Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Descubridor
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)

Definicin
Cromatografa es un mtodo de separacin en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla.

Cromatografa, definicin (cont.) Una columna u otro soporte mantienen a la fase estacionaria y la fase mvil acarrea a la muestra. Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase estacionaria estarn ms tiempo dentro de la columna.

Si es en columna :
Conforme los componentes son eluidos de la columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para anlisis posterior

Mtodos cromatogrficos
De gases En capa fina En lquidos inmovilizados De exclusin molecular Intercambio inico Hidroxiapatita Hidrofbica Afinidad HPLC

Exclusin molecular
Fase estacionaria:
Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida

Las molculas grandes fluyen ms rpido que las pequeas.

Desarrollo de una cromatografa de exclusin molecular

Determinacin del tamao de columna Hidratacin y lavado de la resina Empaque de la columna Determinacin del volumen vaco Corrimiento de la muestra la

Cromatograma de exclusin molecular (EM)

Elusin de una columna de cromatografa de EM

Cromatografa de exclusin

Caractersticas de las resinas de EM clsicas

Nombre BioGel Cdigo P-60 P-100 P-200 P-300 G-50 G-100 G-150 G-200 Rango de Fraccionamiento (kDa) 3-60 5-100 30-200 60-300 2-30 4-150 5-300 5-600 Flujo mximo (cm/hr) 5 5 4 3 5 5 3 2

Sephadex

Intercambio inico

Intercambio inico
Las protenas difieren mucho en su afinidad por materiales cargados positiva o negativamente. Los soportes pueden ser:
Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Celulosa Poliestireno Slice

Grupos intercambiadores
Fosfato (P)
PO3CH2 COO+ (CH2)2NH CH2 CH3

Carboximetilo (CM)

Dietilaminoetil (DEAE) Mono Q

CH2 N+ (CH3)3

CH2 CH3

Principios del intercambio inico

La afinidad de una protena es proporcional a la concentracin de sal requerida para liberarla del material. Una columna se carga (de protenas) con un amortiguador de baja fuerza inica y la elusin se inicia por incremento de la concentracin del amortiguador de elusin.

Desarrollo de una cromatografa de intercambio inico

Hidratacin y Lavado de la resina Activacin (lavado con cido y base fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usar ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) Volumen de la columna y capacidad de retencin de la resina.

Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de elucin cuando se usan en cromatografa de intercambio inico. Intercambio del anin
citrato>sulfato>oxalato>I->NO3-2>CrO4->Br- > SCN- > Cl- > Formiato

Intercambio del catin

Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd > Cu > Co > Zn>Mg>Ti+> Ag > Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

Amortiguadores
Para intercambiadores aninicos se deben usar amortiguadores catinicos o zwitterionicos No usar amortiguadores aninicos pues se unen a la resina. Usar detergentes catinicos o no inicos.

Cromatograma de intercambio inico

b 53 NaClmM
500

280nm A

30

60

90

Tiempoderetencin(min)

Hidroxiapatita (HA)
Introducida por Tiselius et al. en 1956 Bernardi realiz un estudio sistemtico (Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography on calcium phosphate columns, Arch Biochem Biophys 65, 132155

Frmula
Forma cristalizada de fosfato de calcio (Ca10(PO4)6(OH)2)

Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography: column performance for proteins, Eur J Biochem 152, 361371

Unin selectiva de protenas a la hidroxiapatita

A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos amino son atrados por los sitios fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para los carboxilos.

Adsorcin de grupos amino

Se debe a interaccin electrosttica no especfica entre su cargas positivas y las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de fosfato.

Incremento de la unin de aminas por bloqueo de la repulsin.

A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

Los grupos fosfatos en solucin pueden cubrir a calcios que repeleran a los grupos aminos.

Disociacin selectiva de la hidroxiapatita

A, es una bsica. B, es una acdica El tringulo enlaces coordinacin. que estos afectan. protena protena indica de Notar no se

Efecto de la concentracin de fosfato en la unin de protenas

El perfil superior fue cargado con fosfato 1 mM El inferior, con fosfato 50 mM. La capacidad de unin de las IgG se mejor reduciendo la competencia de contaminantes.

Barrido con dos gradientes

El primer gradiente va de 0 a 500 mM de cloruro de sodio. El segundo, de 0 a 500 mM de fosfato de potasio. El amortiguador base es 0.5 M MES, 1mM fosfato, pH 6. La elusin de la IgG se observa en gris

Usos
Purificacin de:
Protenas cidos nuclicos Virus

Bases de la Tcnica
Su selectividad no depende de la masa molecular, densidad de carga o punto isoelctrico.

Bases de la tcnica
La adsorcin y la elucin de las protenas no son procesos en reversa de un solo efecto. Los grupos amino y carboxilo actan de manera diferente en la adsorcin de las protenas a la HA. La elucin de protenas cidas y bsicas por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

Ventajas
HA tiene poco poder de adsorcin de molculas de masa molecular baja como nucletidos, sales y aminocidos. Es relativamente incompresible. Existen variantes cermicas ms fciles de trabajar pues no se compactan.

Cromatografa hidrofbica

Cromatografa Hidrofbica
Los grupos adicionados al soporte son el alcohol octlico, grupos bencnicos u otros grupos hidrfobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18). Los centros hidrfobos de las protenas son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.

Cromatograma hidrofbico
b (NH4)2SO4mM 53
500

A 280nm

30

60

90

Tiempoderetencin(min)

Series caotrpicas
Aniones PO4>SO4>CH3COO>CL>Br>NO3 >ClO4>I>SCN Cationes NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>Ba2+

Cromatografa de Afinidad
Sistema muy poderoso de purificacin Sistema restringido Se basa en la interaccin especfica de dos compuestos
Antgeno - Anticuerpo Enzima - sustrato Receptor - Ligando

HPLC
Cromatografa lquida de alta resolucin High-performance liquid chromatography

Limitaciones de la cromatografa a bajas presiones

Imposibilidad fsica de aumentar el flujo
Resinas compresibles

Corridas de muchas horas Grandes volmenes

Descubrimientos que facilitaron la HPLC

Sntesis de resinas incompresibles Nuevas tcnicas en el empaque de las columnas Microparticulacin de las resinas Adelantos en la tecnologa espectrofotometrica

Tipos de HPLC
De exclusin molecular Intercambio inico Hidrofbica Afinidad De fase reversa

Instrumentacin
Sistema de bombeo
Resistente a qumicos Poca variabilidad Presiones de 30 as 400 atm Flujo constante (libre de pulsos) Buen mezclado de los solventes Reproducibilidad en la formacin de los gradientes

Tipos de bombas
Jeringa Pistn recproco Diafragma Presin constante

Detectores
Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o ms longitudes de onda al mismo tiempo Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.

Cromatografa de fase reversa

Se basa en las propiedades hidrofbicas de las protenas. El proceso de elucin es diferente que en la cromatografa hidrofbica La fase mvil es un solvente orgnico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).

Fase estacionaria
Slica acoplada con un derivado alquilsilano. La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4, C8, C18. La porosidad del soporte es variable se recomienda que sea entre 300 o 1000 A El tamao de las partculas es de 5 20 m y a a

Fase mvil
La acidez de la fase mvil:
Influencia el estado inico de la protena Controla la ionizacin de la superficie silanol Forma pares inicos con la zona catinica de la protena Favorece la exposicin de zonas hidrofbicas de la protena

Cromatograma de fase reversa

17 a 80

215

40 AcN(%) 0 0 20 40

TiempodeRetencin(min)

HPLC de Fase Reversa

Separacin eficiente an con concentraciones altas de protenas Bajo ruido de fondo Solventes voltiles Fcil formulacin de la fase mvil Reproducibilidad de gradientes.

Diagrama del sistema HPLC

Termostato de la columna

Celda Microbore Columna Celda Analtica Celda Preparativa

Manejador de muestras Manejador de solvente

HPLC WATERS modelo antiguo

HPLC WATERS

Cromatgrafo de Gases

Principales componentes
Gas de acarreo Controladores de flujo Inyectores Columnas Detectores Sistema de datos

Gas de acarreo
Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (makeup). El make-up, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector. El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxgeno. Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares.