UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CURSO: BIOLOGIA CELULAR

MTODOS PARA EL ESTUDIO DE LA CLULA

Mg. Fanny Elizabeth Lazo Manrique

2012-II

Lo que hemos visto es una clula animal tpica. Hasta que no se dispuso de buenos M. pticos a principios del siglo XIX, no se descubri que todos los tejidos animales y vegetales son agregados de clulas (Descubrimiento propuestos por Schleiden y Schwann en 1838 como la TEORA CELULAR, que marca el nacimiento formal de la BIOLOGA CELULAR. Cmo se estudian las clulas?

Las clulas son pequeas y complejas. Resulta difcil observar su estructura y descubrir su composicin molecular, pero resulta ms difcil dilucidar como funcionan sus componentes. Los que podemos aprender sobre ellas depende de las herramientas que tengamos a nuestra disposicin. Los mayores avances de la ciencia son frecuentemente fruto de la introduccin de nuevas tcnicas de estudio y por eso para entender la biologa celular es necesario conocer algo acerca de estos mtodos de estudio.

Empezaremos con las usadas para examinar la clula como un todo y despus con las tcnicas usadas para analizar sus constituyentes macromoleculares. Nuestro punto de partida ser : LA MICROSCOPIA.- La Biologa Celular empez con la M. ptica, la cul todava es una herramienta esencial junto con la M. electrnica (1940)y otras formas de radiacin. CULTIVOS CELULARES: Desde la observacin pasiva iremos hasta la intervencin activa, considerando como las clulas de diferentes tipos pueden ser separadas de los tejidos y crecer fuera del cuerpo Lneas primarias, secundarias y establecidas (clulas HeLa y L).

FRACCIONAMIENTO CELULAR: Cmo se pueden romper las clulas y aislar de forma pura sus orgnulos y constituyentes macromoleculares. Se usan agentes qumicos (sodio dodecil sulfato) y enzimas (lisozima). Adems la centrifugacin a diferentes velocidades.

COLORACIONES CITOLGICAS: Generalmente en base a la carga elctrica del colorante o del componente celular. Se usan colorantes para distintas partes de la clulas: Hematoxilina (ncleo), Eosina (citoplasma).

MARCADO ISOTPICO Y AUTORADIOGRAFA: Se utilizan tomos radioactivos como C14, N15, H3, P32, I125, Ca42 y se sigue su incorporacin en las molculas orgnicas por contadores de centelleo (Geiger-Muller). En autoradiografa los istopos son detectados en una emulsin fotogrfica.
DIFRACCIN DE RAYOS X MTODOS INMUNOLGICOS Se usan anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar principalmente protenas. CROMATOGRAFA Y ESPECTROFOTOMETRA

Tinciones Coloraciones
Las clulas animales no slo son diminutas, sino que tambin son incoloras y traslcidas, por ello, el descubrimiento de las principales caractersticas internas de la clula, dependi del hallazgo a fines del siglo XIX de diversos colorantes que proporcionaron el contraste suficiente para hacerlas visibles. Son tcnicas que permiten observar clulas y microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.

a) Organismos clulas vivas: - Tincin vital ( colorantes incuos) -Tincin supravital: adicin de colorante a clulas extirpadas de organismos (rojo neutro, verde de Janus, azul de metileno)

b)Tejidos Muertos: Biopsias

Obtencin, Fijacin, Inclusin, Cortes, Tincin y Montaje

Tipo de Colorantes 1.- Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, Hematoxilina , Hematoxilina frrica; derivados de la anilina (metacromatica) Azul de toluidina, azul de metileno, rojo neutro, verde de Janus.
2. - Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Nigrosina,cido pcrico diazoico:azul de tripano, rojo de interior En este Eosina, tripano

3- Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien (Negro sudn, Sudn III) Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos.

TIPO DE COLORACIONES -Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) .

-- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Nielsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante

-- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes

- M. Campo oscuro

- M. Fluorescencia

La microscopa es la tcnica de producir imgenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeos para ser percibidos a simple vista. la microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de radiacin incidente en el objeto de estudio.

El microscopio ptico, permite aumentar las imgenes de las clulas hasta 1500 veces y tener acceso a detalles hasta 0,25 m. Se requiere de tres elementos para visualizar una clula: 1) debe proyectarse una luz brillante en la muestra por la lente del condensador. 2) La muestra tiene que ser cuidadosamente preparada para que la luz pueda atravesarla. Un sistema de lentes apropiados (objetivo y ocular) y debe estar alineado para enfocar una imagen de la muestra en el ojo.

MICROSCOPIO DE LUZ Iluminacin Longitud onda Lentes Medio Resolucin Magnificacin Focalizacin Contraste de Haz de luz 2000 - 7500 Vidrio Atmsfera 2000 10 x - 2000 x Mecnica Absorcin - Reflexin

MICROSCOPIO ELECTRONICO Haz de electrones 0.037 - 0.086 Electromagnticas Vaco 3 100 x - 450000 x Elctrica Scattering

Poder de resolucin: Tamao de las clulas y de sus componentes, dibujado sobre una escala logartmica, indicando el intervalo de resolucin del M. ptico y el M. electrnico. m = 10-6m; nm= 10-9m

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

Es una manera sencilla de observar algunas caractersticas de una clula viva, no teida y consiste en usar luz dispersada por sus diversos componentes. Aqu los rayos luminosos del sistema de iluminacin son dirigidos desde la parte lateral, por lo que slo penetra en las lentes del microscopio la luz dispersada y la clula aparece como un objeto iluminado sobre un fondo negro.

Colorantes fluorescentes
Fluorescena (verde) y tetrametilrodamina (roja) Emiten luz amarilloverdosa y roja respectivamente cuando se activan con una luz de longitud de onda adecuada. La zona naranja indica la posicin de un grupo qumicamente reactivo, formandose un enlace covalente entre el colorante y una protena (-NH2)u otra molcula SH)

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Las molculas fluorescentes absorben la luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permite pasar la longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color es una caracterstica de la molcula fluorescente usada. La luz atravieza 2 sistemas de filtros: 1) El primero, filtra la luz antes de que llegue a la muestra y pasan solo las longitudes de onda que excitan al colorante fluorescente. 2) El segundo, bloquea esta luz, dejando pasar slo las longitudes de onda emitidas por el colorante fluorescente. Los objetos coloreados muestran un color brillante sobre un fondo oscuro.

Microscopa de fluorescencia_

Mtodo inmunolgicos: Se usan anticuerpos fluorescencia para detectar principalmente protenas.

marcados

con

Micrografa de una zona de la superficie de un embrin temprano de Drosophila, en el que se han marcado los microtbulos con un anticuerpo acoplado a fluorescena (micrografa de la izquierda) y los filamentos de actina con un anticuerpo acoplado a rodamina (micrografa central). Adems los cromosomas se han marcado con un tercer colorante que nicamente emite fluorescencia cuando se une a DNA (micrografa de la derecha) . En este estadio, todos los ncleos del embrin comparten un mismo citoplasma y estn en el estadio de metafase de la mitosis. Las tres micrografas fueron tomadas en la misma regin de un embrin fijado, utilizando tres juegos de filtros diferentes en el microscopio de fluorescencia.

Se pueden utilizar anticuerpos para detectar y aislar molculas determinadas.

A pesar de que se puede unir directamente una molcula marcadora, como un cololrante fluorescente a un anticuerpo que ser utilizado para el reconocimiento especfico (anticuerpo primario), se consigue una seal mayor utilizando el anticuerpo primario y luego detectndolo con un grupo de anticuerpos secundarios que se unen a l.

MTODO INMUNOENZIMTICO

Los mtodos de amplificacin ms sensibles utilizan una enzima como molcula marcadora, unida al anticuerpo secundario. As se puede utilizar la peroxidasa o la fosfatasa alcalina , esta ltima es una enzima que en presencia de los reactivos adecuados produce fosfato inorgnico que genera un precipitado coloreado. Este precipitado revela la presencia del anticuerpo secundario que est acoplado a la enzima y por lo tanto la localizacin del complejo antgeno-anticuerpo al que se ha unido el anticuerpo secundario. Como cada molcula de enzima acta catalticamente generando varios cientos de molculas de producto, este sistema permite la deteccin de diminutas cantidades de antgeno. Sobre este principio se han desarrollado inmunoensayos unidos a una enzima (ELISA de Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay))

Microscopia Electrnica
Permite la observacin de la ultraestructura.

Los electrones emitidos dentro de un tubo al vaci son acelerados y luego desviados a campos magnticos que actan como lentes pticas . La imagen se visualiza sobre una pantalla fluorescente y es producida por la dispersin de los electrones al chocar con los ncleos atmicos presentes en el objeto. Se usan tomos pesados que actan como colorantes electrnicos y aumentan el contraste.
Poder resolutivo 0,3 a 0,5 nm y aumento de un milln de veces a ms. Las macromolculas, caso de la estructura de membrana se estudia mediante la tcnica de fractura por congelacin seguida o no de grabado

BARRIDO ( Scanning) permite obtener una vista de superficie

del objeto utilizando los electrones secundarios emitidos ya que los electrones se reflejan en la superficie de la muestra y la imagen revela la morfologa superficial. Se pueden obtener imgenes tridimensionales.

TRASMISION (STEM) se utiliza un fino haz de electrones para

efectuar el barrido del corte (seccin fina de la muestra y revela la estructura interna ); los electrones dispersados son analizados con detectores especiales . Se obtiene imgenes de macromolculas sin colorear.

M. ELECTRONICA
1. FIJACION - GLUTARALDEHIDO 2. POST-FIJACION - OSMIO 3. DESHIDRATACION - ALCOHOLES 4. DESECACION DIOXIDO DE CARBON 5. INFILTRACION E INCLUSION - EPON 6. CORTE - ULTRAMICROTOMO 7. MONTAJE - REJILLAS 8. CONTRASTACION Y SOMBREADO- OSMIO Y CARBON

Visualizacin de microtbulos: comparacin de mtodos

Microscopio electrnico Inmunofluorescencia

 Otros dos mtodos que utilizan rplicas metlicas son:

1) Microscopia electrnica de criofractura

2) Microscopia congelacin. electrnica de grabado por

MICROSCOPIA ELECTRNICA DE CRIOFRACTURA: Para visualizar el interior de las membranas celulares. Las clulas se congelan a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C) en presencia de un crioprotector (anticongelante) para impedir la distorsin provocada por la formacin de cristales de hielo y el bloque se fracciona con una cuchilla. A menudo el corte pasa a travs del centro hidrofbico de las bicapas lipdicas, exponiendo as el interior de las membranas celulares. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino y las rplicas se observan al microscopio electrnico.

Microscopa de grabado por congelacin

La muestra es rpidamente congelada y el bloque de hielo es fracturado con una cuchilla. El nivel de hielo se reduce por sublimacin del agua en el vaco, de forma que las estructuras de la clula que se encuentran cerca del plano de fractura quedan al descubierto.

A continuacin, se prepara una rplica de la superficie todava congelada, pues las zonas de la clula expuestas a este proceso de grabado son sombreadas para conseguir una rplica de platino. Esta tcnica expones estructuras del interior de la clula y puede revelar su organizacin tridimensional con claridad al examinar con el microscopio electrnico de transmisin.

El sombreado metlico permite el examen a alta resolucin de detalles superficiales mediante el M. electrnico de transmisin.
Se usa con el M. electrnico de transmisin, con mayor resolucin para estudiar la superficie de una muestra que el M. de barrido, de modo que pueden verse macromolculas individuales. Sobre la muestra seca se evapora una fina pelcula de un metal pesado como el platino. El metal se vaporiza desde un ngulo oblicuo, de manera que se forma una capa que en algunos lugares es ms gruesa que en otros SOMBREADO, porque se crea un efecto de sombras que da una imagen de apariencia tridimensional. El material orgnico es eliminado por disolucin despus del sombreado de modo que tan slo quede la fina rplica matlica de la superficie de la muestra. La rplica se refuerza con una pelcula de carbono para que pueda ser colocada en una rejilla y examinada al M. electrnico .

Electromicrografia de una criofactura de la membrana del tilacoide de un cloroplasto de una clula vegetal

Las membranas del tilacoide se encuentran apiladas en mltiples capas. El plano de fractura se ha desplazado de capa a capa, pasando a travs de cada bicapa lipdica y exponiendo la protenas transmembrana que tienen un tamao en el interior de la bicapa suficiente para hacer sombra y aparecer como partculas intramembrana en esta rplica de platino. Las partculas mayores que se aprecian en la membrana son el fotosistema II completo-un complejo de mltiples protenas.

HERRAMIENTAS DE LA NANOTECNOLOGIA Los microscopios ven cosas a travs de lo que sienten con una punta muy afilada que est puesta en algo que parece un alfiler.

Microscopia de Barrido de Efecto Tunel

Microscopio de efecto tnel podramos definirlo como una mquina capaz de revelar la estructura atmica de las partculas. La tcnicas aplicadas se conocen tambin como "de barrido de tnel" y estn asociadas a la mecnica cuntica. Se basan en la capacidad de atrapar a los electrones que escapan en ese efecto tnel, para lograr una imagen de la estructura atmica de la materia con una alta resolucin, en la que cada tomo se puede distinguir de otro. as tambin las propiedades electrnicas

tomos del Hierro sobre e el Cobre

Microscopio de Fuerza Atmica

Los microscopios de fuerza atmica tambin son capaces de reconstruir tal relieve pero no hacen acopio del efecto tnel sino de la fuerza electromagntica entre la sonda y los electrones de la muestra a analizar: la sonda entra en contacto con la muestra y detecta los efectos atractivos o repulsivos de las fuerzas atmicas. La resolucin es similar al del efecto tnel pero se utiliza para materiales no conductores, como la mayora de muestras biolgicas ( cadena de ADN y hasta tomos individuales). En los microscopios, pasan una punta afilada sobre la superficie de objetos diminutos como transistores de silicona o molculas de ADN. La punta, que mide tan solo unos tomos, se mueve con mucha lentitud. Los mejores microscopios atmicos necesitan hasta diez segundos para captar una imagen, as que no pueden ser utilizados para el estudio de procesos rpidos.

Bacteria E. coli

Estudio de antibiticos sobre la superficie de clulas sanguneas

CULTIVOS CELULARES
Principal mtodo para estudiar a la clula viviente. Tcnica de crecimiento de clulas in vitro, reproducir las condiciones existentes in vivo. que permite

Burrows (1910) uso plasma de pollo para nutrir explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio revel ser mucho mejor que los anteriormente probados, permitiendo observar crecimiento de tejido nervioso, corazn y piel.

Burrows y Carrel (1912) realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de clulas de mamfero, consiguiendo mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias

R.G. Harrison (1907), padre de los cultivos de tejidos animales, fue el primero en emplear tcnicas in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos embrin de anfibios. Observo el crecimiento de axones de neuroblastos en una gota de linfa de Rana que colgaba de un cubreobjetos en una cmara sellada.

Rous y Jones (1916) emplearon por primera vez extractos de tripsina para disociar clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular.

Clulas disociadas mediante el uso de Tripsina

Entre los aos 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtencin de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estriles, pero sin grandes avances.

Grey, Coffman y Kubicek (1952) establecen la primera lnea celular contina, las actualmente bien conocidas clulas HeLa obtenidas de carcinoma humano, L y 3T3 de embrin de ratn 1961 se usaron por primera vez antibiticos para prevenir la contaminacin de los cultivos de fibroblastos, pudiendo mantenerlos durante 12 meses. Kohler y Milstein (1975) establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales.

CONDICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR (MICROAMBIENTE)

Medio de cultivo. Debe contener los nutrientes bsicos para la supervivencia de las clulas como y estimuladores (hormonas) que promuevan su diferenciacin y viabilidad. Gases (O2 y CO2) y pH. Debe garantizarse un 20% de O2 (atmosfricos) y un 5% de CO2 (tisular) en el sistema los cuales deben ser administrados con una adecuado sistema de ventilacin y filtros que garanticen la eliminacin de contaminantes. Osmolaridad-humedad. Debe garantizarse una ambiente hmedo, que evite la evaporacin del agua del medio de cultivo lo que incrementar lo osmolaridad del mismo. Temperatura. El estricto control de la temperatura es muy importante al tratarse de un factor crtico en la mayora de los experimentos con clulas de mamferos cuyo metabolismo ptimo es a 37 . Cuando en un experimento aparecen problemas y datos no explicables, la causa suele ser un deficiente ajuste de la temperatura.

Tipos de Cultivos
CULTIVOS PRIMARIOS: Se obtienen a partir de muestras de tejido que son tomadas directamente a partir de organismos vivos, los cuales son tratados mediante enzimas proteolticas a fin de disgregar las clulas inmediatamente son cultivadas en un medio apropiado por periodos cortos de tiempo dentro de los cuales se da el anlisis. CULTIVOS SECUNDARIO: una o varios tipos clulares de un cultivo primario se re-siembran (sub cultivo) LINEAS CELULARES: Estos son cultivos que se establecen a partir de la seleccin de un clon especifico proveniente de un cultivo primario tripsinado. De uso mas corriente son las lneas establecidas las cuales se han adaptado a un crecimiento prolongado in vitro por transformacin cancerosa. * Cultivos celulares obtenidos a partir de lneas celulares primarias, que hayan sufrido un fenmeno de transformacin (natural o no). Importante : por el poder ilimitado de proliferacin celular; Poder ilimitado de expansin (nmero ilimitado de generaciones). - Inmortalizacin celular. -

 Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de

plantas, produccin de vacunas antivirales,... Investigacin del Cncer

Inmunologa. Gracias especialmente a la introduccin de las tcnicas de fusin celular en la produccin de anticuerpos monoclonales, as como en el anlisis de la gentica de la clula somtica. Ingeniera de protenas. Por la produccin de protenas en lneas celulares: interfern, insulina, hormona de crecimiento. Estudios de interaccin y sealizacin celular, en la diferenciacin y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y de las vas de translocacin de la seal. Aplicaciones diagnsticas. Por ejemplo en medicina y farmacologa destacan el anlisis cromosmico de clulas crecidas a partir de muestras de amniocentesis, deteccin de infecciones virales, ensayos de toxicidad. Aplicaciones mdicas: mantenimiento y produccin de tejidos para transplante. Aplicaciones industriales y agronmicas: produccin por reproduccin "in vitro" de clones de plantas de inters comercial.

ANTICUERPOS MONOCLONALES Los anticuerpos monoclonales son glucoprotenas especializadas que hacen parte del sistema inmune, producidas por las clulas B, con la capacidad de reconocer molculas especficas (antgenos). Los anticuerpos monoclonales son herramientas esenciales en el mbito clnico y biotecnolgico, y han probado ser tiles en el diagnstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunolgicas y neoplsicas, as como tambin en el estudio de las interacciones patgenohospedero y la marcacin, deteccin y cuantificacin de diversas molculas.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

FRACCIONAMIENTO CELULAR
El fraccionamiento celular es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen por objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana plamtica, membrana total, complejos multiproteicos, citoesqueleto, poros nucleares, etc.

Etapas del fraccionamiento clular Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :

Rotura de clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin. Separacin de la fraccin deseada mediante algn criterio como diferencia de densidad (centrifugacin en gradientes o diferencial), presencia de antgenos (cromatografa de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.), etc.

Sonicacin en la cual se aplica ultrasonidos a la suspensin celular, producindose una intensa agitacin que destruye las membranas. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa se puede destruir estructuras subcelulares e incluso complejos proteicos.
Detergentes no ionicos que solubilizan la membrana celular. Homogenizadores. Los que rompen las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador.

20min

RE Ribosomas

1000G

10000G

105,000G

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION

La muestra se coloca sobre una solucin diluda de sacarosa y los componentes subcelulares sedimentan a diferentes velocidades de acuerdo con su tamao. Para estabilizar las bandas que sedimentan y evitar que se mezclen por fenmenos de conveccin originados cuando una solucin densa (una que contenga orgnulos), se halla en la parte superior de otra de menor densidad, el tubo contiene un gradiente continuo de sacarosa que aumenta de concentracin hacia el fondo del tubo (5 a 20% de sacarosa). El fondo del tubo tiene mayor densidad y se consigue que cada una de las regiones de la solucin de sacarosa sea ms densa que cualquier solucin superior. Despus de la centrifugacin, los diferentes componentes pueden recogerse por separado, el sistema ms sencillo consiste en perforar el tubo de centrifuga y recoger el medio gota a gota.

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACION

La ultracentrifuga tambin puede utilizarse para separar componentes celulares sobre la base de su densidad de flotacin, independientemente de su tamao o forma. La muestra se coloca en una capa en la parte superior o dispersa dentro de un pronunciado gradiente de densidad que contiene concentraciones muy altas de sacarosa o de cloruro de cesio. Cada componente subcelular se desplaza hacia arriba o hacia abajo cuando se centrifugan hasta que alcanzan una posicin donde su densidad coincide con la que le rodea y no se mover ms. Finalmente se producir una serie de bandas en la que las ms prximas al fondo del tubo contienen los componentes de densidad de flotacin ms elevados. El mtodo tambin se conoce como Centrifugacin por gradiente de densidad

DIFRACCION DE RAYOS X
Hace algo ms de un siglo, en 1895 W. K. Rntgen, cientfico alemn, descubri una radiacin, desconocida hasta entonces y que denomin rayos X, capaz de penetrar en los cuerpos opacos. Las aplicaciones de los rayos X en el campo de la Medicina son de todos conocidas, radiografas, tomografas, etc., pero su uso tambin se ha extendido a otras reas como la deteccin de microfracturas en metales o en el anlisis de obras de arte. El descubrimiento de los rayos X, y su aplicacin al estudio de materiales, revolucion a lo largo de los aos los campos de la Fsica, la Qumica y la Biologa. Los rayos X son radiaciones electromagnticas, como lo es la luz visible, y lo nico que los distingue de las dems radiaciones es su longitud de onda, del orden de 10-10 metros, que equivale a un ngstrom.

Definicin: Fenmeno ptico producido por la luz por la cual los rayos al atravesar una rejilla o cristal se separa en zonas claras y oscuras, es decir el cristal hace que algunos rayos se superpongan y se intersecten.

Esta propiedad de la luz utilizada tambin con los rayos X por su alta frecuencia , se emplea para analizar molculas biolgicas, de modo que se obtienen imgenes las cuales aplicando ecuaciones matemticas, computarizadas (como ley de Bragg o Series de Furrier) se logra la figura tridimensional de dicha muestra.
Esta tcnica permiti descubrir la estructura de la doble hlice del ADN en 1953 y actualmente se utiliza para determinar la estructura de las protenas. Los rayos X, como la luz son una forma de radiacin electromagntica pero de una longitud de onda mucho menor (alrededor de 0,1 nm) Si se dirige un haz estrecho y paralelo de rayos X a una muestra de protena pura, la mayora de rayos X pasaran a su travs. Sin embargo una pequea fraccin de ellos sern dispersados por los tomos de la muestra. Si la muestra es un cristal bien ordenado, los haces dispersados se reforzarn unos a otros en ciertos puntos y aparecern como manchas de difraccin, cuando los rayos X sean recogidos sobre un detector.

Conjunto de objetos y sus Correspondientes diagramas de dispersin / difraccin: (a) una molcula, (b) una repeticin en lnea de puntos (c) una repeticin en lnea de molculas en lnea de molculas. (d) una red puntual, y por fin (e) una red bidimensional de molculas.

La cruz formada por los puntos oscuros es caracterstico de molculas helicoidales como el ADN, Las mediciones de diversos aspectos del patrn sealan las dimensiones de la hlice del ADN. Por ejemplo la distancia entre los puntos en cruz corresponde a la distancia entre las vueltas de la hlice.

Separacin de protenas por cromatogtafa

MUCHAS GRACIAS