REVISIN DE MTODOS

ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

EQUIPO: 4 CARRASCO ZIGA CESAR DANIELA

V E G A TAL L E D O S N S TO R AL A N
G A R I B AY R O D R G U E Z M A R I C E L A

Resumen
La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis cualitativos y cuantitativos de molculas biolgicas ms ampliamente utilizado. La elaboracin de una curva estndar se basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un compuesto en disolucin y su concentracin. En este reporte se elaboro una curva estndar de protena (BSA) empleando el mtodo Lowry.

Introduccin Para realizar el estudio de molculas biolgicas el espectrofotmetro ha sido el instrumento ms utilizado, como en el caso del estudio de las protenas. Este instrumento se rige por la ley de Beer, la cual habla de que al dividirse la disolucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N (# de iones o molculas). Por lo tanto la absorbancia engloba todos los componentes de la espectrofotometra (concentracin, longitud de celda o paso ptico y la absortividad propia de cada especie) de la solucin de estudio. Entonces al graficar la absorbancia como funcin de su concentracin, nos genera una curva de calibracin, que nos ayuda a determinar la concentracin de la sustancia.
Entre las tcnicas espectroscpicas colorimtricas diseadas para este fin se encuentra: el mtodo de Lowry (1951), basado en la cuantificacin de los grupos fenlicos, que permite valorar el aminocido tirosina, nico aminocido fenlico de las protenas; el mtodo de Bradford, que cuantifica los aminocidos bsicos y aromticos; el mtodo de Biuret, basado en la reaccin coloreada caracterstica del enlace peptdico, y el mtodo del cido bincinconnico, basado en la propiedad de las protenas de reducir el ion cprico a cuproso. (Hernandez Gill ,2010)

Mtodo de Lowry: en condiciones alcalinas, el Cu2+ forma un complejo con las uniones peptdicas de las protenas y se reduce a Cu+. El Cu+ y los grupos radicales de los residuos de tirosina, triptfano y cistena reaccionan con el reactivo de Folin. El reactivo forma inicialmente un producto inestable, el cual es lentamente reducido hasta formar azul de molibdeno/tungsteno. Como desventaja los agentes acidificantes y los quelantes o reductores del cobre pueden interfer con el ensayo. (Gomez Fiorentino 1994)

Hiptesis Gracias al mtodo colorimtrico de Lowry pueden determinarse protenas mediante el uso de una curva patrn. Si se cumple que la absorbancia de una muestra es proporcional a su concentracin, entonces se podr determinar la concentracin de protenas en una muestra problema. Objetivos Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotomtricos. Elaborar una curva patrn y observar su comportamiento mediante el mtodo de Lowry. Determinar la concentracin de protenas presentes en una muestra problema.

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry

Graficar la curva patrn para calcular la concentracin de la muestra problema.

Rotular, adicionar reactivos de acuerdo a la tabla 1, mezclar con vortex

Ajustar con tubo 1 (blanco), realizar lecturas y anotar absorbancias

Incubar a temp. amb. por 30 min. Encender espectrofotmetro.

Resultados

Tabla 1. Reactivos y cantidades a aadir una curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracin de protenas de una muestra problema.
Tubo H2O (L) BSA (1mg/mL) Muestra problema (L) Reactivo A (L) Reactivo B (L) A 750nm Protena (g)

1 2

450 445

--5

-----

500 500

250 250

0.193 0.193

3
4 5 6 7 8 9 10

440
435 430 425 420 416 425 400

10
15 20 25 30 35 -----

------------50 100

500
500 500 500 500 500 500 500

250
250 250 250 250 250 250 250

0.408
0.487 0.641 0.800 0.853 0.969 0.127 0.0432 0..199 0.0480

GRAFICA 1. CURVA PATRN BSA vs Abs

1.2 1 0.8 Abs (nm) 0.6 y = 0.0272x + 0.0683 R = 0.979

0.4
0.2 0 0 5 10 15 20 BSA (mg/mL) 25 30 35 40

Anlisis de resultados Al realizar la curva de calibracin con los datos obtenidos de absorbancia, nos damos cuenta que son congruentes, es decir, conforme la concentracin de la sustancia es mayor la absorbancia va aumentando respectivamente, sin embargo al obtener el coeficiente de correlacin lineal (0.979) esta un poco alejado al esperado (r=0.9999). Al obtener la concentracin de las muestras problema obtuvimos datos muy parecidos entre si, 0.0432 g/L y 0.0481 g/L lo cual indica que el trabajo experimental estuvo bien realizado, aunque el valor esperado de concentracin de la muestra era de 0.1 g/L, quiz estos valores un poco alejados al real se pudieron deber a diferentes factores: 1) 2) 3) 4) Que las diluciones que se realizaron no fueron las correctas. Se tomo una menor cantidad de muestra al momento de pipetear. No se coloco la pipeta totalmente vertical al momento de descargar la muestra. Mala lectura del espectrofotmetro.

Conclusin Mediante el mtodo colorimtrico de Lowry se pudo determinar la concentracin de protenas en una muestra problema mediante el uso de una curva patrn. Se cumpli que la absorbancia de una muestra es proporcional a su concentracin, es decir, conforme la concentracin de la muestra era mayor la absorbancia de la misma era directamente proporcional.

Bibliografa Pesce, A. Qumica Clnica: Mtodos. Ed Panamericana 1990 Argentina. Pp 665-666

Fiorentino Gmez, Susana, Rueda Ardila, Nelly Susana y Fernanda., Gutirrez Ma. La inmunologa en el diagnstico clnico. Editorial Pontificia Universidad Javeriana.,1994. pgs. 56-69. Hernndez, Angel Gil. Tratado de Nutricin. Segunda.Ed., Editorial Mdica Panamericana, 2010. pg. 569. Vol. II.