Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Prof. Carlos Andr O. Ricart CBSP-Centro Brasileiro de Pesquisa em Protenas Departamento de Biologia Celular Universidade de Braslia
Por muitos anos a genmica funcional propagou a noo de que no seria necessrio estudar nveis de protenas para obter-se dados de up and down regulation. Tudo o que era necessrio seria a determinao dos nveis de mRNA
Em 1997, Anderson apresentou um trabalho mostrando a primeira comparao da abundncia de mRNA e protenas correspondentes. A correlao foi de 0,43
Anderson &Seihamer (1997) Electrophoresis 18, 533-537
A protemica, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para entender-se o funcionamento dos genes, pois analisa o produto final do genoma
A abordagem protemica exige a separao de protenas com alta resoluo para posterior anlise
Apesar de antiga, at o momento no surgiu uma metodologia capaz de resolver mais protenas simultaneamente do que a eletroforese bidimensional
Etapas Bsicas:
Um gande passo no uso da 2DPAGE ocorreu com o progresso nas tcnicas analticas de identificao de protenas
Cadeias laterais das protenas possuem grupos ionizveis carboxlicos(Asp,Glu), aminos (Lys), imidazis (His) e guanidino (Arg) R-COO- + H+ R-COOH R-NH3+ + OHR-NH2 + H2O
A carga lquida de uma protena funo da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga zero no seu ponto isoeltrico (pI) O pI de uma protena pode ser alterado por modificaes qumicas como fosforilaes O pr-requisito para uma boa IEF a formao de gradiente de pH estvel e reprodutvel
Gradientes de pH
A
focalizao isoeltrica realizada em gis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos:
Tampes
Gradientes
Gradiente de pH comampholytes
Com o uso dos ampholytes o gradiente de pH formado sob ao de um campo eltrico
Gel de IPG preparado pela mistura linear de duas solues de polimerizao com diferentes Immobilines, ambas contendo monmeros de acrilamida
|
R R
|
R
-C=O | O-
IPG Phor
gel
A amostra deve ser aplicada em um dos extremos de pH (perto do catodo ou do anodo) onde a maioria das protenas est carregada, minimizando perdas por precipitao
O gel de IPG reidratado na soluo contendo a amostra Permite aplicao de maior quantidade de protenas (>10 mg) Minimiza a precipitao de protenas durante a entrada no gel, principalmente para protenas de membrana Evita a manipulao exigida durante a aplicao usando sample cups
Sistema horizontal. Ex.Mutiphor II Electrophoresis unit (Pharmacia Biotech) Sistema vertical. Ex. SE 600, IsoDalt (Amersham), Investigator (Millipore), Protean II xi (BIO-RAD), etc.
...- CH2 - CH - CH2- CH - CH2 - CH -... | | | C=O C=O C=O | | | NH2 NH NH2 | CH2 | NH | C=O | ...-CH -CH2-CH - CH2 - CH -... | | C=O C=O | | NH2 NH2 poliacrilamida
Tamanho do poro
C - porcentagem de crosslinker
C = b x 100 a+b
SDS-PAGE-sistema vertical
Vantagens: Possibilidade de uso de equipamento preexistente no laboratrio, permite corridas simultneas de vrios gis dependendo do sistema utilizado
SDS-PAGE-Sistema horizontal
Vantagens:Melhor resoluo segundo a. Gorg, possibilidade de uso de gis precasted Desvantagens: permite apenas duas corridas simultneas
Preparao da Amostra
Para
a focalizao isoeltrica, as protenas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas
Agentes Redutores 2-mercaptoetanol era usado nos primrdios. Sua ao tamponante destri o gradiente de pH na regio bsica. DTT o mais utilizado. Obs: protenas com muita cistena no so totalmente reduzidas com DTT. Tributilfosfina (TBP) o mais potente agente redutor disponvel. Obs: voltil, txico e requer solvente orgnico para dissolver em gua. Tris(carbixietil) fosfine (Pierce Co.) uma fosfina hidrossolvel.
1-
Agentes caotrpicos:
Uso de reagentes caotrpicos, como a uria, por alterarem os parmetros do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de interaes no covalentes. A tiouria um agente caotrpico mais eficiente que a uria, mas pouco solvel em gua. A mistura uria- tiouria bastante eficiente.
Cuidado com a carbamilao causada pela uria! - A uria em gua existe em equilbrio com cianato de amnio (cujos nveis aumentam com a temperatura. - Cianato pode reagir com aminas (N-terminal ou lisinas). - Consequncia: heterogeneidade artefactual de carga, bloqueio N-terminal, etc. - Como evitar: grau de pureza da uria, evitar temperaturas acima de 37C, desionizar solues de uria e usar scavengers de cianato (amina primria).
Rompimento de interaes no covalentes 2- Detergentes: Rompem interaes hidrofbicas Para a focalizao isoeltrica, no podem ter carga lquida.Devem ser no-inicos ou zwitterionicos SDS deve ser evitado!! Os mais compatveis com as necessidades so o Triton X-100 e o CHAPS
Remoo de sais
Os sais interferem diretamente no processo eletrofortico. Eles migram atravs do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades. Isso causa zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuio do campo eltrico. Nessa zonas, as protenas no focalizam e aparecem como faixas. As tiras de IPG incham nessas zonas de aalta condutividade devido ao acmulo de gua.Remoo por precipitao ou dilise.
Deteco
Fatores importantes:
Faixa dinmica de deteco Linearidade Reprodutibilidade entre experimentos Variabilidade inter protena Compatibilidade com mtodos de identificao
Principais mtodos
Coomassie Blue Nitrato de Prata Reagentes fluorescentes Marcao radioativa
Apesar da enorme quantidade de trabalho protemico, continuamos observando a ponta do iceberg. A grande maioria das protenas protenas raras (e preciosas) ainda esto escondidas. Todos esto identificando as mesmas protenas (as mais abundantes)
Por que?
Actina (108 cpias /clula) Receptores celulares e fatores de transcrio (102-103 cpias /clula) Dinamic range 105-106 !!!! Dinamic range 2D-PAGE = ~104
Obs: a situao ainda pior em certas amostras como o soro sanguneo onde albumina presente em concentraes de 40 mg/mL e citocinas em pg/mL . Faixa dinmica de 109
Tipos
Dificuldade de automao Incapaz de detectar, identificar e quantificar todas as protenas de amostras complexas simultaneamente Dificuldade de resolver protenas extremamente cidas ou bsicas, assim como as muito hidrofbicas.
2D or not 2D?
Se o objetivo prover uma lista de todas as protenas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada espectrometria de massa em sequncia (MS/MS) pode fornecer resultados superiores Se o objetivo for observar mudanas quantitativas na expresso de protenas ou suas modificaes ps traducionais durante um processo biolgico, os gis bidimensionais ainda so inigualveis.
Tripomastigotas
Amastigotas