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1) Choque Osmtico
No ocorre rompimento total das clulas; Pode propiciar a permeabilizao seletiva; As clulas so mantidas por 30 minutos em meio com
concentrao de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugao e ressuspensas em gua destilada a 4C.
Mais indicado para bactrias Gram-negativas, pois possuem
Congelamento-descongelamento
As clulas passam por repetidos ciclos de congelamento
e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la formando poros permeveis biomolcula-alvo.
Fatores que mais influenciam: tipo e idade da clula; Temperatura Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;
Congelamento-descongelamento
Mtodo de difcil implantao em grande escala Enzimas sensveis ao congelamento podem ser
inativadas
Termlise
Consiste no aquecimento da suspenso celular em banho
sua simplicidade;
Termlise
Exemplos:
Rompimento total de clulas de uma suspenso de E.
coli (bactria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 C por 15 minutos com liberao de enzimas intracelulares
Uma suspenso de Bacilus megaterium nas mesmas
condies proporciona o rompimento de menos da metade das clulas (bactria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)
Rompimento Qumico
lcalis:
Adequado quando a molcula-alvo estvel em pH
Rompimento Qumico
Detergentes:
So capazes de dissociar protenas e lipoprotenas das
paredes celulares, provocando a formao de poros e liberar a molcula-alvo; A clula pode ser totalmente rompida; Ex.: lauril sulfato de sdio, Triton, etc. Formao de espuma e desnaturao e/ou precipitao de protenas
Rompimento Qumico
Solventes:
Consiste na desidratao das clulas, sendo os
Rompimento Qumico
Lise enzimtica:
rompida pela presso osmtica interna, aps a parede celular, ou parte dela, ser removida por ao das enzimas, permitindo que o contedo intracelular seja liberado. rompimento mecnico, temperatura, tenso de cisalhamento e elevadas presses. possibilidade de reciclo da enzima.
Rompimento Qumico
Sistema enzimtico deve ser adequado para cada tipo
de microrganismo:
Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais
Preservao da Biomolcula-alvo
Adio de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da
degradao de protenas);
Adio de agentes redutores (para evitar a oxidao dos
Precipitao
Precipitao
Um dos mtodos mais tradicionais de concentrao e
purificao;
funo tridimensional modificada, e a funo bioqumica de uma protena depende de sua estrutura; precipitao
Precipitao
Precipitante
Sais neutros (Salting-out) Polmeros no-inicos
Princpio
Vantagens
- Corrosivo
Desvantagens
Interaes hidrofbicas pela - Uso universal reduo da camada de hidratao da protena - Baixo custo Excluso da protena da fase - Uso de pequenas aquosa reduzindo a quantidade de quantidades de precipitante gua disponvel para a solvatao da protena interaes hidrofbicas e - Baixo custo interferncia das molculas de gua - Simples nas ligaes de hidrognio, Ligao com a molcula de protena - Uso de pequenas atuando como agente floculante quantidades de precipitante Neutralizao da carga global da protena pela alterao do pH do meio Formao de complexos - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Uso de pequenas quantidades de precipitante
Calor
- Risco de desnaturao
Reduo da constante dieltrica do - Facilidade de reciclagem meio aumentando as interaes eletrostticas intermoleculares - Facilidade na remoo do precipitado
Constituio
elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as protenas.
diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o carter cido ou bsico do aa em soluo.
Os 20 aa das protenas se
secundria: refere-se ao grau de ordenao espacial da cadeia polipeptdica. So estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.
obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundria. Envolve a otimizao de vrias interaes (hidrofbicas, eletrostticas e de van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios grupos na estrutura da protena.
Solubilidade de Protenas
Determina sua solubilidade Regio Hidrofbica (Apolar)
Alm dos aa, ons ferro e cobre, oligossacardeos e lipdeos conferem diferentes solubilidades s protenas.
ponto isoeltrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a protena possui carga global igual a zero.
pH e distribuio de cargas:
+ + pI - -
De modo geral, o solvente aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanas na fora inica e no pH, por adio de solventes orgnicos miscveis e polmeros orgnicos, altera-se a solubilidade das protenas.
Desnaturao X Precipitao
A desnaturao compreende a destruio da estrutura terciria de uma molcula de protena e a formao de cadeias polipeptdicas ao acaso. - as variveis pH, temperatura e solventes orgnicos, dependendo dos valores, causam desnaturao das protenas.
A precipitao compreende a modificao da estrutura tridimensional da molcula de protena. - as mesmas variveis, dependendo dos valores, causam precipitao das protenas.
conformao adequada da protena seja recuperada, para que a mesma possa exercer sua funo bioqumica aps o processo.
camada de hidratao
Salting-out:
adio de sais que promovem o aprisionamento de molculas de gua que tornam-se escassas e o consequente consumo das molculas de gua nas regies hidrofbicas, que expostas interagem e se agregam.
elevada solubilidade, ex.: citrato de sdio, sulfato de sdio e sulfato de amnio.
induz interaes inicas e agregao entre molculas de protena. Globulinas se precipitam sob fora inica baixa
Mtodo mais comumente usado para separao de protenas o da adio de sais neutros (salting out)
precipitantes;
Deve ser miscvel em gua, no reagir diretamente com as
Mecanismo
Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre superfcies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgnico.
precipitada e da massa molar do polmero, sendo inversamente proporcional concentrao da protena; Remoo do polmero: ultrafiltrao, adio de etanol, separao pela formao de duas fases aquosas pela adio de sais.
Polieletrlitos:
polmeros inicos solveis em gua; usados devido ao baixo custo e pouca concentrao residual; Poliction polietilenoimina e polinion cido poliacrlico, utilizados para precipitar cidos nuclicos e protenas. Mecanismo: Ocorre a agregao protena (floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas); a protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se operar longe do ponto isoeltrico da protena.
Precipitao isoeltrica
Resulta da atrao eletrosttica das protenas quando estas esto prximas a seu pI; Mtodo bastante simples: ajuste do pH Prximo ao pI a repulso eletrosttica mnima => precipitao isoeltrica, por interao entre as zonas hidrofbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturao Obs.: Mtodo til para precipitar protenas indesejveis e otimizar outros tipos de precipitao;