MTODOS

CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFA
1. Miguel Tswett. 1906. khromatos (color) y graphos (escrito)
Mtodo en el cul los componentes de una mezcla son
separados en una columna adsorbente dentro de un sistema
fluyente.

2. I.U.P.A.C.
Mtodo utilizado principalmente para la separacin de los
componentes de una muestra, en el cul los componentes
son distribuidos entre dos fases:
-Estacionaria (slido o lquido soportado en un slido o en gel
(matriz), empaquetada en una columna, extendida en capa,
distribuida en una columna)
-Mvil
QUA 7017
I. INTRODUCCION
Cromatografa separar identificacin cuantificacin
Muestra se disuelve en la fase mvil (FM) (gas, lquido o fluido
supercrtico). Fase mvil se hace pasar a travs de la fase estacionaria
(FE) inmiscible, la cul se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie slida.
Las especies de la muestra interaccionan repetidamente (reparto) entre
FM y FE.
Los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas o
picos cromatogrficos, emergiendo en orden creciente de interaccin
con la FE.
El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades
fsicas y/o qumicas de los componentes de la muestra.

QUA 7017
1. DESCRIPCIN GENERAL
2.1 FORMA DE CONTACTO
Columna: La fase estacionaria est
retenida en un tubo estrecho. La fase
mvil se hace pasar a travs del tubo,
por presin o gravedad.

Plana: La fase estacionaria esta fija
(inmvil) en una placa plana o en
poros de un papel

El solvente asciende por
capilaridad y va
ocurriendo la separacin
de los componentes.
Posteriormente se realiza
el revelado de la placa y
se determinan los Rf de
las distintas manchas.

La fase mvil se desplaza a travs de la fase
estacionaria por capilaridad o gravedad

2.2. Naturaleza de la fase mvil
Las tres tipos de fases mviles son
A) lquido Cromatrografa de lquidos (LC)

B) Gases Cromatrografa de gases (GC)

C) fluido supercrtico Cromatrografa
de fluidos suprcrticos (SFC)
2.2. Mecanismo de retencin separacin: tipo
de equilibrio implicado en la transferencia de los
solutos entre las fases
2.2.1. Cromatografa de adsorcin: la separacin se basa en las
distintas afinidades de adsorcin de los componentes de la muestra hacia la
superficie de un slido activo. L- S, G-S.

2.2.2 Cromatografa de reparto: la separacin se basa en las
diferencias de solubilidad de los componentes de la muestra en la fase
estacionaria (CG) o en las diferencias de solubilidad de los componentes en
la fase mvil y en la fase estacionaria (CL). L-L.

2.2.3 Cromatografa de cambio inico: la separacin se basa en
la distinta susceptibilidad para el intercambio de iones de los componentes
de la muestra. El slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas)
2.2.4 Cromatografa de exclusin: la separacin se basa en
efectos de exclusin, tales como diferencias en el tamao de las molculas
y / o en su forma o en su carga. Exclusin por tamao molecular.
2.2.5 Cromatografa de afinidad: para conseguir la separacin, se
utiliza una interaccin biolgica especfica entre el analito y la fase. Esta
dentro de la C. de adsorcin utilizada en bioqumica, en la que un slido
tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser, por ej. Un
indicador enzimtico o un anticuerpo.
QUA 7017
Cromatografa Nombre de la tcnica Fase estacionaria Fase mvil Desplazamiento
FM
Mecanismo
separacin
Columna abierta C. Slido lquido
C. Lquido-lquido

C. Sobre geles
C. De intercambio
inico

Electroforesis
Sl. Adsorbente
Lq. Adsobido en
soporte slido
Sl. Gel poroso
Sl. Cambiador
inico Resina
Sl. polmero

Lquida
Lquida

Lquida
Lquida

Lquida inico
Gravedad
Gravedad

Gravedad
Gravedad

Emigracin
inica
Adsorcin
Reparto (ads)

Tamao
Afinidad
qumica
Emigracin
inica
Columna
cerrada
C. De gases



C. Lquida de alta
resolucin
Slido
Adsorbente
Lq. Adsorbido en
soporte slido.
Slidos diversos
y lquidos
adsorbidos en
soporte slido.

Gas
Gas

Lquido
Presin
Presin

Presin
Ads.
Rep (ads)

Ads. , rep.,
afinidad
qumica,
tamao, etc.
Papel C de adsorcin en
papel
C. De reparto en
papel

C. De cambo inico
en papel
Electroforesis
Slido Papel

Lq. Polar
adsorbido en
papel.
Slido

Slido
Lq. Polar

Lq. No polar


Lquido

Lquido
inico
Capilaridad

Capilaridad


Capilaridad

Emig. inica
Adsorcin

Rep.


Afinidad
qumica
Emigracin
inica
QUA 7017
Capa fina C. De adsorcin

C. De reparto
Sl.
Adsorbente
Lq. Adsorbido
en slido.
Lquido

Lquido no
polar
Capilaridad

Capilaridad
Adsorcin

Reparto
QUA 7017
Cromatografa de elucin en
columna
Eluyente: solvente que
arrastra los componentes
de una mezcla
Separacin en bandas
A eluida a tiempo t
3
B eluida a tiempo t
4 (mayor
retencin)
CROMATOGRAMA
Detector registra
concentracin
Perfiles de elucin a diferentes tiempos.
Disminuye la eficacia al ensancharse los picos.
Eje X: tiempo o volumen de
elucin.
Identificacin tr
Cuantificacin Area

RESOLUCION
Buena resolucin trabajando bajo condiciones que
el ensanchamiento de las bandas sea mas lento
que la separacin (variables fsicas y qumicas).
VELOCIDAD DE MIGRACIN DE LAS
ESPECIES
AUMENTO DE DISTANCIA ENTRE LAS DOS BANDAS
ENSANCHAMIENTO DE AMBAS ZONAS
EFICACIA COLUMNA CROMATOGRFICA DEPENDE DE:
VELOCIDADES RELATIVAS DE ELUCIN DE LAS 2 ESPECIES

Distancia migracin
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

QUA 7017
CONSTANTES DE DISTRIBUCIN
A MOVIL A ESTACIONARIA
K = CS / CM
K = CONSTANTE DE DISTRIBUCION
CS = CONCENTRACIN MOLAR DEL SOLUTO EN LA FASE
ESTACIONARIA
CM = CONCENTRACIN MOLAR DEL SOLUTO EN LA FASE MOVIL
CS proporcional A CM
Cromatografa lineal
Picos gaussianos simtricos Tiempos de retencin independientes de la
cantidad de analito inyectado.


QUA 7017
TIEMPOS DE RETENCION
Tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta
que el pico de concentracin alcanza el detector
Especie no retenida = tM = TIEMPO MUERTO
VELOCIDAD DE MIGRACIN DE LA ESPECIE NO RETENIDA COINCIDE
VELOCIDAD PROMEDIO DEL MOVIMIENTO DE LAS MOLECULAS DE LA
FASE MOVIL
QUA 7017
VELOCIDAD LINEAL PROMEDIO DE MIGRACION DEL
ANALITO


L = LONGITUD DEL RELLENO DE LA COLUMNA

V = L / tR

QUA 7017
DESCRIBE LAS VELOCIDADES DE MIGRACIN DE LOS SOLUTOS
EN LA COLUMNA
FACTOR DE RETENCION O FACTOR DE
CAPACIDAD
k
A
= (tR tM ) / tM
Factor de retencin ZZZ 1 elucin rpida, imposible
determinar tr
Factor retencin aprox 20 tr muy largos
Factor retencin ideal 2 a 10. (1 a 5)



QUA 7017
FACTOR DE SELECTIVIDAD (o )
PARA 2 ESPECIES
o = KB / KA
KB = COEF DISTRIBUCIN ESPECIE FUERTEMENTE RETENIDA
KA = COEF DISTRIBUCIN ESPECIE MENOS RETENIDA
K y o son dependientes de la temperatura
Intervalo limitado de temperatura permanecen
ctes.
Coeficiente de particin disminuye al aumentar la
temperatura, por lo tanto aumenta la fraccin soluto
en la fase mvil y el tiempo de retencin disminuye

QUA 7017
o >1
ENSANCHAMIENTO DE BANDA Y
EFICACIA DE LA COLUMNA
FORMAS DE PICOS CROMATOGRAFICOS
Curvas Gaussianas
Variabilidad en el tiempo de residencia
Velocidad promedio de las partculas individuales en relacin con FM vara
considerablemente.
Anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a travs de la
columna
A mayor tiempo transcurrido mayor es la dispersin.
La anchura de la zona esta relacionada directamente con el tiempo de
residencia en a columna e inversa con la velocidad a la que fluye la fase mvil.


QUA 7017
5.2. MEDICIN DE LA EFICIENCIA
- NMEROS DE PLATOS TERICOS (N)
- ALTURA DE PLATOS TERICOS (AEPT)
Plato terico = capas estrechas donde se establece el equilibrio
entre adsorciones y desorciones de la especie entre la FM y FE.
QUA 7017
Supongamos una columna cromatogrfica como una serie de
estratos o capas separadas donde ocurre un equilibrio del
analito entre la FE y la FM:
Cada estrato de equilibrio o capa
se denomina PLATO TERICO
W
b
= ancho base del pick (cm)
N = 16 (t
R
/ W
b
)
2
MIDE LA CAPACIDAD DE LA COLUMNA PARA SEPARAR LOS
COMPONENTES, NO LA RETENCION DE LOS MISMOS

Columna ms eficiente
t
R

w
b

N
QUA 7017
Altura equivalente de un plato terico
(AEPT) = distancia que el soluto se mueve mientras se lleva
a cabo un reparto (tamao de cada etapa de equilibrio):
AEPT = L / N

QUA 7017
L = Longitud del relleno de la columna (cm)
N
AEPT
EFICIENCIA
5.3. FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA
DE LA COLUMNA
A. INFLUENCIA DEL CAUDAL DE LA FASE MVIL
C. EFECTO DE DIFUSIN MOLECULAR
D. RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA ENTRE
SLIDOS Y FASES MVILES
QUA 7017
B. EFECTO DE MULTITRAYECTORIA O
DIFUSIN TURBULENTA
ENSANCHAMIENTO DE BANDA SE PRODUCE COMO
CONSECUENCIA DE LA VELOCIDAD CON LA QUE
OCURREN LOS DISTINTOS PROCESOS DE
TRANSFERENCIA DE MASA DURANTE LA MIGRACIN DE
LA ESPECIE
A. INFLUENCIA DEL CAUDAL DE LA FASE MVIL (u)
Magnitud de los efectos cinticos sobre la eficiencia de
la columna depende claramente del TIEMPO DE CONTACTO
entre la FM y FE, este a su vez depende del CAUDAL DE LA
FM.
H MNIMO
(MXIMO EFICACIA)
CAUDAL MNIMO
QUA 7017
CAUDAL MNIMO CL CAUDAL MINIMO CG <<<

QUA 7017
Grfica altura equivalente de plato torico en funcin de la velocidad lineal
media u de la FM (CG:gas de arraste o CL: fase lquida): Representacin
grfica ecuacin de van Deemter
H
MIN

H
MIN

CG
H
(mm)
H

(
m
m
)

U (cm/s)
u
MAX

4.0
2.0
H

(
m
m
)

U (cm/s)
u
MAX

0.15
0.1
CL
QUA 7017
COMPARACIN CL Y CG
CL CG
u mucho menor u mucho mayor
Separaciones mas
lentas
Separaciones ms
rpidas
Tiempos mayores Tiempos menores
H disminuye H aumenta
L mucho menores
(cm)
L mucho mayores
(m)
B. EFECTO DE MULTITRAYECTORIA (A) O
DIFUSIN EN REMOLINO
QUA 7017
P
a
r
e
d
e
s

c
o
l
u
m
n
a

A
B
a b
Diferencia en longitud de los caminos / vara el tiempo.
Las molculas alcanzan el el extremo de la columna en un LAPSO DE
TIEMPO ENSANCHAMIENTO DE BANDA
DIFUSIN EN REMOLINO Proporcional al dimetro de las partculas del
relleno.


a y b partculas de
una mismo analito
C. EFECTO DIFUSIN MOLECULAR
LONGITUDINAL (B/u)
MOVIMIENTO MOLECULAR ALEATORIO DENTRO DE LA FM



QUA 7017
V
flujo
DF
P
a
r
e
d
e
s

c
o
l
u
m
n
a

A
B
Relleno
columna
a
DIFUSION LONGITUDINAL DIRECTAMENTE PROPORCIONAL AL COEFICIENTE DE
DIFUSIN (D
M:
velocidad de migracin en un gradiente de concentracin)
DIFUSION LONGITUDINAL INVERSAMENTE PROPORCIONAL A LA
VELOCIDAD DE LA FM
EFECTO EN CL EFECTO CG

<<<

QUA 7017
D
M
TEMPERATURA
CG
VELOCIDAD DE
FLUJO
D. RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA ENTRE
SLIDOS Y FASES MVILES
QUA 7017
V
flujo
EQUILIBRIO
ENTRE
MOLCULAS
EFICIENCIA
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA

LOS EFECTOS ESTAN RELACIONADOS CON:
LONGITUD DE LA COLUMNA
DIAMETRO COLUMNA
TAMAO PARTCULAS DE RELLENO
NATURALEZA DE LAS FASES
CANTIDAD DE FASE ESTACIONARIA
TEMPERATURA DE LA COLUMNA
VELOCIDAD DEL GAS PORTADOR
CANTIDAD MUESTRA INYECTADA
MATERIAL COLUMNA
ENRROLLADO COLUMNA
QUA 7017
RELACIN ENTRE LA AEPT CON LOS PARMETROS
DE LA COLUMNA Y LA RAZN DE FLUJO (u)
Van Deemter
AEPT = A + B / + C *

= VELOCIDAD LINEAL
A = DIFUSIN TURBULENTA
B = DIFUSIN MOLECULAR
C = RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA

Donde u= L (cm)/ Tr (s)


QUA 7017
6. OPTIMIZACIN DE LA EFICIENCIA
DE LA COLUMNA

SEPARACIN TOTAL DE LOS COMPONENTES DE UNA
MEZCLA EN EL MENOR TIEMPO POSIBLE
OBJETIVOS DE OPTIMIZACIN:
1. REDUCIR ENSANCHAMIENTO DE ZONA
2. MODIFICAR LAS VELOCIDADES RELATIVAS DE
MIGRACIN
QUA 7017
6.1. RESOLUCIN DE LA COLUMNA
MEDIDA CUANTITATIVA DE SU CAPACIDAD PARA
SEPARAR DOS ANALITOS
R
S
= 2 [(t
R
)
b
- (t
R
)
a
] / W
a
+ W
b
QUA 7017
1. BUENA RESOLUCION: SI LOS PICOS NO SE SOLAPAN Y ESTA
PERFECTAMENTE DELIMITADO CADA PICO.
2. R=0,7 MALA RESOLUCIN QUEDANDO PICOS SOLAPADOS (SE
DISTINGUEN LAS CRESTAS PERO NO LA BASE.
3. R APROX. 1,5 SE OBTIENEN PICOS BIEN DELIMITADOS, BUENA
RESOLUCION

QUA 7017
6.2. INFLUENCIA DE LOS FACTORES DE
CAPACIDAD Y SELECTIVIDAD SOBRE LA
RESOLUCIN
R
S
= N / 4 (o -1 / o ) (K
b
/ 1 + K
b
)

MALA RESOLUCIN SE DEBE PRINCIPALMENTE
DEMASIADA MUESTRA EN COLUMNA
LA COLUMNA O PLACA ES CORTA
LA FASE MOVIL NO DISCRIMINA ENTRE LOS COMPONENTES
LA COLUMNA ES DEMASIADO GRUESA
RESOLUCION
QUA 7017
S
E

A
L

D
E
L

D
E
T
E
C
T
O
R

TIEMPO (min)
Rs = 0,75
Rs = 1,0
Rs = 1,5
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
II. CROMATOGRAFA GASEOSA
TCNICA ANALTICA UTILIZADA EN LA SEPARACIN Y
ANALISIS DE MEZCLA DE SUSTANCIAS.


SE BASA EN LA DIFERENCIA DE VELOCIDADES DE MIGRACIN
DE LOS COMPONENTES DE UNA MEZCLA, AL SER ARRASTRADA
POR UN GAS INERTE (FASE MVIL) A TRAVS DE UNA FASE
ESTACIONARIA (GENERALMENTE DE GRAN SUPERFICIE),
UTILIZANDO PARA ELLO UN CROMATGRAFO DE GASES.
A DIFERENCIA DE LOS OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFA, LA
FASE MVIL NO INTERACCIONA CON LAS MOLCULAS DEL
ANALITO, SU UNICA FUNCIN ES LA DE TRANSPORTAR EL
ANALITO A TRAVS DE LA COLUMNA.


CARACTERISTICAS GENERALES
1. TCNICA ANALTICA RPIDA
2. ALTA RESOLUCIN
3. ANLISIS CUANTITATIVO Y CUALITAVO
4. SENSIBILIDAD PPM A PPB
5. SE NECESITA, EN GENERAL, PEQUEA CANTIDAD DE MUESTRA
6. AMBITO DE TRABAJO 70C A 400C.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
FASE MOVIL GAS GAS
FASE ESTACIONARIA LQUIDO
(GLC O GC)
SLIDO
(GSC)
INTERACCIN CROMATOGRAFA
DE PARTICIN
CROMATOGRAFA
DE ADSORCIN
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
CROMATOGRAFIA GASEOSA
Aplicabilidad
Qu mezclas pueden ser separadas por CG ?
Para cualquier sustancia que pueda ser arrastada por un flujo
de un gas, sta debe ser disuelta a lo menos parcialmente
en el gas.
Mezclas cuyos constituyentes sean VOLTILES (evaporados)

DE FORMA GENERAL: CG puede ser aplicado para separar y analizar mezclas
de constituyentes que tengan PUNTOS DE EBULLICIN de hasta 300
o
C y que sean
trmicamente ESTABLES

1. FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFIA DE
GAS - LQUIDO
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
SE BASA EN LA DISTRIBUCIN DEL ANALITO ENTRE UNA FASE MVIL
GASEOSA Y UNA FASE LQUIDA POCO VOLATIL INMOVILIZADA SOBRE LA
SUPERFICIE DE UN SLIDO INERTE
(CROMATOGRAFA GAS-LIQUIDO CON COLUMNA EMPAQUETADA)
O SOBRE LA PROPIA PARED DEL TUBO
(CROMATOGRAFIA GASEOSA DE ALTA RESOLUCIN)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
LOS FACTORES QUE GOBIERNAN LA SEPARACIN SON:
1. SOLUBILIDAD EN LA FASE ESTACIONARIA
SOLUBILIDAD
CONSTITUYENTE
EN LA FE
AVANCE POR LA
COLUMNA
2. VOLATILIDAD
VOLATILIDAD DE LA
SUSTANCIA (MAYOR
PRESIN DE
VAPOR)
TENDENCIA A
PERMANECER
VAPORIZADA
AVANCE POR
EL SISTEMA
2. INSTRUMENTOS PARA LA CROMATOGRAFA
GAS - LQUIDO
1
2
3
4
6
5
1. Contenedor de gas y
controles de caudal (flujmetro)
/ presin.
2. Inyetor (Vaporizador) de
muestra.
3. Columna Cromatogrfica y
Horno de Columna.
4. Detector.
5. Amplificador de seal.
6 - Registro de Seal
(Registrador o Computador)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
FUNCIN DE COMPONENTES ESQUEMA BASICO CROMATOGRAFO
DE GASES
GAS DE ARRASTRE har circular la muestra por el sistema.
INYECTOR permitir introducir la muestra al sistema en forma adecuada.
COLUMNA efectuar la separacin de los componentes de la mezcla.
DETECTOR indicar la presencia de un componente
REGISTRADOR dar el resultado grfico.
PASOS ESQUEMA BASICO CROMATOGRAFO DE GASES
1. Muestra es vaporizada e introducida en un flujo de un gas apropiado
Gas de arrastre o FM.
2. Este flujo de gas con la muestra vaporizada pasa por un tubo
conteniendo la FE o columna cromatogrfica, donde ocurre la
separacin de la muestra.
3. Las sustancias separadas salen de la columna disueltas en el gas de
arrastre y pasan por un detector.
4. El detector entrega la seal en funcin del tiempo en un
cromatograma (picos con reas proporcionales a sus masas).
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.1. GAS PORTADOR O GAS DE ARRASTRE
El GAS DE ARRASTRE debe conducir la muestra y sus componentes a travs
de a columna y detector.
FASE MOVIL no debe interaccionar con la muestra, slo debe actuar como
GAS DE ARRASTE
2.1.1. Requisitos
A. INERTE frente a componentes de sistema cromatogrfico y muestra
B. PUREZA ELEVADA Debe ser libre de impurezas que puedan degradar fase
estacionaria o muestra.
Impurezas tpicas en gases y sus efectos:
oxida / hidroliza algunas FE / incompatible
con DCE
H
2
O, O
2
hidrocarbonatos

ruido en seal de DIC
C. COSTO Y FACILIDAD DE ADQUIRIR Aumenta el costo de gases al aumentar
la pureza .
D. COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada detector demanda un
gas de arraste especfico para mejor funcionamento.
Seleccin de Gases de Arraste en funcin del tipo de Detector:
He , H
2

DCT

DIC
N
2
, H
2

DCE
N
2
(SS), Ar + 5% CH
4

La eleccin del gas es independiente de la muestra a ser separada.
Los gases ms usados son He , H
2
y

N
2

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.1.2. Alimentacin de Gas de Arrastre
Componentes necesarios :
controladores de vacio / presin de gas
dispositivos para purificacin de gas (traps)
1
2
3
4
5
6
1 - Cilindro de Gas
2 - Regulador de Presin Primario
3 - Traps para eliminar
impurezas de gas
4 - Regulador de Presin
Secundario
5 - Regulador de Vacio
(Controlador Diferencial de Flujo)
6 - Medidor de Vacio (Rotmetro)
Tubos o coneccin deben ser de
acero inoxidabe o cobre.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
La muestra debe INTRODUCIRSE y EVAPORARSE casi en forma instantnea y
arrastrada en forma de vapor hasta la columna con un mnimo de ensanchamiento.


2.2. SISTEMA DE INTRODUCCIN DE MUESTRA (INYECTORES O
VAPORIZADORES)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
El inyector consta de un Calefactor y un pirmetro para vaporizar la muestra y
controlar la temperatura.
1
2
3
4
1. Septa (silicona)
2. Alimentacin de gas de arrastre
3. Bloque metlico
4. Punta de columna cromatogrfica
Generalmente T
inj
= 50
o
C por sobre la tempertura de ebullicin del componente
menos volatil
COLUMNA
muestras
Gaseosas
muestras
Lquidas
empaquetadas
C = 3,2 mm
(
1
/
4
)
0,1 ml ... 50 mL 0,2 L ... 20 L
capilares
C = 0,25 mm
0,001 ml ... 0,1 mL 0,01 L ... 3 L
2.2.1. Parmetros de inyeccin
Temperatura del inyector debe ser suficiente para vaporizar la muestra ( sobre
temperatura de ebullicin de sustancias), pero sin producir descomposicin.
Normalmente es T
inj
= 10C a 20C ms alta que la temperatura de la columna).
Volmenes inyectado depende de la columna, del detector empleado y del
estado fsico de la muestra.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
La interaccin FE o el tiempo que un analito demora en recorrer una
columna depende de su PRESIN DE VAPOR (p
0
).
La afinidad de un soluto por la FM es determinada por la VOLATILIDAD
DEL SOLUTO
p
0

=
funcin
Estructura qumica
del analito
Temperatura
de la columna
2.3.1. Temperatura de columna
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.3. COLUMNA
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Temperatura
de
columna
Presiones
de
vapor
Velocidades
de
migracin
Tiempo
Compuesto
en FE
ANALITO ELUYE MAS RAPIDAMENTE
(MENOR TIEMPO O VOLUMEN DE
RETENCIN)
LA TEMPERATURA UTILIZADA DEBE SER COMPATIBLE CON LA FE
(LIQUIDAS)
TEMPERATURAS EXCESIVAS DEGRADAN FE
T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A

D
E

C
O
L
U
M
N
A

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Muestras complejas con presin de vapor diferentes separadas
ISOTERMICAMENTE
T
COLUMNA
BAJAS
2.3.2 Programacin lineal de temperatura (PLT)
T
COLUMNA
ALTAS
Componentes MENOS VOLTILES eluyen
ms rpido y son separados
Componentes MAS VOLATILES sern
retenidos muy poco y no sern separados
Componentes MAS VOLATILES sern
separados
Componentes MENOS VOLTILES
presentarn picos anchos y bajos o sern
retenidos en la columna
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
PLT: la temperatura de la columna se va aumentado gradualmente durante el anlisis
Se consigue la separacin de mezclas complejas
en un menor tiempo, como por ej. PETROLEO,
ACEITES ESENCIALES, ETC.
TIEMPO
T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A

t
INI
t
FIM

T
INI

T
FIM

R
Parmetros de una programacin de temperatura:
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
T
INI
Temperatura Inicial
T
FIM
Temperatura Final
t
INI
Tiempo Isotrmico Inicial
t
FIM
Tiempo Final del Programa (PLT)
R Pendiente = Velocidad de
Calentamiento





2.4. FASE ESTACIONARIA
VARIABLE MAS
IMPORTANTE EN LA
OPTIMIZACIN DE LA
SELECTIVIDAD
FE LQUIDAS (MS USADAS)
FE SLIDAS (Carbn activo, slica, tamizes moleculares y
polmeros porosos)
Son utilizadas en la separacin de gases y compuestos de bajo
PM
2.4.1 FE LQUIDAS

Depositadas sobre una superficie de slidos porosos inertes
(columnas empacadas) o de tubos finos de materiales inertes
(columnas capilares)

Para minimizar efecto de volatilizacin en FE lquida, esta se encuentra:
ENTRECRUZADAS Y QUIMICAMENTE LIGADAS

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
CADENAS
POLIMERICAS
SON QUIMICAMENTE
LIGADAS ENTRE SI
CADENAS POLIMERICAS
SON SUJETAS A UN
SOPORTE POR
LIGACIONES
QUMICAS
EMPACADA
C = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Rellena con slido pul-verizado
(FE slida o FE lquida
depositada sobre las partculas
del relleno)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
CAPILAR
C = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recubiertas
con un film fino ( m) de FE
lquida o slida
FE
lquida
2.4.1.1 CARACTERISTICAS DE UNA FE

1. LQUIDA: debe ser POCO VOLATIL Pv hasta 0.1 mmHg a
Temperatura de trabajo.
2. AMPLIO RANGO DE TEMPERATURAS (mejora optimizacin)
3. QUMICA Y TERMICAMENTE ESTABLE (mayor durabilidad de la
columna no reacciona con los componentes de la muestra)
4. BAJA VISCOSIDAD (mayor eficiencia, mejor transferencia del
analito entre las fases)
5. Ser un BUEN DISOLVENTE Y DIFERENCIAL (componentes de
muestra) de lo contrario los compuestos
permaneceran mayor tiempo en gas de arrastre mayor
elucin pero sin separacin
4. SELECTIVO: separacin adecuada de los componentes de la
muestra

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Fenmeno fsico-qumico responsable de la interaccin
analito + FE lquida es la ABSORCIN
La absorcin ocurre dentro de la pelcula lquida de FE (el
fenmeno de INTRAFACIAL)
ABSORCION
Film espeso de FE lquida
Interaccin fuerte entre la FE lquida
y el analito (grande solubilidad)
Gran superficie lquida expuesta a
gas de arrastre
2.4.1.2 FE LIQUIDAS = FENOMENO DE ABSORCIN
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
ADSORCIN
Slidos con grandes reas superficiales
(partculas finas, poros)
Solutos polares
Slidos con gran nmero de sitios activos
(hidroxilos, pares de eletrones...)
2.4.2 FE SOLIDAS = FENOMENO DE ADSORCIN
Fenmeno fsico-qumico responsable de la interaccin
analito + FE slida es la ADSORCIN
La adsorcin ocurre en la interface entre el gas de arrastre y
la FE slida
Caractersticas Generales
Slidos finamente granulados (dimetros de partculas tpicos de
105 m a 420 m).
Grandes reas superficiles (de 10
2
m
2
/g).
Ms usados
Polmeros Porosos Porapak (copolmero estireno-divinilbenzeno), Tenax
(polixido de difenileno)
Slidos Inorgnicos Carboplot, Carboxen, Alumina.
GASES DE REFINARIA
Separacin de gases
Compuestos livianos
Series homlogas
Principales Aplicaciones
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.5. DETECTORES
Dispositivo que indica y cuantifica los componentes separados por la columna
2.5.1. CARACTERISTICAS
2.5.1.1. CARACTERISTICAS DETECTOR IDEAL
1. Adecuada sensibilidad (10
-5
a 10
-8
g de soluto/s)
2. Buena estabilidad y reproducibilidad
3. Respuesta lineal para los solutos se extiende a varios rdenes de
magnitud
4. Intervalo de temperaturas de trabajo desde ambiente hasta 400 C
5. Tiempo de respuesta corto (independiente del caudal)
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo
7. No destructivo de la muestra
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.5.1.2. CARACTERISTICAS PARA DESCRIBIR DESEMPEO DEL DETECTOR
1. Selectividad ( Detectores Universales / Detectores Especficos)
2. Ruido (causado por problemas electrnicos, impurezas, suciedades en
los gases, detector, etc.)
3. Tipo de Respuesta depende del mecanismo de funcionamiento del
detector.
Seal proporcional a la concentracin del soluto
Seal proporcional a la fraccin de masa del soluto que entra en el
detector.
4. Cantidad mnima detectable (CMD) Cantidad mnima de muestra
para generar una seal dos veces ms intensa que el ruido.
5. Factor de Respuesta intensidad de seal generada por una
determinada masa de soluto, que depende del detector y del compuesto
estudiado.
6. Rango Lineal Dinmico Razn entre la menor y la mayor masa entre
las cuales el factor de respuesta de un detector para un soluto es
constante, es decir donde C.C. Lineal.

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
UNIVERSALES
Genera seal para cualquier
sustancia eluida
SELECTIVOS
Detecta sustancias con determinada
propiedad fsico-qumica.
ESPECFICOS
Detectan sustancias que posean un determinado elemento o sustancia
que posean determinado elemento o grupo funcional
en sus estructuras
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
3. DETECTOR POR CAPTURA DE ELECTRONES (DCE O ECD)
1. DETECTOR POR CONDUTIVIDAD TRMICA (DCT O TCD)
Variacin de Conductividad trmica del Gas de Arrastre.
2. DETECTOR POR IONIZACIN EN LLAMA (DIC O FID) Iones
generados durante la quema de los analitos en una llama de H2 + Aire.
2.5.2. DETECTORES MS IMPORTANTES
4. DETECTOR ESPECTROMTRICO DE MASA (EM O MS)
5. DETECTOR DE EMISIN ATMICA (AED)
6. DETECTORES TERMOINICOS (TID)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
1. Detector por Conductividad Trmica (DCT O TCD)
1.1. PRINCIPIO Variacin de conductividad trmica del gas cuando
eluye un analito.
Celda de detector de conductividad trmica (seccin transversal)
1
2
3
5
4
i
1 Bloque metlico (acero)
2 Entrada de gas de arrastre
3 Salida del gs de arrastre
4 Filamento metlico (aleacin W-Re) calentado
5 Alimentacin de corriente elctrica para el calentamiento
del filamento.
1. Consiste en un filamento metlico (W, W-Re, Pt, Ni) montado
coaxialmente en un cilindro metlico, que se calienta por medio de una
corriente elctrica.
2. Al pasar el gas de arrastre se producir una resistencia.
3. Al llegar una sustancia de distinta conductividad trmica al gas de
arrastre se tiene una resistencia tambin distinta.
4. Si se tienen dos bloques y se hace que por uno de ellos fluya slo gas
de arrastre y por el otro gas de arrastre ms muestra, tendremos dos
resistencias diferentes.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Configuracin tradicional del DCT: bloque metlico con cuatro
celdas ligadas en par, por dos pasa el efluente de la columna y por
las otras dos el gas de arrastre puro:
CELDAS DE
MUESTRA
CELDAS DE
REFERENCIA
C
O
R
T
E

S
U
P
E
R
I
O
R

CELDAS
DE
MUESTRA
CELDAS DE
REFERENCIA
C
O
R
T
E

L
A
T
E
R
A
L

Cuando eluye un compuesto con menor condutividad termica que el gas
de arrastre puro:
Se puede registrar el cambio de resistencia del segundo filamentio en
relacin al primero, haciendo que formen parte de un puente de
Wheatstone
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Diferencia de
resistencia
elctrica
entre los
filamentos
de muestra y
referencia
Filamentos en
las celdas de la
muestra se
calientan
La resistencia
elctrica de los
filamentos en las
celdas de la
muestra aumenta
Los filamentos
en las clulas de
la referencia no
se calientan
La resistencia
elctrica de los
filamentos en las
celdas de la
referencia es
constante
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Los filamentos del DCT se montan en un puente de Wheatstone que
transforma la diferencia de la resistencia de la elucin de la muestra en
una diferencia del voltaje:
V Fuente de CC / Bateria (18 V a 36 V, tpico)
F Ajuste de corriente en los filamentos
I Medida de corriente en los filamentos (100 mA - 200 mA, tpico)
B1 B2 Balance / ajuste de zero
R1 R2 Filamentos de las celdas de referencia
A1 A2 Filamentos de las celdas de la muestra
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
1.2. Caractersticas Operacionales del DCT
SELECTIVIDAD
Observa seal para cualquier sustancia eluida diferente al gas de
arraste UNIVERSAL
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD
Dependiendo de la configuracin particular y del analito: QMD = 0,4
ng a 1 ng con linealidad de 10
4
(ng)
La SALIDA del GAS DE ARRASTRE
la seal es proporcional a la concentracin del analito en el gas de
arrastre que pasa para la celda de la muestra.
NATURALEZA DEL GAS DE ARRASTRE
Cuanto mayor sea la diferencia Dl de condutividad trmica entre el
gas de arraste puro A, y el analito X, mayor ser la respuesta.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
CUNTO MENOS SEA LA MASA MOLECULAR DEL GAS DE ARRASTRE,
MAYOR SERA LA RESPUESTA DEL GAS DE ARRASTRE, MAYOR RESPUESTA
Como:
(M = massa molecular)
GAS DE ARRASTRE PARA DCT: He o H2
TIENEN CONDUCTIVIDADES TRMICAS ALTAS.
LAS MEZCLAS GAS DE ARRASTRE MS SOLUTO SIEMPRE TENDRN
CONDUCTIVIDADES TERMICAS MENORES QUE LA DEL GAS DE ARRASTRE
PURO: NO SE DAN SEALES NEFGATIVAS Y SE OBTIENEN FACTORES DE
RESPUESTAS GRANDES.
OTRO
GAS
He o H2
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
1.3. Aplicaciones
1. Separaciones y cuantificacin de compuestos que no generan seal en
otros detectores (gases nobles, etc.)
2. Por ser un detector no destructivo puede ser usado en CG preparativa o
deteccin secuencial con dos detectores.
1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4
1.4. Caractersticas del detector de conductividad trmica
Sencillo
Moderada sensibilidad
Es universal
No es destructivo
Buena estabilidad
Respuesta dependiente de la concentracin
til en anlisis de gases permanentes (CO, CO2, N2)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2. Detector por Ionizacin en Llama (DIC O FID)
2.1. PRINCIPIO Formacin de iones cuando un compuesto es
quemado en una llama de hidrgeno y aire (oxgeno)
1. Consta de un quemador (micromechero) que posee una pequea llama
alimentada por H2 y aire .
2. Esta llama sirve de electrodo que junto a un segundo electrodo establece
una diferencia de potencial.
3. Cuando slo pasa el gas de arrastre por la llama existe una pequea
corriente entrte los electrodos.
4. Cuando pasa un compuesto orgnico (muestra)
eluye y tambin es quemado. Sufre una ionizacin
aumentando la corriente que circula a travs de la
resistencia de medida.
5. El voltaje resultante se amplifica con un
electrmetro y pasa al registrador
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
COLECTOR
LLAMA
DIFUSOR
AR
H2
COLUMNA
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
SELECTIVIDAD
Selectivo para sustancias que contengan enlaces C-H en su
estructura qumica.
Compuestos que no produscan respuesta en DIC
2.2. Caractersticas Operacionales del DCT
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD
QMD tpicas = 10 pg a 100 pg cn linealidad entre 10
7
e 10
8
(pg a mg)

TRATAMIENTO DE SEAL
Debido a la baja magnitud de corriente generada (pA a nA)
esta debe ser amplificada para ser registrada.
Este detector entrega una respuesta proporcional a la masa de
la sustancia por unidad de tiempo y es independiente del flujo
de gas de arrastre.
GAS DE ARRASTRE
La relacin de flujos H2: gas de arrastre : aire es 1:1:10.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
1
2
3
4
Diagrama
electrnico
simplificado de
un DIC
1 Llama
2 Bateria fuente de CC
Voltajes de operacin normales de 200 V a 300 V(valor depende de
geometra del detector)
3 Amplificador
Debe amplificar la seal y convertir una corriente variable en voltaje
(pA mV).
4 Salida de Registro de Seal



U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
2.3. Caractersticas del detector de conductividad trmica
Alta sensibilidad
Buena estabilidad
Bajo ruido
Amplio rango lineal
Insensible a gases permanentes (O2, N2, CO, CO2, NH3, NO2, SO2, H2O)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Ampliamente utilizado para el anlisis de muestras mediambientales
Amplia selectividad para detectar compuestos que tienen halgenos
(pesticidas, y bifenilos clorados)

3. DETECTOR POR CAPTURA DE ELECTRONES (DCE O ECD)
3.1. DETECTOR DE FOSFORO O LLAMA ALCALINO
3.2. DETECTOR FOTOMTRICO
3.3. DETECTOR TERMOELCTRICO
1. Es un detector de ionizacin en que se usa una radiacin ionizante con
una sustancia istopo radioactiva que emite radiaciones | como
3
H o
63
Ni
2. Un electrn del emisor provoca la ionizacin del gas portador (con
frecuencia N2) y la produccin de una rfaga de electrones.
3. Al pasar la muestra, si esta tiene afinidad por electrones capturar
algunos produciendo una disminucin en la corriente.
4. Es muy sensible a los haluros de alquilo.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
1 Anodo (fuente radioativa | - emisora)
1
2
3
4
5
2 Salida de gases
3 Catodo
4 Cavidad
5 Columna cromatogrfica
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
SELECTIVIDAD
Selectivo para sustancias que contengan grupos funcionales
electronegativos como halgenos, perxidos, quinonas y grupos
nitro.
No es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e
hidrocarburos.
2.2. Caractersticas Operacionales del DCE
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD
Altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra
Intervalo de respuesta lineal se limita normalmente a unos dos
rdenes de magnitud. (0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidad ~
10
4
(pg a ng)

U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
PESTICIDAS
1 tetracloro-m-xileno
2 a - BHC
3 Lindano
4 Heptachlor
5 Endosulfan
6 Dieldrin
7 Endrin
8 DDD
9 DDT
10 Metoxychlor
10 decaclorobifenila
~250 fg cada analito
DCE ES UN DETECTOR PREFERENCIAL PARA ANLISIS DE TRAZAS DE
ORGANOHALOGENADOS Y SIMILARES
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
4. DETECTOR ESPECTROMTRICO DE MASA (EM O MS)
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
El espectrmetro de masas es un instrumento que permite analizar con
una gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos e
istopos atmicos, separando los ncleos atmicos en funcin de su
relacin masa-carga (m/z).

Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos qumicos que
forman un compuesto o determinar el contenido isotpico de diferentes
elementos en un mismo compuesto.

Los espectrmetros de masas usuales se acoplan a cromatgrafos de
gases.

En esta tcnica se calienta, hasta vaporizar e ionizar los diferentes tomos,
un haz de material del compuesto a analizar. El haz de iones produce un
patrn especfico en el detector que permite analizar el compuesto qumico.

4.1. SELECTIVIDAD
1. Identifica cientos de compuestos presentes en sistemas naturales y
biolgicos.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Entrada del gas
portador
Inyector
Zona de la
fuente de
ionizacin
Analizador
Multiplicador
de electrones
Horno del cromatgrafo de
gases
Sistema de
transferencia
Lentes de
enfoque
ESQUEMA DE UN CROMATGRAFO DE GASES
DE COLUMNA ABIERTA / ESPECTRMETRO
DE MASAS
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Separador
(skimmer)
Boquilla
Del
cromatgrafo
de gases
A la fuente de
ionizacin del
espectrmetro
de masas
Muestra
Portador
A la bomba
de vaco
ESQUEMA DE UN SEPARADOR DE
CHORRO
Para columnas rellenas o megacapilares, se emplea un SEPARADOR DE
CHORRO, para eliminar la mayor parte del gas portador que acompaa el
analito
4.2. DETECTOR DE TRAMPA DE IONES

El detector de masa ms simple para GC es el DETECTOR DE TRAMPA DE
IONES (ITD)

LLos iones se generan por impacto de electrones o por ionizacin qumica, a
partir de la muestra eluida, y luego se mantienen en un campo de
radiofrecuencia.

LLos iones atrapados se expulsan del rea de almacenamiento hacia un
detector multiplicador de electrones.

LLa expulsin es controlada por lo tanto se puede hacer un barrido
masa/carga


U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
Entrada de la
muestra del GC
Montaje del
filamento dual
Entrada de
electrones
Zona de
almacenamiento
de iones
Multiplicador de
electrones
Bomba
turbomolecular
Aislamientos
cermicos
Cierres de
atrapamiento de
iones
Electrodo anular
ESQUEMA DETECTOR DE
TRAMPA DE IONES
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
4.3. PRESENTACION DE DATOS

CCromatogramas que registran la intensidad (seal) de todos los iones.
(Suma de intensidades de todos los iones en funcin del tiempo)

CCromatogramas que registran la intensidad de un in seleccionado.

EEspectro de masas de diversos picos.

HHay instrumentos equipados con bibliotecas de espectros para identificar
los compuestos.
U.A. 36 / CQM-316 / R.R.A.
QUA 7017
III. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
DE ALTA EFICACIA (HPLC)
TCNICA ANALTICA UTILIZADA EN LA SEPARACIN Y
ANALISIS DE MEZCLA DE SUSTANCIAS.

EN ESTA MODALIDAD, LAS MOLCULAS DE SOLUTO SE
DISTRIBUYEN ENTRE DOS FASES: UNO ES LA FM (LIQUIDO) Y EL
OTRO LA FE, QUE SE ENCUENTRA HOMOGENEAMENTE DISPERSA
EN UN SOPORTE SLIDO, FINAMENTE DIVIDIDO.

EL LUGAR DONDE SE PRODUCE LA SEPARACION: LA COLUMNA,
SE CONSIDERA EL CORAZN DEL SISTEMA, ALREDEDOR DE LA
CUL SE MONTA UN SISTEMA DE MAYOR O MENOR COMPLEJIDAD.


1. INTRODUCCION
QUA 7017
DIFERENCIAS CG HPLC
SEPARACIN
DE
MEZCLAS QUE
CONTIENEN COMPUESTOS
ORGNICOS VOLTILES
MEZCLAS NO VOLTILES
DESCOMPONEN A ALTAS
TEMPERATURAS
POSEEN PESO MOLECULAR
ALTO
DETECTORES

ES SIMPLE ENCONTRAR
DETECTORES QUE
DIFERENCIEN LA MUESTRA
DE LA FM

CUALQUIER DISPOSITIVO
QUE MIDA UNA
PROPIEDAD FSICA DEL
SOLUTO

DETECTOR DE
CONDUCTIVIDAD
TRMICA, IONIZACION EN
LLAMA, ETC
ES DIFICIL ENCONTRAR
DETECTORES
(FM NO ES INERTE Y ADEMS
SU MASA ES SENSIBLEMENTE
SUPERIOR)
SE NECESITA ENCONTRAR
DISPOSITIVOS QUE
DIFERENCIEN EL SOLUTO EN
SOLUCIN DE LA FASE MVIL
DETECTOR UV O
FLUORESCENCIA
FASE MVIL FASE MOVIL INERTE
(CARRIER DEL SOLUTO
NO INFLUYE EN LA
SEPARACION)
EL TIPO DE FM DEPENDE
DEL DETECTOR
FASE MVIL NO ES INERTE
(PARAMETRO FUNDAMENTAL
QUE GOBIERNA LA
SEPARACION)
COLUMNAS SE NECESITAN UNA
DIVERSIDAD DE
COLUMNAS PARA ABARCAR
EL RANGO DE
SEPARACIONES
CON UNA SOLA COLUMNA
SE PUEDEN SEPARAR
COMPUESTOS POLARES, NO
POLARES, IONICAS,
IONIZABLES, SOLO
MODIFICANDO LA
COMPOSICION DE LA FM.
QUA 7017
QUA 7017
RESERVORIO
SOLVENTES
(FASE MOVIL)
BOMBA
INYECTOR
PRECOLUMNA
COLUMNA
DETECTOR
REGISTRADOR
DESAGUE
ESQUEMA SISTEMA CROMATOGRAFICO BASICO DE HPLC
2. INSTRUMENTOS
QUA 7017
2.1. RESERVORIO DE FASE MVIL
RECIPIENTE QUE CONTIENE LA FM
PUEDE UBICARSE DENTRO DE UNA CAJA NEGRA O EXTERNAMENTE EN
UN EQUIPO MODULAR
ALGUNOS cm. SOBRE EL NIVEL DE LA BOMBA PARA QUE LA FUERZADE
GRAVEDAD DIRIJA EL SOLVENTE HACIA ESTA, MANTENIENDO LLENAS LAS
CONEXIONES.
FM DEBE CIRCULAR POR TUBERIAS QUE CONECTAN EL RESERVORIO DE
SOLVENTES CON LA BOMBA, LA BOMBA CON EL INYECTOR, ESTE CON
UNO O MAS DETECTORES.
TUBERIAS DEBEN SER INERTES, RESISTENTES A ELEVADAS PRESIONES,
SE EMPLEAN TUBOS DE ACERO INOXIDABLE O POLIMERICAS (TEFLON Y
ACERO LAS MAYORMENTE USADAS)

QUA 7017.
2.2. BOMBA
IMPULSAN LA FM PROVENIENTE DEL RESERVORIO DE SOLVENTES
HACIA EL INYECTOR, Y DESDE ALL HACIA LA COLUMNA
ESTAN CONSTRUIDAS DE MATERIALES MUY RESISTENTES TANTO AL
ATAQUE QUMICO COMO AL DESGASTE MECANICO.
LOS COMPONENTES EN CONTACTO CON EL SOLVENTE SON DE ACERO
INOXIDABLE, ZAFIRO, RUB Y TEFLN
EL ACERO SE UTILIZA COMO CUERPO DE LA BOMBA, CONSTRUCCIN
DE TUBERIAS, CONECTORES Y CABEZALES DE LOS PISTONES.
CARACTERSTICAS
1. CAUDAL APROX. ENTRE 0.1 Y 10.0 mL/min
2. PRESIONES DE HASTA 6000 psi, 400 bar o 40 MPa.
3. EXACTITUD EN EL CAUDAL: DIVERGENCIA ENTRE CAUDAL DE
TRABAJO ESTABLECIDO Y EL CAUDAL REAL ENTREGADO EN UN
INTERVALO DE TIEMPO ESTABLECIDO. IMPORTANCIA EN
TIEMPOSDE RETENCION DE ANALITOS SEPARADOS.
QUA 7017
4. RUIDO: VARIACIONES DENOMINADAS PULSACIONES QUE
PRESENTAN LAS BOMBAS Y QUE CONDUCEN A VARIACIONES EN
EL CAUDAL DE SOLVENTE ENTREGADO EN INTERVALOS CORTOS
DE TIEMPO.
AUMENTAN RUIDO DEFICIENCIAS EN SISTEMA DE BOMBEO
VALVULAS TAPADAS, BURBUJAS DE AIRE
O SELLOS EN MAL ESTADO
AREAS DE PICOS VARIAN CUANDO VARIA EL CAUDAL
5. SISTEMA DE CORTE DE CAUDAL: CUANDO SE SUPEREN VALORES
LMITES DE PRESIN TANTO SUPERIOR COMO INFERIOR.
6. SISTEMA DE GRADIENTES: AUMENTA EFICACIA DESEPARACIN
HPLC ISOCRATICA SEPARACION QUE UTILIZA UN SOLO
DISOLVENTE, DE COMPOSICIN
CONSTANTE, SEPARA UN N LIMITADO
DE PICOS

QUA 7017
HPLC GRADIENTE SEPARACION QUE UTILIZA DOS O MAS
DISOLVENTES CON UNA POLARIDAD
SIGNIFICATIVAMENTE DISTINTA

SE VARIA LA COMPOSICIN DE DE LA FASE MVIL (EN %)
COMENZANDO LA ELUCIN CON UN SOLVENTE DBIL Y
AUMENTANDO PROGRESIVAMENTE LA PROPORCIN, ES DECIR,
UNA VEZ COMIENZA LA ELUCIN, SE VARIA LA RELACIN DE LOS
DISOLVENTES DE FORMA PROGRAMADA.

PROGRAMA CONTINUO O POR ETAPAS ESCALONADAS

SISTEMA DE GRADIENTE EN HPLC COMPARABLE CON
PROGRAMACION LINEAL DE TEMPERATURAS EN GC

QUA 7017
2.3. INYECTORES
PERMITE INTRODUCIR LA MUESTRA SIN INTERRUMPIR EL CAUDAL DE
SOLVENTE A TRAVS DEL SISTEMA.
EXISTEN INYECTORES MANUALES O AUTOMTICOS.
SE DESCARTAN INYECTORES CON SEPTUM (CG)
DESPRENDIMIENTO MATERIAL DEL SEPTUM
CONTRAPRESIN
CARACTERSTICAS
1. DEBE SER FACIL DE OPERAR
2. DEBE SER INERTE AL ATAQUE QUMICO Y CAPAZ DE
SOPORTAR ALTAS PRESIONES.
3. DEBE SER PRECISO EN CUANTO A LA CANTIDAD DE MUESTRA
INTRODUCIDA EN EL SISTEMA.
4. NO DEBE PROVOCAR DILUCIONES IMPORTANTES DE LA
SOLUCIN INYECTADA.
QUA 7017 QUA 7017
2.4. COLUMNAS
RELLENOS
PELICULAR
PARTICULA POROSA
BOLAS DE VIDRIO O DE POLMERO
NO POROSAS Y ESFRICAS (d=
30 A 40 um)
SUPERFICIE SE DEPOSITA UNA CAPA
DELGADA DE SILICE, ALMINA O DE
RESINA DE INTERCAMBIO IONICO
MICROPARTICULAS POROSAS CON d=3 a
10 um.
PARTICULAS DE SILICE, ALUMiNA O
RESINA.
DEPENDIENDO DEL RELLENO DE LA COLUMNA Y DEL TIPO DE FM
CROMATOGRAFIA FASE REVERSA O FASE NORMAL

FASE REVERSA RELLENO APOLAR Y FM POLAR
FASE NORMAL RELLENO ES POLAR Y FM APOLAR
QUA 7017
FASE NORMAL REVERSA
POLARIDAD
DEL RELLENO
ALTA BAJA
POLARIDAD
DEL SOLVENTE

BAJA

ALTA
ORDEN DE
ELUCION
PRIMERO EL MENOS
POLAR
PRIMERO EL MAS POLAR

2.5. DETECTORES
PERMITE VER Y UBICAR EN TIEMPO Y ESPACIO LA POSICIN DE CADA
COMPONENTE DE UNA MUESTRA A LA SALIDA DE LA COLUMNA
CROMATOGRAFICA
CARACTERSTICAS
1. TENER UN AMPLIO RANGO DINAMICO DE RESPUESTA
2. POSEER UNA RESPUESTA LINEAL: CONCENTRACION
PROPORCIONAL A LA SEAL DEL ANALITO.
3. NO CONTRIBUIR AL ENSDANCHAMIENTO DE BANDA
EXTRAMOLECULAR (DIMENSIONES DE CELDA, LONGITUD Y
DIAMETRO DE TUBERIAS DE CONEXIN) CELDAS DEL
DETECTOR DEBE TENER UN VOLUMEN TAN PEQUEO COMO
SEA POSIBLE.
4. RESPONDER A TODOS LOS SOLUTOS
5. SENSIBILIDAD APROPIADA
6. NO AFECTARSE POR CAMBIOS DE TEMPERATURA
7. BUENA RELACION SEAL / RUIDO
QUA 7017
8. NO DESTRUIR LA MUESTRA.
9. CONSTANTE DE TIEMPO BAJA: VELOCIDAD DE RESPUESTA.
QUA 7017 QUA 7017
DETECTORES
GENERALES
SELECTIVOS
MIDEN EL CAMBIO DE ALGUNA
PROPIEDAD FISICA DE LA FM QUE
CONTIENE EL ANALITO EN
COMPARACION CON LA MISMA FM PURA
DETECTOR DE INDICE DE
REFRACCION
MIDE LA DIFERENCIA DE I.R. ENTRE
EL SOLUTO Y EL SOLVENTE PURO
SENSIBLES A ALGUNA PROPIEDAD DEL
SOLUTO
DETECTOR UV
SEAL PROPORCIONAL A LA
ABSORBANCIA DEL SOLUTO A UNA
LONGITUD DE ONDA DADA
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
DETECCION DE SOLUTOS CON
FLUORESCENCIA NATURAL O
CONFERIDA POR REACCION CON
REACTIVO FLUOROGNICO
2.5.1. DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION
MIDE LA DIFERENCIA DE NDICE DE REFRACCION ENTRE EL SOLVENTE
PURO Y EL SOLVENTE QUE CONTIENE LA MUESTRA
ES UN DETECTOR UNIVERSAL (es improbable que el ndice de refraccin del
soluto sea similar l del solvente)
NO DESTRUCTIVO
ES MUY POCO SENSIBLE (limita el campo de aplicacin)
ES AFECTADO POR CAMBIOS DE TEMPERATURAS
NO PUEDE UTILIZARSE CON PROGRAMACION DE SOLVENTES (cambios de
fase mvil generan cambios de ndices de refraccin)


QUA 7017
2.5.2. DETECTOR UV
EL MS EMPLEADO EN HPLC
POSEE BUENA SENSIBILIDAD Y RANGO LINEAL, PERMITE DETECTAR
ANALITOS EN EL ORDEN DE LOS ng.
NO ES DESTRUCTIVO Y PUEDE EMPLEARSE EN GRADIENTE DE
SOLVENTES (ESTOS DEBEN SER TRANSPARENTES A LA LONGITUD DE
ONDA DE TRABAJO.
MUY POCO SENSIBLE A LOS CAMBIOS DE CAUDAL Y DE TEMPERATURA
OPERA EN EL RANGO DE 190 A 350 nm, EN ALGUNOS EQUIPOS SE
PUEDE EXTENDER A LA ZONA VISIBLE 350 A 700 nm (DETECTOR
UV/VIS)

EXISTEN DOS TIPOS DETECTOR DE ONDA FIJA O
FOTOMTRICO
DETECTOR DE ONDA VARIABLE O
ESPECTROFOTOMTRICO
QUA 7017
2.5.2.1. DETECTOR UV DE ONDA FIJA O FOTOMETRICO
Opera a longitudes de onda prefijadas, determinadas por las lneas de
emisin de la lmpara, habitualmente de Hg de baja presin.
Como longitudes de onda de trabajo se utilizan las bandas de emisin de la
lmpara de Hg, especialmente la fuerte lnea de 254 nm.
El verdadero monocromador del instrumento es la propia emisin de la
lmpara, pero para eliminar lneas de otras longitudes de onda lejanas a la
lnea de trabajo se utilizan filtros de interferencia.
Adems de la longitud de onda de 254 nm, suelen emplearse filtros que
permiten trabajar a 313, 334, 365 nm. El empleo de filtros de xido de
fsforo permite trabajar incluso a 280 nm.
QUA 7017
LAMPARA DE
MERCURIO

FILTRO DE
INTERFERENCIA

CELDA

FOTO
MULTIPLICADOR

2.5.2.2. DETECTOR UV DE ONDA VARIABLE O ESPECTROFOTOMETRICO
Se reemplaza el compartimiento de cubetas por una celda de flujo.
Es ms verstil, ya que al tener red de difraccin permite seleccionar
libremente la longitud de onda de trabajo
Emplea lmpara de Deuterio o Xenn.
La luz emitida por la lmpara se enfoca en un monocromador, habitualmente
una red hologrfica de difraccin, y la luz monocromtica escogida se dirige
hacia la celda de medida y de all hacia el fotomultiplicador.
Actualmente existen detectores UV con ordenamiento de fotodiodos.
En los dispositivos convencionales, la red de difraccin se ubica antes de la
celda, la que recibe luz monocromtica seleccionada por la red. En los
detectores de ordenamiento de fotodiodos se emplea un sistema ptico
invertido: la celda se ilumina con luz blanca es decir no monocromada y la luz
emergente de la celda llega a la red de difraccin y all es dispersada hacia el
elemento fotosensible.
QUA 7017
2.5.3. DETECTOR FLUORESCENCIA
ANALISIS DE SUSTANCIAS QUE PRESENTAN FLUORESCENCIA NATURAL O
CONFERIDA POR DERIVATIZACIN CON UN REACTIVO FLUOROGNICO
POSEE ALTA SENSIBILIDAD (ANALISIS DE TRAZAS)
LA SELECTIVIDAD SE DEBE A:
1. EXISTEN POCAS SUSTANCIAS DE FLUORSCENCIA NATIVA
2. LAS REACCIONES DE DERIVATIZACIN IMPLICAN LA PRESENCIA DE UN
GRUPO FUNCIONASL DERIVATIZABLE.
3. SE UTILIZAN DOS LONGITUDES DE ONDA, UNA DE EXCITACIN Y OTRA
DE EMISION. (AL EXCITAR A UNA DADA LONGITUD DE ONDA VARIOS
COMPONENTES PUEDEN ABSORBER ENERGIA, PERO POCOS EMITIRN A
LA LONGITUD DE ONDA ELEGIDA)

QUA 7017
2.6. SOLVENTES
FM PUEDE MODIFICAR LA SELECTIVIDAD DE LAS SEPARACIONES,
SIENDO EL MOTOR DE LA SEPARACION EN FASE REVERSA
PROPIEDAD DE LOS SOLVENTES
1. ALTO PODER SOLUBILIZANTE DE LAS MUESTRAS
2. BAJA REACTIVIDAD
3. COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR UTILIZADO:
GENERALMENTE SE UTILIZA ESPECTROFOTMETRO (POR LO
CUAL SE TRABAJA CON SOLVENTES TRANSPARENTES A LA
LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO)
4. ADECUADO PUNTO DE EBULLICION (SE PREFIEREN
SOLVENTES CON P.E. INTERMEDIO)
PUNTO EBULLICION BAJO VOLATILIDAD ALTA
COMPOSICION FM VARIABLE
QUA 7017
5. BAJA VISCOSIDAD
6. SEGURIDAD (QUE NO SEA INFLAMABLE NI TOXICO)
7. ALTO GRADO DE PUREZA

FASE REVERSA
MEZCLAS DE SOLVENTES POLARES (AGUA) Y UN MODIFICADOR
ORGANICO (METANOL, ACETONITRILO)
FASE NORMAL
SOLVENTES NO POLARES (ETERES)
QUA 7017
7.1. ANALISIS CUALITATIVO
7.1.1. INFORMACIN CROMATOGRAMA :
TIEMPO RETENCIN (t
r
) Y EVIDENCIA
SEGURA DE AUSENCIA O PRESENCIA DE
CIERTOS COMPONENTES.

TIEMPO DE RETENCIN

Medida de los t
R
de sustancias patrones y muestras. La forma
ms sencilla consiste en adicionar a la muestra componentes
puros que se sospechen estn presentes en la muestra. Si la
sustancia agregada est presente en la muestra se producir un
aumento en el rea del pico.

Es conveniente repetir el procedimiento a distintas temperaturas
y en lo posible, en otra columna con distinta FE
QUA 7017
LOGARITMO DEL t
R
DE SERIES HOMLOGAS

Ejemplo: Parafinas normales, alcoholes primario normales frente
al nmero de tomos de carbono.

Para asegura la identificacin, se miden estos parmetros en una
segunda FE. As, por ejemplo un FE no polar y una FE polar. Es
poco probable que dos sustancias distintas que tienen igual t
R
en
una FE polar, tambin posean igual t
R
en una FE no polar.
QUA 7017
t
R
N tomos de Carbono
t
R

(
c
o
l
u
m
n
a

n
o

p
o
l
a
r
)

t
R
(columna polar)
7.2.1. CALIBRACION CON PATRONES O CON ESTANDAR
EXTERNO O ABSOLUTA
Se basa en la cantidad absoluta inyectada, la que se relaciona con
el rea obtenida. Se necesita realizar inyecciones muy precisas y se
deben mantener constantes todas las condiciones cromatogrficas.
7.2. ANLISIS CUANTITATIVO
EL ANLISIS CUANTITATIVO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE LA
UTILIZACIN DE ALTURAS Y/O AREAS
ALTURAS:
QUA 7017
A
r
e
a

p
i
c
o

Peso compuesto o Concentracin compuesto
7.2.2. NORMALIZACIN DE AREA O
NORMALIZACIN INTERNA O ESTANDARIZACIN
INTERNA
Se calcula el porcentaje, midiendo el rea de cada pico y
dividiendo las reas individuales por el rea total.
Este mtodo supone que todos los picos fueron eludos, estn
bien resueltos y el factor de respuesta del detector es el
mismo para cada componente.
QUA 7017
Pi = (Ai / EAi) *100
Pi = % del componente i en la mezcla A
Ai = rea del componente i
EAi = sumatoria de todas las reas del
cromatograma.


Ventajas
1. No requiere estndar de referencia
2. Es muy preciso ya que los errores de inyeccin y de
preparacin de la muestra se compensan.

Limitaciones
1. Es necesario que todos los componentes de la mezcla se
separen en el sistema cromatogrfico elegido.
2. Es necesario que todos los componentes tengan el mismo
factor de respuesta (fi) (es decir si se trabaja con un detector
UV, todas las sustancias deben tener el mismo valor de
absortividad a la longitud de onda elegida).

Tiene una amplia difusin en GC con FID, pero
prcticamente no se utiliza en HPLC

QUA 7017
Si se cuenta con los componentes puros, el mtodo puede
corregirse calculando sus factores de respuesta, es decir
Pi = (fiAi / E fiAi) * 100
fi = factor de respuesta calculado por la inyeccin de cada
uno de los componentes, segn:

Ejemplo


QUA 7017
Alcohol Concentracin
(%)
Area
Cm
2

Conc/rea Factor
relativo (F)
n-
butlico
24,61 3,023 8,141 1,000
Iso-
butlico
27,92 3,074 9,083 1,116
Sec-
butlico
21,52 3,112 6,915 0,849
Terc-
bullico
25,96 3,004 8,642 1,062
Alcohol Area
Cm
2

Area * F Concentracin
(%)
n- butlico 1,731 1,731 18,18
Iso-butlico 3,753 4,188 43,99
Sec-butlico 2,845 2,415 25,36
Terc-bullico 1,117 1,186 12,46
TOTAL 9,521 99,99
MUESTRA PROBLEMA
7.2.3. ESTANDAR INTERNO
Consiste en agregar cantidades exactamente medidas de una
sustancia as denominada, tanto a la muestra como a un estndar
que contiene el analito, preparado con la misma concentracin que
la muestra

CONSIDERACIONES
1. ESTE MTODO REQUIERE DE PATRONES DE REFERENCIA
2. SU EXACTITUD DEPENDERA DE LA PUREZA DE LOS
PATRONES
3. EL ESTANDAR DEBE CUMPLIR CON LOS SIGUIENTES
REQUISITOS.
A. NO DEBE ESTAR PRESENTE EN LA MUESTRA
B. DEBE PRESENTAR UN AREA SIMILAR A LA MUESTRA
C. DEBE ELUIR A UN VALOR DE k CERCANO A ANALITO
D. DEBE RESOLVERSE COMPLETAMENTE (R > O = 1.5)
E. DEBE SER ESTABLE Y QUIMICAMENTE INERTE
QUA 7017
F. DEBE RESPONDER EN FORMA SEMEJANTE AL ANALITO CON EL
DETECTOR SELECCIONADO
G. DEBE SER MISCIBLE CON LA MUESTRA.
H. NO PUEDE REACCIONAR CON LA FASE ESTACIONARIA
QUA 7017

r
e
a

(
c
o
m
p
o
n
e
n
t
e













/

e
s
t

n
d
a
r
)

Peso o concentracin
(componente / estndar)
Componente
Estndar
COMPENSA ERRORES DE INYECCION
USO CASI OBLIGADO EN GC NO ASI COMO EN HPLC
EN HPLC ES APROPIADO CUANDO EXISTEN
VARIACIONES EN LA CUANTIFICACIN DEL ANALITO.
QUA 7017
7.2.3. ESTANDAR AGREGADO O ADICION ESTANDAR
Consiste en inyectar dos muestras o tres muestras para realizar
un anlisis, una de ellas es la muestra tal cual y las otras es la
muestra a la que se agrega una cantidad conocida del estndar
de referencia
DESVENTAJAS
1. Requiere del uso de un estndar de referencia
2. Es sensible a los errores de inyeccin y preparacin de la
muestra.
VENTAJAS
Es utilizado cuando la matriz es
compleja y conlleva a cambios o
deformacin en los picos.




QUA 7017
EXCLUSION MOLECULAR O FILTRACION EN GEL
EXCLUSION MOLECULAR
INTERCAMBIO IONICO
Fase estacionaria contiene grupos
funcionales inicos y retiene el soluto, de
caractersticas inicas pero de signo
opuesto intercambindolo por un proceso
reversible con iones de la fase mvil.
R+X- + A- R+A- + X- Aninica

R-X+ + C+ R-C+ + X+
Catinica
En el proceso de intercambio, el contrain
presente en la fase mvil (X) compite con el
soluto por los sitios de intercambio de la fase
estacionaria y su concentracin, por efecto de
in comn, ser uno de los determinantes de la
fuerza de elucin de la fase mvil.

TIPOS DE SOLUTOS
Inicos,
Ionizables(cidos y bases dbiles)
Neutros con capacidad de formar complejos
inicos.
IONIZABLES

HA H
+
+ A
-
Acido dbil
B + H
2
O BH
+
+ OH
-
Base dbil


Variables a ajustar
pH
Concentracin del buffer y eventualmente una sal
agregada.

El catin o anin de igual carga a la del soluto
compite con ste para la ocupacin de los sitios
activos de intercambio y la fuerza inica modifica
la posicin de los equilibrios ya descritos.

ESPECIES NEUTRAS
Especies en estado no inico, an es posible la
retencin, debido a un proceso de particin
entre las fases estacionarias y mvil. La adicin
de un modificador produce una cada del t
R

(variable para el ajuste de fuerza y selectividad).
Formar complejos cargados, por ejemplo,
carbohidratos, que puedan formar complejos
con boratos, aminocidos, que pueden ser
tratados por intercambio de ligandos con
metales (Ca, Cu, Ni, etc.)
MATERIALES DERELLENO
Intercambiadores aninicos: contienen un
grupo fuerte (SAX) o dbilmente cido
(WAX). (Strong o weak anion exchanger).
Intercambiadores catinicos: contienen
grupos fuerte o dbilmente bsicos (SCX o
WCX, por strong o weak catin exchanger)

FUERTE: Disociados en todo el rango de pH
Puede provocar retenciones muy acentuadas
o irreversibles. (Dowex (H
+
); RN(CH
3
)
3
+
Cl
-
)
DEBILES: actan como tales en aquellos
rangos de pH que aseguran su disociacin,
ej., menor a 6 en los intercambiadores
catinicos (-COO
-
) y menor a 8 en los
aninicos (-NH3
+
).


Intercambiador catinico Intercambiador aninico
Fuertemente cido Dbilmente cido Fuertemente bsico Dbilmente bsico
-SO
3
H -COOH -NR
3
+
-NH
3
+

-PO
3
H
2
DEAE