selectividad Reproducibilidad Sensibilidad Rapidez Parmetros: Naturaleza de la fase estacionaria Tamao de partcula Eluyente (composicin y flujo) Detector Fase Directa: fase estacionaria polar fase mvil de baja polaridad Fase Reversa: fase estacionaria de polaridad baja fase mvil de polaridad alta