A purificao de lipase derivada de Burkholderia pseudomallei com lcool/sal bsico em sistemas de duas fases aquosas.

Purificaes de Bioprodutos 2012/02

Apresentao: Andr Felipe da Silva

Tcnica utilizada h cerca de 60 anos (1956) na purificao de antibiticos e cidos orgnicos.

Sensibilidade das protenas

A purificao o resultado de uma partio diferenciada. Elevado teor de gua (75-80% em massa) Purificao de Enzimas Baixa resoluo Fase aquosa + solvente orgnico

Fcil escalonamento, simples operao, seletiva e rpida

Leve

SOLUBILIDADE

Impurezas

Pesada COEFICIENTE DE PARTIO

 Sistemas polmero/polmero (PEG/dextrana)

Sistemas polmero/sal (PEG/ fosfato de potssio)

Sistemas lcool/sal (2-propanol/fosfato de potssio)

 Sistemas polmero/polmero (PEG/dextrana)

Sistemas polmero/sal (PEG/ fosfato de potssio)
Sistemas lcool/sal (2-propanol/fosfato de potssio)
Desvantagens: 1. Alto custo dos polmeros 2. Separao lenta das duas fases 3. Reciclagem dos materiais

 Sistemas polmero/polmero (PEG/dextrana)

Sistemas polmero/sal (PEG/ fosfato de potssio)

Sistemas lcool/sal (2-propanol/fosfato de potssio)

Vantagens: 1. Baixa viscosidade

2. Alta polaridade
3. Reciclagem dos materiais (evaporao) 4. Baixo custo e toxidadade

Coordenadas

Regio Pontosbifsica crticos

Curva binodal Regio Monofsica

Abcissas

Avalia a extenso de separao SDFA Caractersticas fsico-qumicas das protenas

CONCENTRAO DA MOLCULA DE INTERESSE

Gram-negativa/ bastonete Solos encharcados Utiliza muitas fontes de carbono Patognico (meiliodose) Propulso pH 6,8

Tolerante a muitos solventes Estabilidade trmica Purificada pro SDFA Sistema lcool/sal?

investigar a viabilidade da utilizao de um SDFA lcool/sal para recuperar lipase de origem bacteriana B. pseudomallei.

lcoois

Sais

100ml de meio caldo nutriente

pH = 9 37C 250rpm

72h

Inoculao 5% (v/v)

Tcnicas de preservao de culturas

Mistura de reao:
25L extrato de enzima 200L de tampo fosfato 0,05M (pH= 6,5) 5L Triton-X 25L de 0,02M pNPL 405 m 25C 30min

Mtodo do c. bicinconnico

Albumina do soro bovino padro

50L de amostra 200L de reagente de trabalho 37C 30min - 562 m

Diagrama de fases
Titulao ou cloud-point

Caractersticas
Simples e rpido Impreciso Teste inverso
Regio monofsica (transparente) gua destilada

massa conhecida
SDFA Determina-se nova massa

Experimento de partio

Sistemas de fases
Quantidade apropriada de lcool Soluo de sal 40% Soluo da enzima bruta 20%

15ml massa final = 10g

gua destilada

Ensaio da lipase e BCA

4000 x g 10min

meno dos volumes

Determinao da seletividade, fator de purificao e rendimento

concentrao da protena

= =

coeficiente de partio atividade da lipase

(%) = + ( )

SDS-PAGE

Protenas da fase superior

TCA 10% Remoo de sais Tampo de desnaturao 100mM Tris-HCl pH 6,8 SDS 4% 2-mercaptoetanol 10% Glicerol 20% Azul de bromofenol Azul de Coomassie

Visualizao

SDS-PAGE

Protenas da fase superior

TCA 10% Remoo de sais Tampo de desnaturao 100mM Tris-HCl pH 6,8 SDS 4% 2-mercaptoetanol 10% Glicerol 20% Azul de bromofenol Azul de Coomassie

Visualizao

SDS-PAGE

Protenas da fase superior

TCA 10% Remoo de sais Tampo de desnaturao 100mM Tris-HCl pH 6,8 SDS 4% 2-mercaptoetanol 10% Glicerol 20% Azul de bromofenol Azul de Coomassie

Visualizao

Composio de fase na atividade da lipase

Composies de fase Concentrao Atividade relativa
Controle Etanol 1-propanol 2-propanol Fosfato de potssio Sulfato de amnio Citrato de sdio 40 80 40 80 40 80 20 40 Estvel em na 20presena de 40 todos 20 40 100,0 100,2 93,8 102,1 110,0 99,5 101,5 158,3 132,7 46,5 27,3 102,6 79,4

Concentrao do lcool (v/v), concentrao do sal (w/v), erro: 5%

Composies de fase Concentrao Atividade relativa

Controle Etanol 1-propanol 2-propanol Fosfato de potssio Sulfato de amnio Citrato de sdio 40 80 40 80 40 80 20 40 20 40 20 40 100,0 100,2 93,8 102,1 110,0 99,5 101,5 158,3 132,7 46,5 27,3 102,6 79,4

Concentrao do lcool (v/v), concentrao do sal (w/v), erro: 5%

Composies de fase Concentrao Atividade relativa

Controle Etanol 1-propanol 2-propanol Fosfato de potssio Sulfato de amnio Citrato de sdio 40 80 40 80 40 80 20 40 20 40 20 40 100,0 100,2 93,8 102,1 110,0 99,5 101,5 158,3 132,7 46,5 27,3 102,6 79,4

Inibio

Saltingout

Concentrao do lcool (v/v), concentrao do sal (w/v), erro: 5%

Longe da origem (maior + curto/instvel hidrofbico polaridade)

Sistema
Etanol/(NH 4)2SO 4 Etanol/fosfato Etanol/citrato 2-propanol/ (NH 4)2 SO4 2-propanol/fosfato

[ ] de lcool / sal pH Seletividade P FT Rendimento (%) 5,5121,6 8,2 99,7 24/26

6,0

20/20

9,09,5 8,08,3 5,56,0 9,09,5

238,8

11,3

99,8

24/26
18/20 16/16

199,5
168,5 287,5

9,1
7,4 12,7

99,9
99,0 99,3

2-propanol/citrato
1-propanol/ (NH4) 2SO 4 1-propanol/fosfato 1-propanol/fosfato

18/20
18/20 16/16 18/20

8,08,3
5,56,0 9,09,5 8,08,3

143,6
7,9 5,8 9,4

10,3
7,2 6,4 8,6

99,1
92,8 76,0 83,9

Sistema
Etanol/(NH 4)2SO 4 Etanol/fosfato Etanol/citrato 2-propanol/ (NH 4)2 SO4 2-propanol/fosfato

[ ] de lcool / sal pH Seletividade P FT Rendimento (%) 5,5121,6 8,2 99,7 24/26

6,0

20/20

9,09,5 8,08,3 5,56,0 9,09,5

238,8

11,3

99,8

24/26
18/20 16/16

199,5
168,5 287,5

9,1
7,4 12,7

99,9
99,0 99,3

2-propanol/citrato
1-propanol/ (NH4) 2SO 4 1-propanol/fosfato 1-propanol/fosfato

18/20
18/20 16/16 18/20

8,08,3
5,56,0 9,09,5 8,08,3

143,6
7,9 5,8 9,4

10,3
7,2 6,4 8,6

99,1
92,8 76,0 83,9

Sistema
Etanol/(NH 4)2SO 4 Etanol/fosfato Etanol/citrato 2-propanol/ (NH 4)2 SO4 2-propanol/fosfato

[ ] de lcool / sal pH Seletividade P FT Rendimento (%) 5,5121,6 8,2 99,7 24/26

6,0

20/20

9,09,5 8,08,3 5,56,0 9,09,5

238,8

11,3

99,8

24/26
18/20 16/16

199,5
168,5 287,5

9,1
7,4 12,7

99,9
99,0 99,3

2-propanol/citrato
1-propanol/ (NH4) 2SO 4 1-propanol/fosfato 1-propanol/fosfato

18/20
18/20 16/16 18/20

8,08,3
5,56,0 9,09,5 8,08,3

143,6 Enzimtica 10,3 na fase99,1 Atividade fundo

7,9 5,8 9,4 7,2 6,4 8,6 92,8 76,0 83,9

O sistema ideal: 2-propanol/fosfato de potssio

pI lipase= 6,3 HPO

Lipase hidrofobicidade

Componente de fase
25 testes
2-propanol (% w / w) Fosfato (% w / w)

Seletividade
302,1 85,5 87,5 81,3 126,8 145,8 84,9 124,7 109,5 21,8 9,5 1,9 0,1

Purificao ( P FT )
12,6 8,8 6,9 7,2 10,0 10,8 8,2 11,8 10,6 0,9 0,7 0,8 0,9

16 16 16 16 16 19 19 22 22 25 25 28 28

16 19 22 25 28 16 19 16 19 16 19 25 28

368,9

13,5

O experimento foi realizado em duplicata e fez-se a mdia, erro: 10%

Enzima Enzima bruta purificada Amostras da fase topo

66,5 kDa

39,5 kDa

A melhor recuperao foi no sistema bifsico

Tolerncia a muitos solventes A atividade enzimtica Facilidade da recuperao do solvente e relao custo-eficcia

Referncias Bibliogrficas

Qualquer dvida!