TECNICAS DE OBSERVACIN MICROSCOPICA

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes: La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y tien. Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la divisin celular Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observacin con tinciones

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias Identificacin y diferenciacin de microbios entre especie y dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco preparacin en fresco simple preparacin en gota pendiente

2. Observacin con tinciones

Tincin simple: un solo colorante. Tincin diferencial: ms de un colorante Tincin especial Tincin negativa: colorea el medio que rodea a la bacteria permaneciendo sta sin teir.

Procedimiento para un preparado en fresco ("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota de

SSF o agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el

asa de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco Bacterias: Leptospiras, treponemas (M. campo oscuro)

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco : (SSF) Parsitos : Trofozoitos, larvas.

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco Hongos: Levaduras

Observacin microscpica
1. Observacin en fresco con modificaciones Hongos
NaOH 10% (hifas)

Procedimiento para un preparado en fresco en gota pendiente

2. TINCIONES O COLORACIONES

COLORANTE: DEFINICIN
Son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por algn componente.
Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste

COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un anin
incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente (cidos nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas) (ms usados en citologa bacteriana). Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado.

No tien la clula bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloracin negativa). Tien estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas(Rx bsicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.

COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles Se combinan con los componentes lipdicos de la clula, usados para revelar la localizacin de los depsitos de grasa. Ej. Negro Sudn.

COLORACIONES : Tipos
Vitales
Son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.

Supravitales
son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden.

No vitales
se realizan sobre clulas muertas.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin) b) La fijacin c) Coloracin.

Tincin de clulas para la observacin microscpica

Extensin de una fina capa de clulas sobre el porta

Adicin del colorante lavado y secado Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin)
Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)

TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH) FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter)

Metanol

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

c) Coloracin. SIMPLE : Positiva o negativa

Tincin simple de azul de metileno.

Frotis y fijacin

Lunes

1.- Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin con Azul de Metileno 5

2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio Micrococcus luteus

Lunes

Tincin negativa.

1.- Colocar una gota Nigrosina en un porta

de 3.- Mezclar con la Nigrosina y extender por todo el porta. Secar al aire y observar

2.- Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar

cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas

 Hongos
Tincin negativa

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

c) Coloracin. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Etapas :
1. tincin primaria
2. Tincin de contraste o secundaria
Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHLNEELSEN, ESPORAS

TERMINOS
Los mordientes, aunque no son colorantes, intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula por el colorante. Tambin se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podran ser visualizados de otra forma.

Diferencias en la pared celular

Lunes Tincin

L-3.2.3.- Tincin de Gram

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota 2.- Tomar la muestra de agua en un porta con el asa de siembra

3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.- Cubrir la preparacin con Cristal Violeta 2

2.- Aadir Lugol (mordiente) durante 1

3.- Decolorar con Alcohol 96 hasta que no suelte colorante

4.- Lavar con agua

5.- Teir con Safranina 1

6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Tincin de Gram
Tincin del frotis Paso 1
Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las clulas se tien de color azul-violeta.

Paso 2

Aadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las clulas siguen de color azul-violeta.

Gram +

Decolorar con alcohol Paso 3

Las clulas Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos. Las clulas G+ se ven azul-violeta.

Paso 4

Las G- rosas o rojas.

Gram -

PROCEDIMIENTO COLORACION GRAM

Lunes

Tincin de Gram Cocos Gram Bacilos Gram -

COLORACIN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos miclicos) Resiste la decoloracin con alcohol y un cido fuerte cuando VARIANTES Caliente : Mycobacterium En fro (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E

Tincin de cido-alcohol-resistente.
Frotis y fijacin Tincin

Miercoles

1.-Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra de un cultivo de Mycobacterium

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1.-Cubrir la preparacin con Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de algodn empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero hasta la emisin de vapores. Mantener durante 5 minutos.

3.-Lavar con agua y decolorar con alcohol cido

4.-Teir con Azul de Metileno 1

5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Tincin de esporas.
Frotis y fijacin

Miercoles Tincin

1.-Poner una gota de agua en un porta

2.-Tomar la muestra de un cultivo de Bacillus

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparacin con Verde Malaquita

2.-Calentar, con un hisopo de algodn empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisin de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos.

3.-Lavar con agua

4.-Teir con Safranina 1

5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Esporas

Bacterias

La tincin de flagelos de Leifson

1.Se fija qumicamente la suspensin bacteriana, mediante formol, y se hace la extensin en un portaobjetos. 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. 3.Se cubre la preparacin con una mezcla de cido tnico y el colorante rosanilina, de preparacin extempornea. El cido tnico engruesa los flagelos y la rosanilina los tie. 4.Se retira el exceso de colorante con agua. 5. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su observacin al microscopio.

Figura 3.11Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus (b) La tincin de Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.

Tcnicas de tincin para bacterias

Tincin Uso Tcnicas

Tinciones simples

Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo

Se tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.

Tnciones diferenciales Tincin de Gram Dos o ms colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y despus con una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa. Tincin de Dos colorantes; distingue entre las Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores cido-alcohol micobacterias (cido-alcohol resistentes) y el durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora resistencia resto de las bacterias brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes (Ziehl-Neelsen) permanecen teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul. Tinciones especificas Tincin de Tie selectivamente las endosporas Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de esporas de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie Wirtz-Cortitlin con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma el color rosa. Tincin de Permite observar los flagelos A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico flagelos de (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el Leifson colorante los fine. Tincin negativa Revela la presencia de cpsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparacin en fresco del espcimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que se observa como una regin clara alrededor de la clula.

Imgenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos microscopios. (a) La microscopa de campo claro permite observar la forma y las estructuras internas de mayor tamao, como el ncleo. (b) La imagen de contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el caracterstico halo. (c) La microscopa de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de Nomarsky es casi tridimensional.

PARASITOS: Plasmodium
GIEMSA O WRIGHT

COLORACION LEISHMAN

HONGOS
AZUL DE LACTOFENOL T. MENTAGROPHYTES

COLORACION DE TEJIDOS HEMTOXILINA /EOSINA

Hay alguna pregunta? o de lo contrario

seguimos en la prxima clase !!!