Imbalance of placental regulatory T cell and Th17 cell population dynamics in the FIVinfected pregnant cat

Catarina Teixeira Turma 2 MIMV

Introduo
As clulas T reguladoras constituem uma populao imunossupressora, ao

passo que as clulas Th17 so pr-inflamatrias. O equilbrio entre ambas

essencial para a tolerncia dos fetos na placenta durante a gestao; O TGF- e a IL-6 so citocinas que promovem a diferenciao das clulas T referidas no ponto anterior, a partir de um progenitor comum;

Clulas T CD4+ nave

TGF-

TGF- IL-6

T reguladoras

Th17

FOXP3

Factores de transcrio

ROR

Em gatas com FIV, em fases iniciais da gravidez, detectaram-se ambientes placentrios pr-inflamatrios com FOXP3 e IL-6;

Objectivos
O HIV em mulheres grvidas tem sido associado ao insucesso reprodutivo aumentado e h evidncia de que o vrus a expresso de citocinas, promovendo a transmisso de me para filho; A dificuldade em obter tecidos humanos valoriza o modelo animal; Assim, a utilizao de gatas infectadas permite avaliar os parmetros da inflamao placentria induzida pelo lentivrus.

Primeiro: As duas populaes celulares situam-se na interface materno-fetal, o que evidenciado pela presena de relaxina, produzida pelos trofoblastos

FOXP3 anticorpo especfico anti-ROR anticorpo anti-relaxina

Segundo: quantificar a expresso de FOXP3 e ROR, tanto nos animais controlo como nos infectados

Terceiro: avaliar a expresso de TGF e IL-6

Mtodos
Utilizao de 20 gatas com menos de 1 ano de idade, das quais 10 foram inoculadas com plasma felino contendo FIV-B-2542 e as restantes 10 constituram o controlo; Acasalamento natural com gatos machos; Colheita de soro, plasma e leuccitos do sangue perifrico colhido quinzenal ou mensalmente at extraco das crias; Confirmao das gravidezes por ultra-sonografia e remoo dos fetos , por cesariana, s 3-4 semanas (fase inicial) ou 8 semanas (fase tardia) da gestao; Aps a remoo dos fetos e a extraco de tecidos reprodutivos e sangue, as gatas infectadas foram eutanasiadas sob anestesia, ao passo que as gatas controlo foram laqueadas e dadas para adopo. As amostras placentrias foram usadas para anlises confocais e imunohistoqumicas e qRT-PCR

Deteco de vrus no tecido;

Purificao do RNA de tecidos placentrios e converso em cDNA;

Quantificao de citocinas e marcadores de clulas T reguladoras atravs de qRTPCR;

Recurso a anticorpos multiclonais de coelho para FOXP3 e ROR para localizar clulas T reguladoras e Th17 , respectivamente; Determinao da interface materno-fetal usando um anticorpo policlonal de coelho para a relaxina de sunos; Os tecidos foram incubados com IgG anti-coelho de cabra; Aps o tratamento devido, as seces foram bloqueadas com IgG felina e 5% de leite sem gordura, sendo depois incubadas tanto com anticorpo policlonal de coelho para ROR como com anticorpo policlonal de coelho para FoxP3; A IgG anti-coelho de cabra foi conjugada com a fluorescena; Conjugao de istopos com fluorocromos para assegurar que a reactividade no resultava da ligao no especfica; As anlises estatsticas da mdia da fluorescncia para populaes de clulas marcadas entre os grupos controlo e infectado realizaram-se usando ANOVA ou o teste para duas amostras T independentes de Wilcoxon; A anlise da regresso simples foi utilizada para determinar correlaes;

As diferenas foram consideradas significativas para p0.05.

Resultados
Nos animais inoculados, detectou-se o provrus ou RNA viral em todos os tecidos placentrios testados; Inviabilidade nas gatas infectadas, no tendo ocorrido nas gatas controlo;

As clulas Th17 e Tregs foram localizadas pela comparao de seces paralelas de tecidos rotulados imunologicamente para a relaxina (Figura 1a), FoxP3 (Figura 1b) e ROR (Figura 1c).

Com base na deteco do ROR, no houve diferenas significativas na populao de Th17 entre os grupos de controlo e os infectados numa fase inicial da gestao (p=0.417) (Figura 3a); TGF- nos tecidos infectados reguladoras; FOXP3 significativamente e clulas T

A expresso de FOXP3 e de ROR correlacionaram-se positivamente em gatas FIVpositivas no incio da gestao, sendo independentes no grupo controlo; Os animais controlo revelaram uma correlao positiva entre IL-6 e TGF-, sendo independentes no grupo infectado;

Concluso
Na fase inicial da gravidez, predominam as clulas T reguladoras e as Th17 so suprimidas. Esta situao inverte prximo do parto; TGF- conduziu a FOXP3 e clulas T reguladoras, enquanto o ROR se manteve constante entre animais controlo e infectados, sugerindo que no h efeito viral na populao de clulas Th17; O desequilbrio do rcio normal das clulas T reguladoras e Th17 predispe um ambiente placentrio pr-inflamatrio que promove o insucesso reprodutivo; Assim, a expresso alterada das citocinas-chave acompanha a infeco viral, contribuindo para o desequilbrio entre as clulas T reguladoras e Th17 que ocorre nos animais infectados; Dada a relao recproca na periferia, a expresso de FOXP3 e ROR foi independente no controlo, sem que estes se correlacionassem positiva ou negativamente; A deteco de uma correlao positiva entre ROR e IL-6 em animais controlo enquanto nenhuma correlao significativa ocorreu em animais infectados, apoia uma quebra do balano normal entre as duas citocinas induzida pelo vrus;

O estudo refere-se s fases inicial e final da gravidez, mas, em termos de resultados, foca-se somente na fase inicial, sem mencionar o objectivo da remoo dos fetos s 8 semanas; Na figura 3, encontra-se uma incongruncia: surge n(controlo)=9 e n(infectados)=11, sendo anteriormente mencionada a igualdade de 10; O insucesso reprodutivo em mulheres com HIV referido e reala-se a importncia do modelo animal para comparar, mas tal no descrito no artigo; Ainda assim, essa comparao falvel, pois h diferenas entre humanos e gatos, alm de que os vrus da imunodeficincia nestas duas espcies, apesar de semelhantes, tm algumas distines, nomeadamente na progresso da doena que causam e na transmisso; O facto de haver semelhanas entre o HIV e o FIV no significa que a aco do sistema imune de uma espcie seja igual da outra; No obstante, o estudo desenvolvido levanta questes bioticas quanto infeco e morte intencional de animais para um estudo que poder ou no aplicar-se quilo que se observa em humanos com HIV; Desta forma, este estudo acabo por relatar o que ocorre em gatas infectadas com FIV, em comparao a um grupo controlo, mas sem se comprometer com uma hiptese aplicvel quilo que se tinha objectivado, ou seja, implicao do HIV na gravidez.