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2.

Microorganismos de importancia industrial y formulacin de medios de cultivo

2.1. Tipos de microorganismos

Los microorganismos que generan productos tiles para el hombre representan algunos cientos de especies de las ms de 100,000 que existen en la naturaleza.

Grupos de microorganismos de inters:


1. Hongos (Mohos) 2. Levaduras 3. Bacterias

4. Actinomicetos: bacterias filamentosas, fuente de antibiticos reconocida desde 1940.

Los microorganismos :
Son qumicamente similares a las clulas de animales superiores Pueden realizar muchas reacciones bioqumicas Existen como clulas simples o como colonias no especializadas, sin capacidad para controlar la temperatura celular Requerimientos para el crecimiento: sales inorgnicas solas o suplementadas de una hexosa simple

Los microorganismos se dividen en dos grandes grupos:


PROCARITIDOS: son los ms primitivos. Tienen un solo cromosoma de doble hlice de DNA, que se encuentra dentro del citoplasma. Ejem: bacterias EUCARITIDOS: son mucho ms grandes. Tienen al menos 2 cromosomas (algunos ms de 20) encerrados en una estructura celular con una doble membrana porosa. Sus cromosomas son lineales y asociados a las HISTONAS (protenas). Ejem: hongos y levaduras

Clasificacin de los microorganismos pertenecientes al reino protista


REINO PROTISTA Procariotas Algas verdeazules Eucariotas

Bacterias

Fungi

Algas

Protozoarios

Hongos

Levaduras

Diferencias entre clulas procariticas y eucariticas


Proc. Estructuras genticas nmero de cromosomas membrana nuclear
DNA nuclear unido a histonas

Euc.

1 -

>1 + + +

DNA en organelos

Diferencias entre clulas procariticas y eucariticas (cont.)


Proc. Estructuras citoplsmicas
nat. ribosomas citoplsmicos nat. ribosomas organelos

Euc.

70S ninguna -5x10-15 g(l)

80S 70S + +0
3x10-12 o 0.5x10-12

mitocondrias cloroplastos Cantidades relativas de DNA

En base a sus requerimientos ambientales, los microorganismos se dividen en:


AEROBIOS: crecen en presencia de O2 ANAEROBIOS ESTRICTOS: crecen en ausencia de O2 FACULTATIVOS: pueden adaptar su metabolismo a un medio aerobio o a uno anaerobio

Ejemplos de microorganismos:
AEROBIOS:
Estreptomicetos procaritidos (fuente de antibiticos) La mayora de los hongos filamentosos (quesos y alimentos fermentados)

ANAEROBIOS ESTRICTOS:
Clostridium Levaduras

FACULTATIVOS:

De acuerdo a la va fermentativa que siguen, los m.o. se clasifican en:


HOMOFERMENTATIVOS:
Generan un solo producto principal Ejemplo: bacterias lcticas que convierten la glucosa en cido lctico

HETEROFERMENTATIVOS:
Generan dos o ms productos principales. Ejemplos: bacterias lcticas que convierten la glucosa en cido lctico, etanol y CO2. Clostridium acetobutylieum convierte la glucosa en acetona, etanol, isopropanol y butanol

2.1.1. Procariotas
Bacterias:
Clulas simples que en base a su forma y tamao se dividen en: Cocos: 0.5 a 4 m de dimetro Bacilos: bastones de 0.5 a 20 m de largo por 0.5 a 4 m de ancho Espiroquetas: espirales de ms de 10 m de largo y 0.5 m de ancho

Otras estructuras en bacterias:


Bacteria anclada
Flagelo polar Flagelos mltiples

Flagelos bipolares

Caractersticas generales de las bacterias:


Se pueden desarrollar en medios aerobios y anaerobios que contengan agua En base a sus habilidades de sntesis se dividen en: Capacidad degradativa muy variable: algunas especies degradan protenas nativas y otras requieren de aminocidos y hexosas
Autotrficas Heterotrficas

De los subgrupos de bacterias, slo uno de ellos, EUBACTERIA, tiene microorganismos de inters industrial, como por ejemplo: Bacterias productoras de cido actico Bacterias aerbicas productoras de esporas Bacterias anaerbicas productoras de esporas Bacterias acidolcticas

Bacterias transformadoras o productoras de cido actico


Gluconobacter: bacterias gram (-), capaces de convertir etanol en cido actico

Acetobacter: bacterias gram (-), capaces de oxidar el cido actico hasta formar CO2 y H2O.

Bacterias aerbicas productoras de esporas


Bacillus subtilis: tiene atributos para substituir a E. coli, que es universalmente utilizado en las fermentaciones con DNA recombinante

Bacterias anaerbicas formadoras de esporas


Clostridium acetobutylicum: puede fermentar azcares para generar acetona, etanol, isopropanol y butanol. Otros sustratos fermentables por este grupo incluyen almidones, pectina y diversos compuestos nitrogenados

Bacterias acidolcticas
Leuconostoc: son bacterias heterofermentativas que transforman los CHOs en cido lctico, etanol y CO2 Streptococcus: son bacterias homofermentativas que generan slo cido lctico Lactobacillus

ACTINOMICETOS
Grupo de microorganismos pertenecientes a los procaritidos Aerobios estrictos Gram (+) No forman endoesporas El gnero ms grande es el de los Streptomicetos los cuales secretan antibiticos Otro gnero de inters es el de los Micromonospora algunas de cuyas especies tambin secretan antibiticos

2.1.2. Eucariotas
Hongos:
Gran importancia econmica, tanto por su utilidad como por el dao que provocan Importancia industrial:
Enzimas: amilasas, proteasas, pectinasas cidos orgnicos: ctrico, lctico Antibiticos: penicilina Quesos especiales: Camembert, Roquefort

Caractersticas de los hongos


Aerobios estrictos (con algunas excepciones) Pueden asimilar nitrgeno inorgnico y orgnico, pero no nitrgeno de la atmsfera Clulas nucleadas filamentosas que al unirse forman el MICELIO. Cada estructura tubular que forma el micelio es la HIFA Generalmente son saprfitos, no parsitos

Levaduras:
Las ms de 500 especies que existen se clasifican, normalmente, de acuerdo a su forma de reproduccin, SEXUAL Y ASEXUAL. Las tres principales clases de levaduras son:

Ascomicetos (sexual)

Basidiomicetos (sexual)
Deuteromicetos (asexual)

Ascomicetos:

Saccharomyces cerevisiae: cervecera, vinos, panificacin, preparacin de alcoholes Kluyveromyces fragilis: levadura fermentadora de lactosa explotada en pequea escala para elaborar alcohol a partir de suero de leche Saccharomyces lipolytica: capaz de metabolizar hidrocarburos como una fuente de cido ctrico

Deuteromicetos:
Candida utilis Trichosporun cutaneum: juega un papel importante en los sistemas de digestin aerbica de desechos. Gran capacidad de oxidar compuestos orgnicos Phafta rhodozyma: puede sintetizar carotenoides (astaxantincarotenoide)

Caractersticas de las levaduras


Algunas levaduras forman clulas elpticas de 8 a 15 m por 3 a 5 m, otras son esfricas No forman hifas y su pared celular contiene glucanos y no celulosa o quitina, como los hongos Las clulas pueden ser aerbicas o anaerbicas

Caractersticas fsicas y qumicas de las clulas microbianas


Caracterstica
Forma de las clulas

Bacterias
Bastn, esferas, espirales 0.5 - 3

Levaduras
Elipsoides, esferas, micelios, cadenas 1-5

Mohos
Micelios, esferas

Tamao de las clulas (mm) Presencia de esporas

5-15 diam. 50-5000 de largo En algunos

Ejem:

Bacillus

En algunas

(aerobio),

Clostridium
(anaerobio)

Caractersticas fsicas y qumicas de las clulas microbianas (Cont.)


Caracterstica
Composicin
Protena (N x 6.25) (nitrgeno total)
cido nucleico (RNA y DNA) CHOs y lpidos 1mm = 10-3 mm

Bacterias
65 75 %

Levaduras
45 55%

Mohos
25 55%

15 25% 5 30%

5 12% 10 50%

5 10 % 10 50%

Composicin qumica de los microorganismos


La cantidad de cada particular depende de : componente

Composicin del medio cultivo Edad del cultivo Velocidad de crecimiento

Anlisis qumico, peso seco y poblacin de diferentes m.o. obtenidos en cultivo


Protena (%B.S.) Virus Bacterias Hongos filament. Levaduras Algas unicel. 50 - 90 40 - 70 cido nucleico (%B.S.) 5 - 50 13 - 34 Lpido (%B.S.) <1 10 - 15 Poblacin (No./ml) 108 - 109 2x108 2 x 1011
Peso seco (g/ml)

0.0005 0.022.9

10 - 25
40 - 50 10 60 (50)

1-3
4 - 10 15 (3)

2-7
1-6 4 80 (10) 1.4x108 4.8x107

3-5
15 0.4 0.9

2.2. Mtodos de aislamiento de microorganismos

El AISLAMIENTO consiste en la obtencin de un cultivo ya sea PURO o MEZCLADO seguido por una comprobacin para saber si se llevar a cabo la reaccin deseada para obtener el producto deseado

Criterios para seleccionar el organismo adecuado (Bull y col., 1979)


1. Caractersticas nutricionales del m.o. 2. Temperatura ptima del m.o. 3. Reaccin del m.o. con el equipo y adaptabilidad al proceso 4. Estabilidad del m.o. Y docibilidad a manipulacin gentica 5. Productividad del m.o. 6. Facilidad de recuperar el producto a partir del cultivo

Aislamiento de m.o.
Antes de que el proceso se ponga en operacin comercial se debe confirmar la toxicidad del producto y m.o. Los cultivos deben ser aislados a partir del medio ambiente natural, sin embargo, el Ingeniero Bioqumico puede aislar m.o. a partir de colecciones de cultivo comerciales.

Mtodos de aislamiento de m.o.


1. Mtodos de aislamiento que utilizan seleccin de la caracterstica deseada la

2. Mtodos de aislamiento que no utilizan la seleccin de la caracterstica deseada


a. Seleccin de m.o. productores de antibiticos b. Seleccin en base a la generacin de compuestos farmaceticos activos c. Seleccin en base a la produccin de factores de crecimiento d. Aislamiento a partir de la produccin de polisacridos

a. Enriquecimiento de un cultivo lquido b. Uso del medio solidificado

Enriquecimiento de un cultivo lquido


Incremento en el nmero de un m.o. determinado en relacin a otros tipos presentes en el inculo original A una poblacin mezclada se le provee de condiciones adecuadas para el m.o. deseado o inadecuadas para los dems m.o. (sustratos particulares o inhibidores) Subcultivos se pueden repetir varias veces antes de que el m.o. dominante sea aislado

Enriquecimiento de un cultivo lquido


La prevalecencia de un m.o. en un cultivo depende de su velocidad especfica mxima de crecimiento en comparacin con la de los dems m.o. presentes en el medio Si el medio de cultivo y los tiempos de subcultivo son los correctos, el m.o. dominante crecer ms rpido que los dems SISTEMA CONTINUO en el cual se est adicionando medio nuevo al cultivo a una velocidad constante el m.o. dominante se seleccionar en base a su AFINIDAD al sustrato limitante

Enriquecimiento de un cultivo lquido


El crecimiento en un cultivo continuo es controlado por el factor de dilucin (TIEMPO DE RESIDENCIA) La velocidad de crecimiento se relaciona a la concentracin del sustrato limitante por la ecuacin: G = Gmax C K+C

Enriquecimiento de un cultivo lquido


Donde:
G = 1 dM = velocidad especfica de crecimiento M dt C = concentracin del sustrato limitante M = concentracin de la masa microbiana

Enriquecimiento de un cultivo lquido


G

Gmax

Gmax

Modelo de competitividad entre dos m.o. capaces de crecer en un cultivo continuo G A B


Y

Cy

Enriquecimiento de un cultivo lquido


Johnson (1972): Es importante usar como nica fuente de carbono durante el aislamiento a aquella a ser utilizada en el proceso comercial Se recomienda usar altas temperaturas de aislamiento Para simplificar el proceso de LAVADO, sugiere iniciar el proceso de aislamiento en un proceso intermitente con 20% de inculo y al iniciar el crecimiento transferir a medio fresco y los pasos subsecuentes de purificacin y estabilizacin se deben dar en un cultivo continuo

Uso del medio solidificado


Utilizado para el aislamiento de ciertos m.o. productores de enzimas, as como m.o. productores de inhibidores de enzimas, cido ctrico, esteroides, etc. Esta tcnica normalmente involucra el uso de un medio selectivo al cual se incorpora el sustrato que la enzima desdobla Para identificar el tipo de sistema enzimtico se aplican determinadas pruebas

Pruebas de identificacin para ENZIMAS EXTRACELULARES


AMILASA: hidrlisis del almidn en agar, revelado por la presencia de zonas claras despus de la aplicacin de yodo PROTEASA: solubilizacin de una protena a cierto pH en una suspensin de agar. Se presenta por zonas claras y licuefaccin de gel en gelatina (colagenasas)

LIPASAS: Digestin de un lpido patrn emulsificado en agar. Se presenta por zonas claras o por la precipitacin de cidos grasos liberados por la adicin de Ca2+ en el agar PECTINASAS: licuefaccin de un gel de pectato. El agar de pectina con buffer (pH 5 o 7) presenta zonas muy definidas cuando se les agrega bromuro de cetilmetilamonio (CTAB) para las ENDOPOLIGALACTURONASA o PECTATONASA respectivamente CARBOXIMETILCELULASA: Zonas claras en agar CMC cuando se trata con CTAB

Mtodos de aislamiento que no utilizan la seleccin de una caracterstica deseada


Empleada en microorganismos que producen antibiticos, promotores de crecimiento y sintetizadores de aminocidos y nucletidos Es deseable que el medio sobre el cual los aislados se hacen crecer, antes de su ensayo, permita la mxima expresin de sus caractersticas genticas

1.
2. 3. 4. 5.

6.

Preparar una serie de medios en los cuales diferentes tipos de nutrientes sean limitantes (C, N, P, O) Usar diferentes formas del nutriente necesario para el crecimiento Usar formas polimricas o complejas del nutriente limitante del crecimiento Evitar usar formas fcilmente asimilables de carbono (glucosa) o nitrgeno (NH4+) que pueden causar represin catablica Asegurarse de que los cofactores conocidos estn presentes (Co3+, Mg2+, Mn2+, Fe2+) Usar buffer para minimizar cambios en pH

Gua para el diseo de un medio en el que se permita una buena formacin de producto (Nisbet, 1982)

Aislamiento antibiticos

de

m.o.

productores

de

La accin antimicrobiana se detecta haciendo crecer al producto potencial, sobre una placa con agar, en presencia del m.o. contra el que se requiere la accin antimicrobiana
Zanher (1978) determin que se pueden aislar antibiticos con un espectro determinado de accin utilizando la combinacin de: Bacillus subtilis y Streptomyces viridrochronisgenes o Clostridium pasteurianum (Ejem: Kirromycina)

Aislamiento antibiticos

de

m.o.

productores

de

En la actualidad, la mayora de pruebas de actividad antimicrobiana se efectan con gnero raros de Actinomycetos con las siguientes caractersticas:
Velocidades de crecimiento bajas Requerimientos nutricionales mayores Esporulacin pobre Baja estabilidad en poblaciones de m.o. provenientes del suelo

Metabolitos secundarios obtenidos a partir de gneros raros de Actinomicetos


GNERO METABOLITO Talloysomicinas A, B; Nebramycina, Factores II, IV, V Rifamicina O, Carminomicina Maduromicina, Luzopeptina Bleomicina, Pheomicina, Sibiromicina, Chloramphenicol Gardimicina, Purpuromicina, Teichomicina, Lipiariamicina

Streptoalloteichus Actinomadura Streptosporangium Actinoplanes

Seleccin en base a la generacin de compuestos farmacuticos activos


Umezawa (1972) fue el pionero en los conceptos de aislar productos microbianos capaces de inhibir enzimas claves del metabolismo humano Si un compuesto inhibe una enzima clave humana IN VITRO, tambin puede tener dicha accin farmacolgica IN VIVO

Compuestos famacuticos activos obtenidos a partir de microorganismos


AREA
Antihistamnicos

ENZIMAS
Histamina-N-metiltransferasa

Antilipidamica
Protelisis

3-HMG-CoA reductasa, enzima condensante Tripsina, plasmina, papana, pepsina a amilasa, sucrasa, b galactosidasa neuraminidasa

Glicohidrolosas

Seleccin en base a la produccin de factores de crecimiento


Los m.o. productores de factores de crecimiento, como aminocidos y nucletidos, han sido aislados al azar y los productos detectados por pruebas subsecuentes de tamizacin, probando la estimulacin del crecimiento en bacterias auxotrficas

La mayora de los productores de aminocidos pertenecen a los gneros Arthrobacter,

Microbacterium, Brevibacterium, Micrococcus y Corynebacterium

Seleccin en base a la produccin de factores de crecimiento


Daoust (1976) sugiri la exclusin de hongos en este tipo de investigacin por la adicin de compuestos antifungales (cicloheximida) en el medio de aislamiento La prueba inicial de produccin de aminocidos es cualitativa y se lleva a cabo en medio slido Finalmente se realizan ensayos cuantitativos en cultivo lquido

Aislamiento a partir de la produccin de polisacridos


La propiedad de produccin de polisacridos es difcil de aplicar como un factor selectivo de aislamiento Lawson y Sutherland (1978) sugieren el uso de materiales de aislamiento, como desechos de la industria de carbohidratos, los cuales son ricos en estos m.o. Los m.o. productores de polisacridos se reconocen por la apariencia mucilaginosa de sus colonias al hacerlos crecer en los medios adecuados

2.3. Conservacin de microorganismos aislados

Objetivos: Evitar cambios genticos para retener las caractersticas deseables Proteger contra la contaminacin Retener la viabilidad Un m.o. se puede conservar viable mediante subcultivos repetidos en medio nuevo, pero existe probabilidad alta de mutacin y degeneracin Las tcnicas de conservacin mantienen al cultivo en un estado de animacin suspendida, almacenndolos a temperatura reducida o deshidratados

2.3. Conservacin de microorganismos aislados


1. Almacenamiento reducidas a temperaturas
a. Almacenamiento sobre agar inclinado b. Almacenamiento de esporas en agua c. Almacenamiento sobre nitrgeno lquido

2. Almacenamiento deshidratada

en

una

forma

a. Cultivo de suelo (tierra) b. Liofilizacin

Almacenamiento sobre agar inclinado


Almacenados en refrigeracin (5C) o congelacin (-20C) Los subcultivos se realizan a intervalos de 6 meses o 1 ao si se cubre con aceite mineral estril grado medicinal

Amacenamiento de esporas en agua


Algunas esporas se han conservado suspendidas en agua destilada estril y almacenndolas a 5C Su aplicacin ha sido muy limitada

Almacenamiento bajo nitrgeno lquido


Se alcanzan temperaturas de almacenamiento muy bajas (-150 a 196C), con lo que la actividades metablicas de los m.o. se reducen considerablemente Tcnica: Hacer crecer el cultivo a su mxima fase estacionaria Resuspender las clulas en un agente crioprotectivo como glicerol al 10% Congelar la suspensin en ampolletas cerradas Almacenar en nitrgeno lquido

Almacenamiento bajo nitrgeno lquido


Heckley (1978) propuso que los mejores resultados se logran congelando la suspensin lentamente antes de su almacenamiento y descongelando rpidamente para revitalizar el cultivo La prdida de viabilidad se presenta durante la congelacin del cultivo, pero es mnima durante el almacenamiento Principales desventajas: elevados gastos de mantenimiento y posible dao por fallas en el equipo

Cultivo de suelo (tierra)


Tcnica utilizada ampliamente para almacenamiento de hongos y actinomicetos Tcnica: Inocular tierra hmeda y estril con el cultivo Incubar por algunos das Dejar secar a temperatura ambiente por 2 semanas Almacenar en atmsfera seca o refrigeracin

Pridham y col. (1973) observaron que de 1800 actinomicetos secos sobre tierra, cerca del 50% eran viables despus de 20 aos de almacenamiento

Liofilizacin
Hacer crecer al cultivo a su mxima fase estacionaria Resuspender las clulas en un medio protectivo como leche, suero o glutamato de sodio Transferir la suspensin a ampolletas Congelar y liofilizar Sellar la ampolleta Almacenar, si es en refrigeracin los m.o. se pueden conservar viables por 10 aos o ms

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