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DIFFUSIONE

Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una
banda infinitamente stretta iniettata allinizio della colonna, emerge alluscita con una forma
gaussiana (in condizioni meno ideali la banda diviene asimmetrica).
Una delle principali cause dellallargamento della banda la DIFFUSIONE dovuto al flusso
(J) della sostanza da una zona a maggiore concentrazione ad una a minore concentrazione.
dx
dc
D J
s m
mol
Flusso = |
.
|

\
|

2
D = coefficiente di diffusione
Segno negativo perch il flusso netto va da
una zona a maggiore ad una a minore
concentrazione
Profilo gaussiano della banda
per effetto della diffusione
) 4 (
2
e
4
Dt x
Dt
m
c

=
t
Equazione del picco gaussiano
2 2
2 ) (
e
2
1
o
t o

=
x
y Dt 2 = o
dev. std del
picco
importante sottolineare che i piatti non esistono realmente allinterno della
colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene in
colonna. Inoltre sono utili per poter valutare lefficienza della colonna.
IL MODELLO DEI PIATTI TEORICI
Questo modello suppone che la colonna cromatografica contenga un elevato numero di
strati detti piatti teorici sui quali si instaura lequilibrio di ripartizione dellanalita tra fase
stazionaria e fase mobile.
Lanalita si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile,
allequilibrio su un piatto, al piatto successivo.
EFFICIENZA DELLA COLONNA
Se il soluto nella colonna ha percorso una distanza x alla velocit di flusso lineare u
x
, il
tempo che ha trascorso nella colonna sar t = x/u
x
.
Se per effetto della diffusione la o
2
della banda 2Dt, di conseguenza:
x H x
u
D
u
x
D Dt
x x
=
|
|
.
|

\
|
= = =
2
2 2
2
o
Altezza del Piatto Teorico
x H
2
o =
LAltezza del Piatto Teorico la
costante di proporzionalit tra la varianza
della banda (o
2
) e la distanza che essa ha
percorso (x)
Per un soluto che emerge da una colonna di lunghezza L, il numero di piatti teorici (N)
dellintera colonna, la lunghezza L divisa per lH :
Altezza del piatto piccola Picchi stretti Migliori separazioni
Quindi il numero di piatti teorici per una colonna pu essere calcolato esaminando
un picco cromatografico dopo leluizione.
Come si pu osservare dallequazione, il numero di piatti della colonna
diverso per ciascun analita nel campione.
2
2 / 1
2
2
2
2
2
2
2
2
55 . 5 16
spazio di anzich tempo di unit in e invece Esprimendo
/4. e poich
16
w
t
w
t
N
w L
w x L
w
L L x L
H
L
N
R R

=

=
= =

= =

= =
o
o o
La teoria cinetica
Una descrizione pi realistica del processo che avviene allinterno della colonna tiene conto
anche del tempo necessario allanalita per il raggiungimento dellequilibrio tra fase stazionaria
e fase mobile (nel modello dei piatti teorici si considera che il raggiungimento dellequilibrio
istantaneo)
La forma del picco cromatografico pertanto influenzata dalla velocit di eluizione, ma anche
dai cammini preferenziali dellanalita allinterno della fase stazionaria.
Considerando i vari meccanismi che contribuiscono allallargamento del picco si arriva alla
Equazione di Van Deemter per laltezza del piatto teorico:
H = A + B / u + C u
dove u la velocit media della fase mobile mentre A, B, e C sono fattori che contribuiscono
allallargamento del picco e sono costanti per una determinata colonna e fase stazionaria
A Diffusione di Eddy. La fase mobile contenente lanalita fluisce
attraverso la colonna impaccata con la fase stazionaria, pertanto le
molecole di analita seguiranno cammini casuali e differenti allinterno
della fase stazionaria. Ci comporta un allargamento della banda
perch i diversi cammini hanno diversa lunghezza e quindi le molecole
usciranno in tempi diversi.
B/u Diffusione Longitudinale. Poich la concentrazione
dellanalita maggiore al centro della banda, lanalita diffonder dal
centro alla periferia determinando un allargamento della banda stessa.
Questo effetto tanto meno pronunciato quanto pi elevata la
velocit della fase mobile (lanalita passa meno tempo allinterno della
colonna).
C u Resistenza al trasferimento di massa. Se la velocit della
fase mobile elevata e se lanalita ha una forte affinit per la fase
stazionaria, lanalita nella fase mobile esce prima dellanalita nella fase
stazionaria originando un grande allargamento della banda. Questo
effetto tanto maggiore quanto pi veloce la fase mobile.
Risoluzione
= 0.5
Risoluzione
= 0.75
Risoluzione
= 1.00
Risoluzione
= 1.50
In cromatografia la RISOLUZIONE fra 2 picchi definita come:


w
m
= larghezza media dei 2 picchi w
1/2m
= larghezza media a met altezza dei 2 picchi
m
r
m
r
w
t
w
t
2 / 1
589 . 0
e Risoluzion
A A
= =
Per lanalisi quantitativa preferibile una risoluzione uguale o superiore a 1.5
utile mettere in relazione R con il numero di piatti teorici della colonna, i fattori
di selettivit e i fattori di ritenzione dei due analiti. Lequazione che correla tutti
questi parametri la seguente:
|
|
.
|

\
|
+
|
.
|

\
|

=
'
'
1 1
4
B
B
k
k N
R
o
o
Per ottenere unalta risoluzione, necessario massimizzare i 3 termini.
Un aumento del numero di piatti teorici, aumentando la lunghezza della colonna,
porta ad un aumento nel tempo di ritenzione, ma pu provocare anche un
aumento della larghezza della banda.
In alternativa per aumentare il numero di piatti si pu ridurre laltezza del piatto
teorico riducendo la dimensione delle particelle della fase stazionaria.
La separazione pu essere migliorata controllando il fattore di capacit variando la
composizione della fase stazionaria.

Un tocco di realismo: bande di forma asimmetrica
Il coefficiente di ripartizione K = C
s
/C
m
dovrebbe essere costante ed indipendente dalla
concentrazione del soluto. Se cos fosse avremmo bande simmetriche di forma
gaussiana. Nelle colonne reali tuttavia K cambia allaumentare della concentrazione del
soluto e le bande si presentano codate.
C
m
C
s
S
e
g
n
a
l
e

Tempo
Sovraccarico (fronting)
K aumenta
S
e
g
n
a
l
e

Tempo
Codatura (tailing)
S
e
g
n
a
l
e

Tempo
IDEALE
K diminuisce
K = C
s
/C
m
= costante
Sovraccarico per iniezione di troppo
soluto: la banda emerge gradualmente
dalla colonna, ma termina bruscamente
Alcuni siti della fase stazionaria
trattengono il soluto pi fortemente di
altri: si origina cos una codatura
prolungata