Universidade Federal do Vale do So Francisco UNIVASF Curso de Graduao em Medicina Disciplina: Microbiologia Docente: Csar Augusto

Discentes: Carla Larissa Felipe Diego Juliana Conduru Lucas Torres Roberta Magalhes

TESTES SOROLGICOS

TESTES SOROLGICOS
O que medem? Os Ac dirigidos contra antgenos microbianos especficos. A maioria consiste em ensaios em fase slida. Objetivo da reao sorolgica:
AG

AC

ELISA

ELISA
ENZIME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (enzimaimunoensaio) Tcnica de imunoensaio in vitro. PRINCIPIO BSICO: imobilizao de um dos reagentes em uma fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservao da atividade enzimtica e imunolgica do anticorpo.

ELISA
Placas de microtitulao
Suporte slido Tubos
Poliestireno

Identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra;

ELISA
Elementos necessrios:
Ag purificado; Ac purificado; Placa de poliestireno; Tampo de lavagem. Cromgeno.

Leitora de Elisa;

ELISA
TIPOS: o INDIRETO: detecta Ac o DIRETO OU SANDUICHE: detecta Ag o COMPETIO: detecta Ag com baixo peso molecular; o CAPTURA: detecta Acs (principalmente IgM)

1. O Ag add placa e se adere superficie dos poos.

ELISA indireto

.Lavagem para retirada de Ag livre: .Adio de soro-teste: (1) e (2)

.Lavagem para retirada de Ac no fixado: .Adio do conjugado:

.Lavagem para retirada de conjugado livre .Adio de substrato e cromgeno que ativado pela parte enzimtica do conjugado

.Positivo

.Negativo

Interpretao
Cont. negativo Cut-off Cont. positivo

Aplicaes do Elisa indireto: Exemplos : diagnstico sorolgico da Doena de Chagas e da SIDA/AIDS

ELISA sanduche
1. 2. Um Ac add placa e se liga sua superficie. Lavagens so feitas para retirar os anticorpos livres.

3. Adio de soluo-teste com Ag a ser pesquisado, e este, caso presente, se liga aos Ac nos poos.

4. Lavagem para retirada do Ag no capturado

5. Adio de outro Ac marcado, nova lavagem e revelao

Aplicao do Elisa sanduche

Dosagem de hormnios, marcadores tumorais e outras protenas sricas, bem como para a deteco de antgenos virais e de outros patgenos, nas fezes, na urina em secrees etc. Exemplos na medicina: Teste de gravidez (teste de deteco da gonadotropina corinica humana (HCG) no soro.

ELISA por competio

1. Adio do Ac especifico aos micropoos da placa. 2. Lavagem para retirar os Ac livres

3. Adio de Ag-teste: Adio de Ag-marcado: Competio para ligar Ac 4. Lavagem para retirada de Ag no capturados.

Quanto maior a quantidade de antigenoteste, < a possibilidade de ligao do Ag marcado e < a intensidade de cor emitida.

Aplicao:
Na dosagem de hormnios, marcadores tumorais e outras protenas sricas. No diagnstico sorolgico de algumas doenas como SIDA/AIDS

5. Adio do substrato e do cromgeno. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac, ocorrera reao enzimtica e o cromogeno ser oxidado, havendo desenvolvimento de cor.

ELISA de Captura
Pesquisa de IgM humana contra T.gondii:

-Poo revestido com IgG monoclonal contra IgM humano

-Adio da amostra (contendo IgM) -Lavagem para retirar o anticorpo no capturado

-Adio de Ag especifico marcado com enzima -Lavagem

-Adio de cromgeno (

-Revelao: leitura em fotocolormetro.

Utilizao do ELISA captura:

Deteco de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antgenos , em todas as doenas em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubola, toxoplasmose ou citomegalia da gestante.

Infeces na fase aguda.

ELISA
Vantagens: Alta sensibilidade Menor risco de falsosnegativos; Alta especificidade Menor risco de falsopositivo; Vrias amostras simultaneamente; Rpido, simples, custo baixo a mdio;

ELISA
Desvantagens: Mo de obra especializada; Degradao de reagentes; Erros de pipetagem;

SDS - PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida

SDS - PAGE
SDS-PAGE a abreviatura de dodecil-sulfato de sdio (SDS) de poliacrilamida (PAGE). um mtodo muito utilizado para a anlise de massas moleculares de protenas.

SDS - PAGE
As protenas so misturadas ao detergente SDS, cuja funo desnaturar as protenas e converte-las numa estrutura linear. O SDS, tambm, confere carga negativa s protenas.

SDS - PAGE
As protenas so aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida. So submetidas a uma corrente eltrica, fazendo com que elas migrem atravs da malha de acrilamida em direo ao plo positivo.

SDS - PAGE
As protenas menores migraro mais rapidamente, enquanto que as maiores tero mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se movero mais lentamente.

SDS - PAGE

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT
Western Blot um mtodo usado para detectar uma certa protena em uma amostra, usando anticorpo especfico para aquela protena. Alm disso, esta tcnica tambm d informao acerca do tamanho da protena. Eletroforese de protenas. Identifica antgenos ou anticorpos.

WESTERN BLOT
Serve como teste confirmatrio dos resultados obtidos em testes imunoenzimaticos.

WESTERN BLOT
Mtodo de execuo de Western Blot:

Mtodo de um passo; 1. Preparao do tecido; 2. Eletroforese em gel; 6. Deteco Deteco colorimtrica; 3. Transferncia; Quimioluminescncia; 4. Bloqueio; Deteco radioativa; 5. Deteco; Deteco fluorescente;

Mtodo de dois passos:

Anticorpo primrio; Anticorpo secundrio.

a) b)

7. Sondagem secundaria. 8. Analise.

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT
Tcnica: 1) Preparo das amostras e eletroforese em gel (SDSPAGE)

WESTERN BLOT
Tcnica:
2) Transferncia para a membrana (nitrocelulose ou PVDF)

WESTERN BLOT
Tcnica: 3) Bloqueio da membrana e incubao com ac primrio:

4) Incubao com ac secundrio acoplado ao sistema de

revelao:

WESTERN BLOT
Tcnica:
A revelao pode ser feita com um substrato colorimtrico (ex: TMB), que produzir uma banda colorida.

A revelao pode ser feita com um substrato quimioluminescente (ex. ECL), que produzir uma banda colorida

WESTERN BLOT
Resumo:

WESTERN BLOT
Aplicao em diagnsticos mdicos:
A tcnica western blot tem sua aplicao muito importante em diagnsticos mdicos, o qual ajuda na deteco dos anticorpos, produzidos por ns, de varias doenas, como por exemplo a AIDS, a doena da Vaca Louca e outras.

WESTERN BLOT
Concluso: O Western Blot o exame mais especifico para a deteco de protenas virais. Esse mtodo utiliza eletroforese em gel para obter o resultado esperado. Ele muito utilizado em testes imunoenzimticos. Utilizado em exames confirmatrios de doenas, como a doena da vaca louca e doena de Lyme. A tcnica Western Blot foi e para a medicina um grande avano, pois atravs deste podemos dizer com preciso resultados de doenas como a AIDS entre outras.

AGLUTINAO

AGLUTINAO
Consiste na formao de agregados visveis como resultado da interao de anticorpos especficos e partculas insolveis que contm determinados antgenos em sua superfcie.

AGLUTINAO
Dois estgios:
1 - Ag + Ac 2 - Agregados Comeam concomitantemente Um demora mais que o outro
1

AGLUTINAO
Pode ocorrer com partculas:

Naturais; Inertes; De acordo com o tipo de partcula so classificadas:

Aglutinao direta; Aglutinao indireta.

AGLUTINAO

Sensibilidade; Concentrao de anticorpos.

Fatores que interferem na formao de agregados:

Tipo de anticorpo; Temperatura; pH; Enzimas.

AGLUTINAO
Aplicao: Diagnstico laboratorial de doenas:
- Virais; - Bacterianas; - Auto-imunes; - Hormonais;

Tipagem sangunea.

 Utilizam-se partculas antignicas insolveis na sua forma ntegra ou fragmentada. Hemcias: tipagem de grupos sanguneos ABO e Rh. Bactrias, espiroquetas, protozorios: teste de Widal (salmoneloses), teste de Wright (brucelose), teste de Weil-Felix (Rickettiose), teste de aglutinao para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomase.

Teste de inibio de hemaglutinao direta Capacidade que certos antgenos tm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemcias. Anticorpos + partculas virais = inibio til para detectar Ac contra o vrus da rubola, do sarampo, da influenza, dentre outros.

As hemcias ou partculas inertes podem se sensibilizar por:

Adsoro passiva; Adsoro via agentes qumicos; Conjugao do antgeno. Devido grande variedade de antgenos que podem ligarse clulas ou partculas, sua aplicao bem variada.

Teste de hemaglutinao passiva Aps a sensibilizao das hemcias com a concentrao adequada de antgenos, so suspensas em soluo estabilizadora, para evitar reaes inespecficas sem diminuir a capacidade de aglutinao especfica.

Teste em placas: Pequena quantidade de reagente; + : formao de tapete em V - : sedimentao em boto

Teste de inibio da hemaglutinao passiva

Sensvel e especfico na deteco de pequenas quantidades de antgenos solveis ou anticorpos que competem com a substncia homloga com que a hemcia foi sensibilizada.

Depende:
Concentrao do antgeno; Afinidade pelos stios de ligao de combinao.

 Especificidade;
Pouca quantidade de antgeno;

Aplicao: Deteco de antgenos na hepatite e hemofilia.

AGLUTINAO
Teste de aglutinao do ltex: O ltex utilizado como suporte na adsoro de protena solvel e antgenos polissacardicos, funcionando como sistema indicador da reao Ag + Ac.
Aplicao: Pesquisa de Ag ou Ac; Fator reumatide (Ac IgM).

AGLUTINAO
Deteco do fator reumatide:
Ac IgG adsorvidos s partculas de ltex;

Reao com o fator reumatide;

Aglutinao;

CITOMETRIA DE FLUXO

CITOMETRIA DE FLUXO
Tcnica utilizada para contar, examinar e classificar partculas microscpicas suspensas em meio lquido em fluxo.

CITOMETRIA DE FLUXO
Tecidos pesquisados: Sangue Urina Exsudatos Bile Lavado brnquico Fezes Biopsias

CITOMETRIA DE FLUXO
A tcnica:
As clulas e outras partculas passam por um feixe de luz de nico comprimento de onda, geralmente um laser, e dispersam essa luz em comprimentos diferentes a depender da morfologia da clula. Detectores localizados em frente ao feixe (Forward Scatter, FSC) e perpendiculares a ele (Side Scatter, SSC) identificam os diferentes comprimentos de onda e os transmitem para computadores para digitalizao das informaes.

CITOMETRIA DE FLUXO

CITOMETRIA DE FLUXO
Diagnstico: possvel identificar antgenos virais dentro e sobre a superfcie de clulas infectadas e detectar cidos nuclicos virais. Detecta-se tambm imunoglobulinas especficas, caracterizando o micrbio. Utiliza-se adio de microesferas que se ligam ao antgeno do microorganismo e de fluorocromos aos anticorpos.

CITOMETRIA DE FLUXO
Diagnstico: HIV Vrus sincicial respiratrio Trypanosoma cruzi Leishmania chagasi Mycobacterium tuberculosis Cryptosporidium hominis e C. parvum

REFERNCIAS
FERREIRA, Antonio Walter; VILA, Sandra do Lago Moraes de. Diagnstico laboratorial: avaliao de mtodos de diagnstico das principais doenas infecciosas e parasitrias e auto-imunes. correlao clnicolaboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 443 p. ISBN 8527706296
http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm, acesso em 14 de novembro de 2012 http://imunologiahematologia.wordpress.com/2010/06/14/sds-page, acesso em 14 de novembro de 2012 http://www.youtube.com/watch?v=J5qPKK0GGDo acesso em 19 de novembro de 2012.