TCNICAS DE ESTUDIO DEL ADN Y LOS CROMOSOMAS

Hernndez Bendez, Mara del Rosario.

BANDEADO CROMOSMICO: G Y Q
El primer tipo de bandeado que se implement fue el llamado Q ( por la sustancia fluorescente empleada, quinacrina), que produce uno de los patrones de bandas ms informativos, aunque requiere microscopia de fluorescencia. Despus se comprob que se poda obtener el mismo patrn de bandeado mediante la extraccin selectiva de componentes cromosmicos con la enzima tripsina o con soluciones salinas y una tincin con el colorante de Giemsa; este patrn de bandas llamado G(de Giemsa), es el que se utiliza con mayor frecuencia como estndar.

El bandeado G es idntico al bandeado Q, excepto en las zonas heterocromticas de los cromosomas 1, 9 y 16 y en los satlites de los acrocntricos, que dan una tincin variable. Ambos patrones producen bandas que se relacionan con la composicin predominante de bases en el ADN de las regiones bandeadas. Las bandas oscuras del bandeado G y las brillantes (fluorescentes) del bandeado Q representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T, de manera que su coloracin es proporcional a la concentracin de A+T.

METAFASE MITTICA HUMANA TEIDA CON LA TCNICA DE BANDEO G

METAFASE MITTICA HUMANA TEIDA CON LA TCNICA DE BANDEO Q

BANDEADO CROMOSMICO: C, R Y N
El bandeado C (de constitutivo) tie solo la heterocromatina constitutiva, compuesta por ADN de tipo satlite. En consecuencia, es completamente diferente de los bandeados G y Q y solo tie las regiones centromricas y los bloques de heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del cromosoma Y. El procedimiento es diferente del clsico porque el material cromosmico se desnaturaliza y se extrae con lcali y se incuba en solucin salina para teirlo despus con Giemsa u otros colorantes.

Las bandas C indican los sitios en los que hay ADN altamente repetitivo que no se ha extrado. Este bandeado est indicado para la bsqueda de polimorfismos de heterocromatina. El bandeado R es el inverso del bandeado clsico ( G o Q ); las bandas claras de un tipo de bandeado son oscuras en el otro tipo; se usa la cromomicina A3 y las bandas ricas en C-G son las fluorescentes. El bandeado N o de los organizadores nucleolares (NOR) tie solo estas regiones; se utiliza nitrato de plata.

METAFASE MITTICA HUMANA TEIDA CON LA TCNICA DE BANDEO C

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR )

El mtodo se basa, en su forma ms simple en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucletidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa.

Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

La tcnica PCR es el mtodo de deteccin de secuencias de ADN ms sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco

Para lograr la duplicacin de un tramo de ADN, cada ciclo de la tcnica PCR incluye tres etapas: a) desnaturalizacin, durante la cual se separan las dos hebras constituyentes del ADN; b) apareamiento de los "iniciadores" o primers del tramo a replicar; c) extensin de las cadenas de primers gracias a la accin de una enzima ADN polimerasa. La repeticin de los ciclos permite multiplicar geomtricamente los tramos de ADN elegidos.

CARIOTIPO HUMANO
Esta clasificacin se basa en el tamao de los cromosomas y en la posicin relativa del centrmero; si el centrmero es central el cromosoma es metacntrico; cuando el centrmero est muy cerca de un extremo el cromosoma es acrocntrico y en los casos intermedios los crosomosomas son submetacntricos. En la especie humana no hay cromosomas con el centrmero en un extremo (telocntricos).

La clasificacin bsica de los cromosomas humanos comprende 7 grupos:

HIBRIDACIN IN SITU Y FLUORESCENCIA

La tcnica HISYF o FISH consiste en la identificacin de la regin cromosmica en la que se encuentra una secuencia determinada de un cido nucleico, detectada finalmente por una seal fluorescente. La base del procedimiento es lograr que la secuencia buscada del ADN celular se hibride con una secuencia preparada in vitro y rotulada con nucletidos marcados, en especial con biotina o con digoxigenina, sustancias que reaccionan especficamente con otras (la biotina reacciona con avidina y la digoxigenina con su anticuerpo, antidigoxigenina) que pueden ser acopladas con una sustancia fluorescente (fluorescena, rodamina)

La HISYF permite determinar en que cromosoma y en que regin est presente una secuencia de ADN, lo que es de gran utilidad para el mapeo del genoma humano porque inmediatamente se puede relacionar esa secuencia con todos los genes y secuencias marcadores ya conocidas en ese cromosoma. Adems la HISYF permite la identificacin inmediata y precisa de cada cromosoma por medio de sondas preparadas con secuencias especficas de ese cromosoma.

Tambin se ha desarrollado el llamado Pintado cromosmico que se realiza con una mezcla de varias sondas, cada una especfica de un cromosoma; como cada sonda es detectable con un colorante fluorescente de distinto color, en el mismo preparado es posible obtener, por ejemplo, la localizacin de dos cromosomas, identificables por su color de fluorescencia o de distintas regiones del mismo cromosoma, identificadas por colores diferentes.

La utilidad de la HISYF no se limita a cromosomas de clulas mitticas; esta tcnica tambin se puede utilizar en clulas interfsicas; esto permite reconocer por ejemplo, la presencia de una trisoma (como la del Sndrome de Down) por la seal triple que genera una sonda para ese cromosoma . Presenta ventajas obvias de rapidez y economa al no exigir cultivos ni cierto nmero de clulas en mitosis.

Otra explicacin importante es su uso en preparados histolgicos de rutina, en especial en los obtenidos por biopsia. En estos preparados realizados mediante cortes de parafina es posible realizar HISYF para detectar, por ejemplo, la presencia de un gen determinado o de un oncogn en las clulas de una biopsia efectuada varios aos atrs.

FISH DE UNA METAFASE MITTICA DE UNA MUJER EN

LA QUE SE OBSERVA UNA MICRODELECCIN PARA EL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA X