Trabajo Prctico

2012

Observacin de vectores. Estudios Parasitolgicos

Floridia Ricardo Ariel

Objetivos

Reconocer los Hempteros hematfagos basndose en la discriminacin de caractersticas distintivas. Conocer y aplicar adecuadamente las tcnicas de diagnstico parasitolgico.

Reconocimiento de Vectores

Determinar que el insecto hallado es un posible vector de la enfermedad de Chagas Mazza.

Analizar el vector para tomar medidas sanitarias:

Estudios

parasitolgicos Estudios seriados Bsqueda de vectores en la vivienda Vigilancia epidemiolgica

Clasificacin de vectores

Reino Animalia Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Hemiptera Familia Reduviidae Subfamilia Triatominae Gnero: Triatoma, Panstrongylus, Rhodnius Especie: aproximadamente 140

Orden: Hemiptera

Sus alas anteriores (o hemilitros) estn divididas en una mitad basal dura y una mitad distal membranosa. Entre los hempteros ms conocidos estn los pulgones, las cigarras y las chinches de las camas. Son insectos con metamorfosis incompleta, con un amplio rango de tamaos entre 1-100mm de longitud, se caracterizan por poseer glndulas odorferas y piezas bucales como un estilete largo adaptado para perforar y chupar.

Familia: Reduviidae

Es una familia grande y cosmopolita de hempteros. Comprende grupos de insectos hemipteros: fitfagos, depredadores, hematfagos Se alimentan mediante una proboscide que depender del tipo de alimento.

Subfamilia: Triatominae

Son todas especies hematfagas Son grupo de insectos que se reconocen por poseer un aparato bucal recto y con tres segmentos. Su comportamiento hematfago le confiere su capacidad vectora y transmitir al parsito sanguneo Trypanosoma cruzi. Los Triatominos poseen un ciclo de vida que va desde huevo hasta adulto, pasando por cinco estadios ninfales inmaduros sexualmente y carentes de alas.

Carcter hematfago

Los vectores:

Son artrpodos hematfagos. Se distribuyen en Amrica desde el paralelo 43 al Norte (Sur E.U.), hasta el paralelo 49 de latitud sur (Argentina), hasta una altitud de 2000 msnm. Aproximadamente 60 son infectantes, y 16 viven en Argentina. Se conocen con distintos nombres:

Colombia : Pitos Brasil: Barbeiros, Mexico: Chinche hocicona, Chinche de Compostela, Besucona. Venezuela: Chipos Argentina: Chinche gaucha Per: Chirimaya Paragay: Chich Ecuador a la Argentina: Vinchucas

Mapa de Triatominos en Amrica

Rhodnius prolixus

Triatoma infestans

Triatoma patagnica

Triatoma dimidiata

Panstrongylus geniculatus Panstrongylus megistus

Triatoma sordida

Rhodnius pallescens

Triatoma pallidipennis

Descripcin general

Cabeza: posee los rganos sensoriales

Torax: estn insertados los rganos locomotores Abdomen: estn el aparato reproductor y las aberturas respiratorias.

Ciclo biolgico
El ciclo desde el huevo al adulto puede tardar entre 8 meses a un ao

Huevos 5 Estados ninfales Adulto

Huevos de triatominos

La hembra pone hasta 200 huevos. Los deposita en lugares ocultos. El perodo de incubacin depende de la temperatura ambiente, pero oscila entre 10 y 40 das. Miden de 2 a 3 mm, forma elptica, operculados, de color blanco, cambian a rosado cuando se completa la evolucin del embrin. Pueden observarse los ojos de los insectos dentro.

Los estados ninfales

Antes de llegar a adulto debe pasar por los 5 estadios Las ninfas carecen de alas, ocelos y genitales. El primer estadio de ninfa puede medir 2mm. El insecto sufre metamorfosis peridicas dependiendo de la alimentacin, temperatura y humedad. Los estadios 1, 2 y 3 pueden realizar la muda con una ingesta sangunea completa, pero los estadios 4 y 5 normalmente requieren alimentarse ms de una vez para mudar. Forma de alimentacin: coprofagia, canibalismo, y de animales Muda del exoesqueleto: alimentacin.

Insecto adulto

Viven unos quince meses. El tamao vara entre 1,5 cm y 3 cm de longitud, y entre 8 a 10 mm de ancho, segn sexo, replecin y madurez ovular en la hembra. El color es variable segn la especie(pardo oscura) con un reborde de bandas transversales que se alternan en colores pardos y claros. Su cuerpo es chato pero cuando se alimenta su abdomen se hincha

Insecto adulto

Cabeza: alargada, fusiforme y termina en una proboscis recta que en reposo se dobla centralmente sobre el cuerpo y se extiende en el momento de la picadura. Ojos: un par compuestos que son globosos y prominentes por delante de los cuales emergen un par de antenas cuyo punto de implantacin diferencia gneros. Un par de ojos menores, los selos. Torax: es quitinoso y su segmento anterior tiene forma de escudo. Alas: son dobles y permanecen dobladas sobre el dorso. Las alas posteriores que se doblan debajo de las primeras son delgadas y membranosas, las anteriores tiene una parte dura y otra membranosa.

Aparato bucal

Llamado proboscide o rostro, facilita la tarea de chupar sangre en los triatminos. Posee tres segmentos y en el momento de picar se dobla y extiende. Compuesto de:

Estiletes Dos maxilares Dos mandbulas.

Las mandbulas ayudan a perforar la epidermis y los maxilares penetran en busca de un vaso capilar. El rostro es una caracterstica comn y ancestral entre los hempteros y puede ayudar a distinguir un hemiptero triatmino de uno no hematfago.

Es largo en los hempteros fitfagos Corto y curvo en los depredadores (entomfagos). En los hematfagos triatminos es recto.

Fitfago

Predador

Hematfago

Triatoma sanguisugar

Predador

Triatoma spinolai

Predador

Chinche del algarrobo

Segmentos de la antena de un triatomino

Los triatminos poseen antenas de cuatro segmentos en ambos lados de la cabeza y frente a los ojos. El primer segmento basal o escapo esta unido a la cabeza, luego le sigue un pedicelo y un flagelo compuesto en dos subsegmentos: flagelo distal y flagelo prximal. Contienen la mayor parte de los pelos que contienen sensores qumicos, trmicos y tctiles. La distancia relativa entre las antenas y los ojos permite determinar los gneros: Rhodnius, Triatoma y Panstrongylus.

Glndulas salivares

Se pueden observar fcilmente al arrancar la cabeza de un triatomino. Cada insecto presenta un par de estas glndulas. La saliva de los triatminos tiene como funcin principal evitar que su picadura produzca seales de alerta en el husped y facilitar el transito de sangre hacia el intestino. Tiene sustancias que contrarrestan los procesos de defensa de los sistemas circulatorio e inmune de la vctima. Contiene protenas (lipocalinas y similares) para inhibir la cascada de la coagulacin, limitar la activacin de las plaquetas y prevenir la vasoconstriccin. Sustancias para disminuir la respuesta de dolor, inflamatoria e inmune del husped.

Torax

El pronoto, est dividido en un lbulo anterior y otro posterior. Puede tener espinas y/o tubrculos de inters taxonmico. Tambin es notorio que el mesonoto de los adultos esta reducido a un escutelo.

Abdomen

El abdomen de los adultos esta compuesto de 11 segmentos. Los ltimos segmentos conforman el sexo. El conectivo, es decir, la parte que bordea el abdomen, muestra un patrn de manchas que varia en color y formas segn la especie. Las alas no siempre estan presentes (Ausente en Triatoma espinolai). Se pueden diferenciar machos y hembras en su ltimo segmento: En los machos la terminacin es redondeada En las hembras es triangular y sobresale del abdomen.

Triatoma boliviana

Hembra

Macho

Aparato digestivo

Los triatminos succionan sangre a travs de la proboscide. La sangre ingerida pasa a la faringe, luego al esfago y se almacena en el estmago (95% simbiontes). La ingesta pasa al intestino delgado. En la parte anterior sufre un proceso de digestin, y en la posterior, un proceso de absorcin. Finalmente, los restos de la ingesta, as como algunas bacterias simbiontes y parsitos tripanosmidos, son evacuados a travs del recto.

Simbiontes

Dado que los triatminos son estrictamente hematfagos, estos no consiguen en la sangre ciertos componentes esenciales de su dieta, de modo que necesitan la ayuda de bacterias que actan como simbiontes que producen sustancias tales como la vitamina B. Pasan de generacin en generacin. La ausencia de simbiontes en el intestino de los triatminos causa varios efectos deletreos que incluyen: a) retardo y mortalidad en el desarrollo juvenil, b) problemas para digerir la sangre y para defecar c) Infecciones con los protozoarios tripanozomatidos Blastocrithidia triatominae (comn en Triatoma) y Trypanosoma rangeli.

Patgenos para los triatominos

T. rangeli

Blastocrithidia triatominae

Glndulas exocrinas

Los triatminos tienen cinco diferentes pares de glndulas que al igual que en otros reduvideos se encuentran en el trax o en el abdomen: Glndulas metasternales Glndulas de Brindley Glndulas drmicas Glndulas ventrales Glndulas abdominales. Las ms estudiadas son las dos primeras, las cuales producen olores y sabores de beneficio para el insecto. Glndulas de Brindley: Segregan cido isobutrico y otros cidos carboxlicos, as como, alcoholes y esteres. Glndulas metasternales: en las hembras de R. prolixus, T. infestans y T. brasiliensis producen una feromona que atre a los machos.

Homeostasis y excrecin

La excesiva ingesta de lquido implica un eventual desequilibrio fisiolgico y vulnerabilidad frente a sus depredadores. El rgano esencial del sistema de homeostasis y excretor de los triatminos lo constituyen los tubos de Malpighi. Los triatminos convierten el amonaco en cido rico. El cido rico es relativamente insoluble e inerte, por lo cual puede ser retenido en forma de cristales por largos perodos de tiempo. Los triatminos utilizan menos agua para su sntesis, y lo excretan por el recto en forma de discos blanco amarillentos.

Alimentacin

Se alimenta, desde que nace hasta que muere, exclusivamente con sangre humana o de animal de sangre caliente. Se alimenta de noche, cuando su presa esta inmvil por el sueo, despliega su trompa e inserta los estiletes bucales en la piel de la vctima. Como la picadura es indolora, el insecto dispone de tranquilidad para sorber la cantidad de sangre hasta llenarse. Como absorbe hasta que est repleta, es incapaz de volar. Por eso regresa caminando lenta y torpemente hasta su refugio habitual.

Resistencia al ayuno

Tanto machos como hembras se alimentan de sangre en una cantidad que puede ser de 10 veces el peso de su cuerpo en ninfas 1, 2 y 3. En ninfas 4 - 5 y adulto toman de 4 a 5 veces el peso de su cuerpo.

La resistencia al ayuno de este insecto es muy grande.

Ninfas de estadios 1 al 4: de 2 a 3 meses de ayuno Ninfa de quinto estado: hasta 6 meses de ayuno. Adulto: mas de 6 meses

Hbitos

Durante el da estn en el refugios y en la noche salen a alimentarse. Refugios domsticos y silvestres. El clima influye en la distribucin y reproduccin . Es comn que se desprendan de los techos, haciendo al caer un ruido notorio que puede alertar sobre su presencia. Necesita aproximadamente 20 minutos para succionar la cantidad necesaria de sangre.

Agregacin

Los triatminos, de hbitos nocturnos, se agregan especialmente al final de la noche; generalmente regresan a su refugio luego de chupar sangre y guiados por olores que ellos mismos han depositado all. En el refugio consiguen aparearse, proteccin y condiciones de humedad y temperatura ms favorables que en el exterior, de modo que all permanecen durante el da; la mayor parte del tiempo en un estado de inmovilidad. Se ha observado que si bien el comportamiento de agregacin es cclico, este no parece estar regulado de manera endgena por un reloj circadiano.

Estmulos relevantes

Tanto los olores como el calor que emanan del husped sirven de gua para localizar al husped. El dioxido de carbono de la respiracin, as como el amonio, aminas y cidos grasos de cadena corta que emanan de la piel, pelos y glndulas exocrinas de los animales vertebrados, atraen a los triatminos. Durante la noche los adultos de varias especies vuelan a domicilios humanos atrados por la luz. Los triatminos utilizan los termoreceptores de sus antenas para localizar los vasos sanguneos.

Bsqueda de Triatominos

En el peri-domicilio En el interior de la vivienda, cercana a la cama. Presencia de deyecciones en las paredes Identificacin del insecto.

Estudios Parasitolgicos

Bsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Identificar si se trata de un insecto de la subfamilia Triatominae (posible transmisor de la enfermedad de Chagas Mazza Tomar el insecto con la pinza

Bsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Liberar el contenido intestinal.

Con dos pinzas

Precauciones.

Guardapolvo, guantes, gafas y vidrio protector.

Observar al microscopio a 40x

Bsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Xenodiagnstico

Considerado el mtodo de referencia Sensibilidad: formas agudas 85 y 100%, 80% en las congnitas y entre 20 y 50% en las crnicas. Las cajas estn compuestas por ninfas de 3o a 4o estadio, con algunas semanas de ayuno y vidas de alimentarse. Se colocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca libre, cubierta con gasa; se utilizan 4 de estas cajas sobre la piel de los antebrazos.

Xenodiagnstico

Observar contenido intestinal entre los 30 a 60 o 90 das de la succin de sangre.

Se busca tripomastigotes o epimastigotes en el contenido intestinal.

Mtodo Strout

Es el mtodo de preferencia en la etapa aguda (hasta los

40 60 das post infeccin)

Reconocer la movilidad de los parsitos entre los hemates Se debe repetir en forma seriada (3 veces) Tambin se utiliza para control de tratamiento Para informar un Strout como positivo debemos observar la movilidad del parsito. IMPORTANTE: observar recorriendo todos los campos (no menos de 45 minutos) y varios preparados

600 rpm 2 min.

Suero

5-10 mL

Coag.

2500 rpm 10 min.

Sedimento T amb

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Sensibilidad 95%

Medicina Vol 59 Supl III 1999 De Rissio, AM; Maidana,CG; Martn Garca, MC y Ruiz, AM INPDr. Mario Fatala Chabn

Micromtodo de Strout

Se utiliza un tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad al que se le agrega una gota de heparina ms 0,5 ml de sangre venosa, se mezcla por inversin Centrifugar durante dos minutos a 3000 rpm. Tomar una gota de la interfase, rica en glbulos blancos, y se observa entre porta y cubreobjeto al microscopio con 400 aumentos. Deben observarse como mnimo 4 preparados. Sensibilidad similar al Strout Reduccin de cantidad de sangre a extraer.

J Clin Microbiol. 1983 August; 18(2): 327-330

H Feilij, L Muller and S M Gonzalez Cappa

Microhematocrito

Para diagnstico durante la etapa aguda o en los casos congnitos. Es importante extraer 6 tubos capilares (50 ul c/u) Sensibilidad semejante a strout Observar varios preparados con las consideraciones del strout Inconveniente: Bioseguridad

Cerrar extremo con plastilina

BIOSEGURIDAD

Cortar
6 a 9 microhematocrito heparinizado

45 segundos a 5000 rpm

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Sensibilidad 90 a 95%

Gota fresca

Mtodo que se puede efectuar en la etapa aguda De fcil realizacin De baja sensibilidad Observar movilidad de los parsitos.

Aumentar irrigacin

gota de citrato al 2%)

100x / 400x 45 minutos

Tripanosoma cruzi

Sensibilidad 50%

Gota gruesa

Mtodo sencillo Baja sensibilidad Observar morfologa del parsito

Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. Lavar y secar 1-2min

Dejar secar

Desfibrinar
Colocar 1 a 3 gotas

objetivo de 100x aceite

Tripanosoma cruzi

Sensibilidad 50%

Hemocultivo

Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el nmero de parsitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi. Es aplicable a la etapa aguda pero tambin en la crnica, en la cual disminuye en gran medida la sensibilidad. Requiere de un tiempo prolongado para obtener resultados. Se puede realizar una coloracin (Giemsa) para visualizar el tripanosoma con mayor definicin.

Sensibilidad:

Agudo: 80 100% Crnica:40 60%

PCR para Chagas

No est validad (solo para seguimiento de tratamiento) Tiene elevada sensibilidad (an en etapa crnica) Falsos positivos y algunos falsos negativos. Selectivo para T. cruzi y T. rangeli Amplifica un fragmento de 330 pb del ADN k
Mix p/1x30: 30ul

H2O: Buffer (10x) Taq: MgCl2 (25mM): dNTPs (5mM): Primer 121 (50pmol/ml): Primer 122 (50pmol/ml): Taq (0,8ul/20ul):

12,7 ul 3 ul 3,6 ul 1,5 ul 1,5 ul 1,5 ul 1,2 ul TOTAL: 25 ul (1x25ul) 25ul mix + 5 ul (muestra)

PCR para Chagas

Temperature 4C 94 C 94 C 68 C 72 C 94 C 64 C 72 C 72 C 4 C Time 3 minutos 3 minutes 1 minute 1 minute 1 minute 45 second 45 second 45 second 10 minutes Hold 5 cycles

35 cycles

Bibliografa

Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de la Trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas). Serie de Normas Tcnicas N 00. Lima, 2005 Fortalecimiento en la Enseanza de la Enfermedad de Chagas Diagnstico de Laboratorio Dra. Beatriz Basso* * Profesora, Servicio de Neonatologia, Ctedra de Pediatra y Neonatologa. Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Crdoba Universidad Nacional de Crdoba Parasitosis regionales. Un estudio referido a las principales parasitosis de Baha Blanca, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Sixto Ral Costamagna, Elena C. Visciarelli. Parasitosis Humanas. David Botero Marcos Restrepo. Tercera edicin La enfermedad de Chagas. A la puerta de los 100 aos del conocimiento de una endemia americana ancestral. Manual Prctico de Parasitologa Mdica. Dra. Nlida G. Saredi Clave pictrica de triatminos (Hemiptera: Triatominae) de Venezuela. Ana Soto-Vivas. Boletn de Malariologa y Salud Ambiental. Vol. XLIX, N 2, AgostoDiciembre, 2009 Aspectos exocoriales de huevos de Triatoma patagonica Del Ponte, 1929 por microscopa electrnica de barrido Elena VisciarelliI; Adriana FerreroII; Sixto Ral CostamagnaI. Departamento de Biologa, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Baha Blanca, Prov. de Buenos Aires, Argentina. E-mail: evisciar@criba.edu.ar ICtedra de Parasitologa Clnica. IICtedra de Zoologa de Invertebrados II Las especies de Triatominae de mayor adaptacin al hombre, tratadas en este trabajo. Hipotesis sobre el desarrollo de la Trypanosomiasis Americana Carpintero, D. J. y Viana, E.J. Buenos Aires, Argentina Alimentacin y defecacin en triatominos del gnero Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) alimentados con sangre humana. E. Aldana E.Lizano M.Rodrguez A. Valderrama. Recibido 28-IV-2000. Corregido 20-XI-2000. Aceptado 20-XI-2000 Ecologa de la enfermedad de Chagas, y su prevencin y control en la Amazonia. Un enfoque de ecosalud. Roberto Bazzani, IDRC/CRDI; Roberto Salvatella, OPS/OMS La aerotermia como alternativa para el control de Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) resistentes a deltametrina. Alberto G. GentileI; Jos L. SartiniII; Mara C. CamposIII; Juan F. SnchezIV. ICoordinacin de Gestin Epidemiolgica, Ministerio de Salud Pblica, Salta, Argentina Diagnstico Molecular de la enfermedad de Chagas. Constana Britto. Laboratorio de Biologa Molecular y Enfermedades Endmicas, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, 21040-900, Ro de Janeiro, RJ, Brasil. Correo electrnico: cbritto@ioc.fiocruz.br Utilidad de la tcnica de PCR. en el diagnstico de la enfermedad de Chagas. Bruss, Bettina L. - Lucero, Horacio - Gorodner, Jorge O. Departamento de Biologa Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.