Hospital General San Juan de Dios Posgrado de Medicina Interna

Objetivos
Describir las caractersticas bsicas de las tinciones

usadas en microbiologa.
Mencionar las principales tinciones y sus usos. Describir la tcnica de coloracin de las tinciones ms

utilizadas

Tinciones
Colorante biolgico: sustancia capaz de unirse a una

estructura celular y darle color.

Colorantes naturales:

Se extraen de productos vegetales o animales (carmn, tornasol, ndigo, hematoxilina).

Colorantes sintticos: anilinas sintticas.

 Colorantes bsicos: contienen un catin coloreado

unido a un anin incoloro.

Colorantes cidos: catin incoloro unido a un anin

coloreado.

 Los bsicos son los ms usados, ya que las bacterias

ricas en cidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfato, que se combinan con los coloreantes cargados positivamente.
Bsicos: tionina, azul de toluidina, azul de metileno,

fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo, safranina, verde de malaquita.
cidos: naranja G, cido pcrico, fucsina cida, eosina.

 Coloreantes neutros: eosinato azul de metileno, azul

de toluidina, violeta de metilo.

Directas: se tien por simple inmersin. Indirectas. Se tien al aadir un mordiente.

Simples: un solo coloreante.

Diferenciales o compuestas: varios coloreantes (Gram y

Ziehl-Neelsen).

Caractersticas del Frote

Debe de ser delgado. Los gruesos se descaman . Requieren ms tiempo para colorear. Debe ser teido despus de fijar y secar.

Exmen Directo
Un solo colorante.

Examen en Fresco
No teida.
Examen directo de aspirados, heces, flujo vaginal,

sedimento urinario para hongos y parsitos. Permite determinar morfologa, estructura, actividad biolgica, motilidad, reaccin a qumicos, reactividad serolgica. Microscopa campo brillante. Campo oscuro. Contraste de fases.

Candida sp en un examen en fresco.

Examen directo en fresco realizado en esputo y donde se observan las esfrulas con endospora formas parasitarias de Coccidioides spp.

Exmen en Fresco con KOH 10%

Distingue elementos fngicos en moco grueso o en

material queratinizado como piel, pelo y uas.

KOH
Disuelve el material proteico.
Facilita deteccin elementos fngicos. Se puede agregar azul de algodn de lactofenol para

aumentar el contraste. Al agregarlo el azul anilina colorea la pared externa de los hongos y el cido lctico acta como aclarador.

Levaduras y seudofilamentos de Candida spp

Tinta de India
Las cpsulas de polisacrido excluyen las partculas de

tinta y aparecen como halos claros alrededor de los organismos, que se encuentran sobre fondos semiopacos.

Tinta de India
Modificacin del procedimiento de KOH.
Se agrega tinta china.

Principalmente Cryptococcus en LCR.

La cpsula polisacrida no se tie. Crea un halo alrededor de la clula de levadura. Pueden observarse tambin bacterias encapsuladas

(Bacillus anthracis).

Cryptococcus neoformans . Tincin con tinta china

Lugol
Se agrega yodo a las preparaciones hmedas de muestras

parasitolgicas.
Crea contraste entre las estructuras.
El yodo tie los ncleos protozoarios y organelas

intracitoplasmticas de caf .
Permite deteccin de protozoos intestinales, huevos de

helmintos o larvas.
Facilita diferenciacin entre amebas y leucocitos.

I. belli. Ooquiste con esporoblasto. Tincin Kinyoun

I. belli (C. belli). Ooquiste con dos esporoblastos. Examen con lugol

I. Belli. Frote en fresco

Quiste de Giardia. Tincin de lugol

Azul de Metileno
Diferencia microrganismos por morfologa. Permite identificar grnulos metacromticos de

Corynobacterium diphterieae.

Detecta glbulos blancos en heces.

Se puede usar junto con gram para detectar bacterias.

Apariencia: tie GB azul oscuro con fondo gris claro.

C. diphteriae aparece como bacilos azules con grnulos

prominentes azul oscuro.

 Poco usada.

Circunstancias especficas:
Morfologa fusiforme de bacterias y espiroquetas en

infecciones orales (angina de Vincent). Establece localizacin extracelular de neisseria. Eleccin en difteria.

Trichomonas vaginalis con solucin actica formolada/azul de metileno

Franciscella tularensis con tincin azul de metileno.

Maczugowiec bonicy (Corynobacterium diphtheriae) Tags: bakteria, jad bakteryjny, maczugowiec bonicy Posted in Pasoyty w kolejnoci alfabetycznej

Tinciones Acidorresistentes
Especies

de Mycobacterium, nocardias, algunos actinomicetos y criptosporidios retienen coloreantes an despus de decoloracin con cidos o soluciones de cido-alcohol o cido acetona.

Se atribuye a la presencia de cido miclico en las

paredes bacterianas.
En el caso de criptosporidios y endosporas se atribuye a

factores de impermeabilidad.

Ziehl-Neelsen
Modificacin del mtodo de Paul Ehrlich en 1882.

Se cubre frotis con solucin de carbolfucsina. Calentamiento. Se lava con agua. Se decolora con alcohol-cido (cido clorhdrico al 3% en etanol). Se seca. AAR: color rojo. No AAR: color azul.

Ziehl-Neelsen
Para micobacterias y organismos acidorresistentes.
Se tien con carbolfucsina bsica y resisten la

decoloracin con soluciones cido base. El fondo se tie para contrastar con azul de metileno. Microorganismos se ven rojos sobre fondo azul claro. Requiere calentamiento de la muestra. Permite detectar bacterias alcohol resistentes( Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia, Legionella micdadei).

Ziehl-Neelsen staining identified multiple acid-fast bacilli consistent with a diagnosis of tuberculous peritonitis.

Kinyoun
Tincin acidorresistente en fro. No requiere calentamiento. Mismo principio que Ziehl-Neelsen.

Presencia de BAAR en tejido ganglionar

Kinyoun Modificado
Se usa decolorante dbil.

Microorganismos se tien dbilmente ( Nocardia,

Rhodococcus, tsukamurella, Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis, Cyclospora).

Se denominan parcialmente acidorresistentes.

Oocysts of Cryptosporidium in modified Kinyoun's acid-fast stained smear.

Auramina-Rodamina
Mismo principio que tinciones acidorresistentes. Se

usan pigmentos fluorescentes rodamina) para la tincin principal.

(auramina

Fluorocromos no especficos se unen al cido miclico.

 Permanganato de potasio contraste e inactiva

pigmentos de fluorocromo no fijados.

AAR fluorescen amarillo-naranja en fondo negro.

Si no se usa tincin secundaria, la fluorescencia verde

amarillenta sobre un fondo negro.

Oocistos de Cryptosporidium parvum con auramina rodamina

Wright Giemsa
Modificacin de tincin de Romanowski (azul de

metileno con eosina).

Diferencia parsitos intra y extracelulares. Wright: fijacin junto don tincin. Giemsa: procedimientos separados.

Wright-Giemsa
Parsitos sanguneos. Cuerpos de inclusin de virus y clamidias. Especies de Borrelia, Toxoplasma, Pneumocystis y

Rickettsia. y eosina Y.

Tincin policromtica: mezcla de azul de metileno, azur B

Eosina tie entre naranja y rosa. Otros pigmentos entre azul y violeta.

 Trofozotos de protozoos: ncleos rojos y citoplasma

azul verdoso.
Levaduras intracelulares y cuerpos de inclusin: azul. Clamidias y especies de Pneumocystis: violeta.

H. capsulatum: azul.
Rickettsias: morado-azul.

 Parsitos: malaria, Leishmania, microfilarias, Babesia.

Mdula sea o FSP: H. capsulatum. Inclusiones virales de clulas infectadas. Toxoplasma y Pneumocystis.

Microfilaria of L. loa in a thin blood smear, .stained with Giemsa

T. cruzi trypomastigote in a thin blood smear stained with Giemsa. Note the typical C-shape of the trypomastigote that characterizes T. cruzi in fixed blood smears.

Esporozoito. Glndula mucosa de mosquito. Tincin de Giemsa.

Abundantes trofozotos formando una nube con puntillado eosinoflico, rodeada de macrfagos en el LBA paciente con neumona por Pneumocystis jiroveci. Coloracin May-Grnwald-Giemsa.

Acmulo fluorescente verde manzana de elementos en forma de panal correspondiente a Pneumocystis jiroveci en el LBA de paciente con neumona por Pneumocystis jiroveci . Tcnica : inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales.

Tincin de Gram
Desarrollada en 1884 por Hans Christian Gram.

Cuatro reactivos diferentes:

1.

Cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina): Tie todas las clulas de color azul-violeta.

2. Lugol (yodo-yoduro de potasio): El yoduro

reemplaza al cloruro del cristal violeta y se vuelve insoluble en agua.

3. Acetona y etanol: Remueve solo el coloreante de las

clulas gramnegativas. (Uniones a magnesio, ribonuclasas, cido nucleico).

4. Safranina: Hace visible las clulas gramnegativas al

teirlas de rojo.

 Espectro de tincin: bacterias, hongos, parsitos

(tricomonas), protozoarios.
Excepciones:

larvas

de

Strongyloides,

quistes

o Mycoplasma (no pared celular). o Chlamydia y Rickettsias (muy pequeas). o Legionella no se tie en muestras clnicas, pero si se

puede ver en crecimiento de cultivos. o Diferencia clulas epiteliales de inflamatorias.

Gram stain of unspun urine (x1000) shows an inflammatory cell and numerous Gram negative bacilli. Escherichia coli grew from this specimen. .

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Campylobacter jejuni se observan bacilos de morfologa curvada y gramnegativos.

Tincin de Gram de descargo uretral. La imagen muestra muchos leucocitos polimorfonucleares y diplococos gramnegativos, intra y extra-celulares (1,000X immersin).

Modificaciones
Hucker

Solucin de cristal violeta en lugar de violeta genciana

Carbolfucsina como coloreante de contraste

Bacilos anaerobios gramnegativos y especies del gnero Legionella.

Kopeloff

Mejor visualizacin de bacterias anaerobias. Se adiciona cristal violeta y NaHCO3 al 5%.

Tricromo y Tricromo Modificada

Protozoos citoplasma entre verde azulado y violeta.

Ncleos y cuerpos de inclusin entre rojo y rojo

purpreo.
Fondo verde

Entamoeba histoloyitca. Trofozoito. Tincion tricromica

Tinciones Fluorescentes
Se basan en la coloracin que adquieren las estructuras

al agregar un fluorocromo.
El DNA bacteriano y fngico se tornan color naranja a

la luz ultravioleta.
El DNA mamfero es color verde.

Acridina Naranja
Fluorocromo que puede ser intercalado en el cido

nucleico.
Puede diferenciar entre DNA bacteriano y fngico. Ms sensible que Gram en: caldos de cultivo, LCR,

Acanthamoeba, queratitis infecciosa, H. pylorio.

Muy til en muestras gruesas o purulentas.

Acridina-Naranja
Bacterias y hongos Pigmento se intercala con cido nucleico
pH neutro: bacterias, hongos y material celular

naranja rojizo pH cido: bacterias y hongos naranja rojizo, pero material de fondo amarillo verdoso
Bacterias: Helicobacter, Campylobacter Hongos

Staphyllococcus aureus Leucocitos en prueba de cytospin teida con naranja de acridina leucocito cytospin .

Auramina-Rodamina
Igual que acidorresistentes

Blanco Calcoflor
Fluorocromo no especfico que une a los polisacridos

-3 fiajados, sobre todo celulosa de paredes celulares fngicas, levaduras, hifas y pseudohifas.

Blanco Calcofluor
Elementos fngicos y especies Pneumocystis.
Se une a celulosa y quitina. Puede mezclar el pigmento con KOH. Permite deteccin de parsitos (microsporidia, quistes

protozoarios).

Histopatologa. Esfrula con endosporas. Tincin calcofluor.

Anticuerpos Fluorescentes
Se acoplan anticuerpos con molculas fluorescentes.
Unin especfica a un microorganismo se detecta por

presencia de fluorescencia microbiana.

til para detectar: S. pyogenes, Bordetella, Francisella,

Legionella, Chlamydia, Cryptosporidium, Giardia, virus influnza, VHS.

Otras
Brown-Hopes-Gram

Para distinguir bacterias en cortes de tejido.

Warthin Stary

Para espiroquetas y en tincin de biopsias de tejidos para detectar rickettsias.

Giemsa, Machiavello y Castaeda

Deteccin de rickettsias en microscopio luminoso. Clamidias pueden detectarse con Giemsa y Machiavello.

PAS
Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los

carbohidratos por la accin del cido perydico, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso.

Coloracin ZN y PAS. Elementos fngicos intracelulares compatibles con histoplasma

 Permite identificar levaduras e hifas. Las paredes celulares se tien color rosado-magenta

brillante.
Mayor parte fija la tincin.

Ha sido reemplazado por blanco calcoflor.

No se puede usar en secreciones respiratorias no digeridas. Nocardia no se tie y Blastomyces dermatitidis aaprece

pleomrfico.