Electroforesis o cataforesis

Es el movimiento de molculas o partculas cargadas en un campo elctrico Se puede realizar con propsitos analticos de identificacin o para caracterizacin fsica de los componentes de una muestra o para su separacin preparativa. Se usa para analizar y separa molculas (ej. protenas) o para depositar recubrimientos, como en los elementos usados en los tubos de electrones.

Electroforesis o cataforesis
La migracin electrofortica de una molcula puede realizarse dentro de cualquier medio pero generalmente es una matriz. Si el fluido es el que se pone en movimiento, por ejemplo a travs de un diafragma fijo, se le llama electrosmosis.

Movimiento de molculas en la electroforesis

Las molculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molcula (los cationes se mueven hacia el ctodo y los aniones hacia el nodo). El medio necesita estar amortiguado al pH que produce la direccin y taza apropiada de migracin.

Electroforesis
ctodo

() +

++

nodo

(+)

Movilidad y pI
Las movilidades de las protenas se incrementan proporcionalmente al alejamiento de sus puntos isoelctricos ya que se incremente su carga neta. Los cidos nucleicos y las protenas en presencia de SDS presentan movilidades ms altas en un rango de pH arriba de la neutralidad.

Factores que afectan la movilidad electrofortica

Composicin del solvente
Presencia de detergentes

Temperatura Fuerza inica

Ejemplos: la estabilidad de los cidos nucleicos depende de los iones Na+ Las protenas se agregar a bajas fuerzas inicas Altas fuerzas inicas pueden sobrepasar la disipacin de calor de Joule del aparato de electroforesis

Invencin
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937 Desarroll la moving boundary, que se convertira en la electroforesis zonal y la utiliz para separar protenas del suero.

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-71)

Tesis (1930): The moving-boundary method of studying the electrophoresis of proteins" (publicado en Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, 7, No. 4) (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the Faraday Society, 33 524.

Tubo de Tiselius
nodo Ctodo

+
Lmite o frontera ascendente Fronteras iniciales

Amortiguador Lmite o frontera descendente

Molculas de protena

Desarrollo
La electroforesis se desarrollo completamente de los aos 40s a los 50s. Se utiliz para separar molculas que van desde las protenas ms grandes, aminocidos y hasta iones inorgnicos.

Aplicaciones
Bioqumica Qumica clnica, forense, de alimentos Toxicologa Farmacia, farmacologa Enzimologa, inmunologa Microbiologa, Botnica, citologa, Biologa Molecular, etc.

Electroforesis zonal
Empleando geles de slice o de acetato de celulosa y aplicando las protenas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta entre protenas (carga total/masa). Este mtodo se denomina electroforesis zonal.

 Adems de la electroforesis zonal, se desarrollaron dos otros tipos: Isoelectoenfoque e isotacoforesis. Estos tres mtodos se basan en propiedades fsicas diferentes. Es posible hacer tres anlisis separados sobre una misma muestra o los mtodos se pueden combinar.

Diversificacin de soportes
Los soportes o matrices sobre los que se ha realizado la electroforesis se ha diversificado durante el tiempo de desarrollo de la electroforesis. Se ha observado que diferentes matrices dan diferentes ventajas para diferentes tipos de muestras. Algunas matrices utilizadas han sido geles de polmeros, papeles o capilares.

Papel
Fue el primer soporte usado en las tcnicas de electroforesis desarrolladas para separar compuestos (Tiselius, 1937). Es fcil de usar porque no se requiere preparacin de la matriz. Es limitada su capacidad resolutiva. En 1957, Kohn us acetato de celulosa como medio de soporte.
Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

Almidn
Para ver esta pelcu la, de be disponer de QuickTime y de un descompresor TIFF (sin comprimir).

Smithies us un gel de almidn como medio para electroforesis en 1955.

Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.

Capilares
Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares como matrices para la electroforesis a principios de los 1980's.

Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

Poliacrilamida
En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub utilizaron geles de poliacrilamida.

Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.

Velocidad de migracin
Es proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin.

Velocidad y movilidad de las molculas en una electroforesis

V=
Movilidad =

EQ

F
m = V E
= Q F

V, velocidad E, campo elctrico Q, carga neta F, coeficiente de friccin

Poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente formador de enlaces cruzados (cross-linking), la bis-acrilamida.

Reaccin de polimerizacin
La reaccin se desencadena por la presencia de un iniciador y se continua con ayuda de un catalizador.
El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se aade en forma de persulfato amnico (APS). Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'tetrametilendiamina). En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean otros sistemas catalizador-iniciador.

Oxgeno y polimerizacin
El oxgeno es un inhibidor de la polimerizacin de la acrilamida, por lo que Las soluciones de acrilamida se desgasifican para que la polimerizacin sea completa y a con buena velocidad. Adems, durante la polimerizacin se libera calor (reaccin exotrmica), lo que podra provocar la formacin de burbujas en el seno del gel.

 La velocidad de polimerizacin es proporcional a la concentracin de persulfato (iniciador) y TEMED (catalizador) adicionados.

 La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida Es menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida se use. El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del gel. Los geles se denominan en funcin del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. La mayora de las protenas se separan bien en el rango 5 a 15%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.

Radicales libres en la polimerizacin de la acrilamida

S2O8= SO4 .

Persulfato

Sulfato radical libre

SO4 .

+ CH2= CH C NH2
Acrilamida

CH2 CH C .

NH2

Acrilamida radical libre

Enlace acrilamida - bisacrilamida

O CH2 C C CH2 CH CH 2 O CH2 CH2 C O C C CH2 CH2 C

CH2 O

CH2

CH2

Estructura de la poliacrilamida

Ventajas de los geles de poliacrilamida

Qumicamente inertes, Transparentes Estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza inica.

CH2

N (CH2)n

(CH2)n

CH2

CH2

CH2

(CH2)n

Relaciones %T y %C
%T = a %C =

+ m
b +

X 100% X 100%

a = acrilamida (g) b = N,N-metilenbisacrilamida m = volumen final (ml)

 C, es crtica si es menor a 10 los geles son rgidos y opacos si excede 100 en geles con 5 % de acrilamida son pastosos y se rompen. Geles elsticos y completamente transparentes se obtienen con C de 30 y con acrilamida superior al 3%

 No hay gelificacin si la acrilamida es menor al 2% y la Bis menor a 0.5%.

Para que los geles sean elsticos la concentracin de bisacrilamida debe disminuir. Puede usarse la frmula : C = 6.5 - 0.3T en un rango de 5-20% de acrilamida

 Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando encuentran en un campo elctrico.

Electroforesis nativa
Las protenas se someten a una migracin sin desnaturalizacin. Las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre subunidades y entre protenas. Los sistemas amortiguadores (tampn) usados son :
tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

Electroforesis desnaturalizante
Somete a las protenas a migracin asegurando su desnaturalizacin completa (prdida de la estructura tridimensional). La migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms empleado es el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

Sistemas de amortiguadores
Se puede realizar empleando sistemas de uno o ms amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas amortiguadores continuos o discontinuos. En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer gel asegura la migracin de todas las protenas en el frente de migracin, provocando la acumulacin de todas las que se han cargado en el pozo. La separacin realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migracin alcanza la frontera del segundo tampn.

PAGE
La electroforesis de protenas en geles en una matriz de poliacrilamida es denominada electroforesis en poliacrilamida o PAGE, (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis). Es una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas. Es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra, pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.

PAGE -SDS
Su nombre significa Electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (SDS-polyacrilamide gel electrophoresis). PAGE-SDS es la electroforesis de protenas ms ampliamente usada. Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277:680)

PAGE -SDS
Electroforesis desnaturalizante Las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes:
beta-mercaptoetanol, destruye los puentes disulfuro, SDS, desnaturaliza y recubre a la protena y se separan como cadenas polipeptdicas aisladas.

PAGE -SDS
Se emplea un sistema de dos tampones (discontinuo). Permite la separacin de volmenes relativamente grandes de muestra sin prdida de resolucin. La concentracin se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking').

PAGE -SDS
El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en que:
los iones glicinato, cargados negativamente de manera incompleta (en el amortiguador superior) tienen una movilidad electrofortica inferior que los complejos de protenas-SDS, Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que los iones Cl- del amotiguador de muestra en el gel de compactacin (stacking).

PAGE -SDS
Cuando se someten las protenas a el campo elctrico todas las especies deben migrar a la misma velocidad para mantener el circuito elctrico. Los iones glicinato slo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl- si hay una regin de con un gradiente de alto voltaje. El gradiente es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentracin.

PAGE -SDS
El resultado es que las tres especies de inters ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [protena-SDS] > [glicinato-]. Como slo hay una pequea concentracin de protenaSDS este complejo se concentra en una banda muy delgada entre las fronteras de migracin del Cl- y del glicinato-. Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de separacin adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el glicinato- y el Cl- deja atrs a los complejos de protena-SDS que se desplazarn a su propia velocidad.

SDS
Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio. Detergente aninico Desnaturalizante Se une a las cadenas polipeptdicas con una relacin de 1.4 g de SDS por g de protena, aproximadamente una molcula de SDS por cada dos aminocidos de la cadena.

SDS
La unin masiva de molculas de SDS bloquea la carga propia de la molcula de protena Le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa. Todas las protenas acomplejadas con SDS viajan hacia el nodo.

SDS
La separacin de los complejos SDS-protena es
proporcional slo a la masa de la protena pues todas tienen la misma carga por unidad de masa.

Se puede determinar el peso molecular aparente de cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

Inicio de la PAGE discontinua

Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser variable en cada muestra aunque la cantidad de protena debe ser constante.
Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3 Muestra Tris-HCl, pH 6.8

Gel de compactacin Tris-HCl, pH 6.8 Gel de resolucin Tris-HCl, pH 8.8

Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3

Compactacin (stacking)
Las protenas se focalizan (compactan) formando una banda delgada

El primer gel o gel de compactacin (stacking) es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamid a) y tiene un pH ms cido que el segundo gel.

Separacin en el gel resolutivo.

El segundo gel, o gel de resolucin, es el que realmente separa a las protenas. Presenta un poro menor y un pH de 8.8.

Protenas fraccionadas en el gel de separacin

Frontera Glicina/cloruro

Relacin entre la movilidad electrofortica y la masa molecular (PAGE-SDS)

kDa 200

Logaritmo de la Masa molecular

100 50 40 30 20 0 0 0

6 0.5

8 0.66

10 0.8

12 1

0.16 0.33

Movilidad electrofortica (cm) Movilidad relativa

Geles en gradiente
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.

Caractersticas de los geles en gradiente.

Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes lineales o cncavos. El rango a emplear depender del tamao de las protenas a separar. En un gel en gradiente la protena migra hasta que alcanza una zona donde el tamao de poro impide cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite de poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente.

Ventajas
Resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones muy estrechas. Incrementa el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.

Preparacin de gradientes
Los geles en gradiente se preparan mezclando las soluciones de acrilamida de las concentraciones extremas en un formador de gradientes. Se suele adoptar la inclusin en la solucin de polimerizacin de glicerol o sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de preparacin del gradiente.

Formadores de gradientes
Cncavos Lineales

Estructura de la Agarosa

Tipos de EF
Electroforesis el geles en gradiente Electroforesis Andica (protenas acidicas o neutras) Electroforesis catdica (protenas bsica) PAGE-SDS
Websert y Osborn (fosfato) (OFarrel) Anderson y Anderson

Isolectroenfoque
Denominada electroenfoque o isofocalizacin Se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH isoelctrico. La regin del nodo (+) es cida y la del ctodo (-) es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tengan su punto isolctrico dentro del rango.

Movilidad en un gradiente de pH
Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migrarn hacia el ctodo, Las que se encuentren en medios con pH ms bajos que su pI tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo. Al alcanzar la regin donde el pH coincidir con su pI, tendrn una carga neta nula (forma un zwiterion) y se detendrn. De esta forma las molculas anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se focalizan).

 En esta tcnica el punto de aplicacin suele no ser crtico pues las molculas siempre se desplazarn hacia la regin de su pI (aunque existen excepciones). La capacidad de resolucin es de 0.01 unidades de pH. El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH. Los anfolitos suelen ser cidos poliamino policarboxlicos alifticos sintticos y son comercializados en mezclas que cubren determinados rangos de pH.

Detecciones especficas
Carbohidratos Transferencia electrofortica Tincin de Plata