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Cromatografa Liquida de Alto Rendimiento (HPLC)

CROMATOGRAFIA: Un proceso de separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en una mezcla. CROMATOGRAFIA DE GASES CG (Fase mvil : Gas) CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS CL (Fase mvil : Liquido) El mtodo tradicional en la CL : Ha sido mediante el empleo de columnas (de vidrio) con dimetros relativamente grandes (10 a 50 mm) que tenan longitudes de 50 a 500 cm de fase estacionaria y con tamaos de partculas que van de 150 a 200 m. Se hace pasar el lquido a travs de la columna por gravedad o por bombeo a bajas presiones DESVENTAJAS: Lenta, poco eficaz en capacidad discriminar entre solutos; as como el la cantidad que puede separar, tediosa, no se proporciona un cromatograma directamente y tener que realizar detecciones discontinuas. Adems los tiempos se separacin son largos.
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VACIO O PRESIN : Para acelerar el procedimiento, pero no fueron efectivos ya que con el incremento de la velocidad de flujo se deban aumentar la altura de platos y se disminua la eficiencia de la columna. Grandes disminuciones en la altura de los platos Tener disminuciones tambin en el tamao de la partcula de los empaques

Diferencia entre CG y CL: Es la viscosidad de la fase mvil y su capacidad para atravesar lechos empacado.

Para que CL fuera tan efectiva como la CG era necesario trabajar con presiones elevadas (500 a 5000 psi) para hacer pasar la fase mvil a travs de la fase estacionaria.
Paso de fase mvil a travs de lecho empacado con dimetros de partcula pequeos = Aumentando la eficiencia de separacin. Reduccin en tiempos de separacin y una deteccin continua.
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Cromatografa Liquida de Alta Presin o Rendimiento

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)


Esquema de un equipo:

Reservorios

Capacidad de 500 mL o ms
Disponible comercialmente Precio Pureza y Estabilidad. Disolver la muestra Miscible con otros solventes para formar mezclas tiles No degradar o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin Ser compatible con el detector utilizado Transparencia ptica (cuando se usan detectores UV)

Solventes

Desgasificar
Sonicacin Burbujear Helio Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo Desgasificacin al Vaco en Lnea

Filtrar
Filtro a la Entrada del Solvente Filtracin al Vaco Filtracin en Lnea

Extraccin gas:

Formacin de burbujas en la columna causan ensanchamiento de banda. Tanto las burbujas como el polvo interfieren con el comportamiento de los detectores.

Extraccin de polvo:

Ayuda a mantener la bomba por ms tiempo en buenas condiciones.

SISTEMA DE BOMBEO
Genere presiones superiores a 6,000 psi (lb/in2) Salidas libres de impulsos Velocidades de flujo de entre 0.1 a 10 mL/min Reproducibilidad de flujo de 0.5% relativas o mejores Resistencia a la corrosin por diversos solventes Las presiones generadas no son de peligro debido a que los lquidos son incomprensibles.
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Tipos de bombas Bomba de pistn reciprocante Cmara de 35 a 400 L. Con el movimiento del pistn se aspira el solvente. Un amplio rango de ndice de flujo son obtenibles. Produce flujos pulsantes No tiene restriccin en el tamao del reservorio ni en el tiempo de operacin.

Bomba tipo jeringa

Accionada por un tornillo Produce una impulsin no pulsante que se controla fcilmente Inconveniente , su baja capacidad 250-500 mL Bomba de presin constante
La presin del solvente es proporcional al radio del pistn Presiones de 1-10 atm de gas para generar presiones en el lquido de 1-4000 atm
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Cuando se utiliza un solo solvente para la separacin de denomina Elucin Iscratica. Pero muchas veces la eficiencia de la separacin se puede aumentar mediante una Elucin en Gradiente, esto es cuando se utilizan dos o ms solventes miscibles que difieren en su polaridad. Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se debe tener presente dos objetivos: Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible. Asegurar alta precisin y exactitud. Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir unos pasos fundamentales: Determinar la composicin inicial y final del solvente Ajustar el tiempo del gradiente Determinar la forma del gradiente (lineal, cncava o convexa) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolucin Regresar a las condiciones iniciales la columna
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SISTEMA DE INYECCIN DE LA MUESTRA

El sistema de inyeccin para HPLC debe cumplir con una serie de requerimientos: Introducir volmenes pequeos (L) y que sea reproducibles. No debe alterar las caractersticas hidrodinmicas del sistema: No interrumpir el flujo y no variar momentneamente la presin y el caudal.
Los sistemas de inyeccin pueden ser manual o automtico, tambin se pueden clasificar segn la forma de llevar a cabo la insercin de la muestra (sin y con vlvula rotatoria de inyeccin). Los sistemas sin vlvula de inyeccin comn: En la parte superior se encuentra en forma de T que contiene una gua para aguja ( de jeringa de L), y asegurar que la muestra se descargue en el centro del empaque de la columna.

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Los pasos a seguir son: Parar la bomba Retirar tapn e inyectar la muestra Se coloca de nuevo el tapn y se conecta de nuevo la bomba. No se podr inyectar directamente con jeringa a presiones mayores se 1500 psi (lb/in2).

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Los problemas que presenta este tipo de inyector son: No se puede operar a presiones levadas, pues el septum y la jeringa no lo resisten.

El septum debe remplazarse peridicamente, puede disolverse parcialmente en la fase mvil originando picos falsos, puede fragmentarse por las repetidas inyecciones y obstruir la columna.
Pueden originarse prdidas de la muestra por el fenmeno back flushing alrededor de la jeringa en el momento de la inyeccin. La reproducibilidad es baja. Existen inyectores con diseos especiales para evitar parcialmente los problemas mencionados. Por ejemplo teniendo dos vlvulas de apertura y cierre que permiten inyectar la muestra en una minicmara a presin atmosfrica y con un cambio de posicin de las vlvulas se permite el arrastre de la muestra.

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Ent. de la muestra

Salida de la muestra Circuito de la muestra

Rotor de cerrado Ent. del eluyente inyeccin Columna

Ent. del eluyente

Para inyecciones a presiones superiores a 1500 psi se utilizan inyectores con vlvulas.
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El mtodo de inyeccin con asas de muestreo es uno de los ms utilizados. Estos dispositivos permiten una seleccin del tamao de la muestra que van desde 5 a 500 L. La reproducibilidad de las inyecciones con un asa sencilla de muestreo es de unos pocos dcimos de % relativo. PRECOLUMNAS Se colocan una pequea precolumna antes de la columna analtica para as incrementar la vida de la columna analtica eliminando cualquier material en forma de partcula y contaminantes de los solventes. En cromatografa liquido-lquido, sirva para saturar la fase mvil con la fase estacionaria de tal forma que se minimicen las prdidas de esta ultima en la columna analtica.

Su tamao de partcula es mayor que la columna analtica, para minimizar la cada de presin.
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COLUMNAS PARA HPLC Se fabrican de generalmente con tubos de acero inoxidable, aunque a veces se emplean tubos de vidrio de paredes gruesas cuando se manejan bajas presiones (600 psi).

La mayora tienen longitudes de 10 a 30 cm de longitud y de dimetro interno de 4 a 10 mm. Los rellenos tienen un tamao de partcula de entre 5 y 10 m. Las columnas de este tipo suelen contener de 40,000 a 60, 000 platos/m.
La llamadas microcolumnas tienen de 3 a 7 cm de longitud y 1 mm de dimetro interno con un tamao de partcula de 3 a 5 m y conteniendo ms de 100,000 platos/m. La ventaja de las microcolumnas son su rapidez y el consumo mnimo de solvente. La interpretacin analtica mejora dramticamente cuando el dimetro de partcula es reducido, particularmente cuando la columna es operada con una velocidad ptima.
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Para cada tiempo de separacin y presin de operacin existe un dimetro optimo para el cual la cantidad de plato es mxima.

El tipo ms comn de relleno utilizado para cromatografa liquida es formado de partculas de slice, otros materiales pueden ser almina, polmeros porosos y resinas intercambiadoras de iones.

Caractersticas geomtricas e hidrodinmicas Columna. Dimetro (mm) Longitud (cm) Diam. Part. (m) Presin (atm) Caudal (mL/min)

Cromatograf Cromatografa Liquida de Alto Rendimiento (HPLC) a liquida Empacado de Microparticula Microcolumnas clsica pelcula 20-70 20-100 150 1 0.1 1-3 50-100 30-70 30-50 0.5-5 2-6 10-50 5-10 100-200 1-2 0.05X 10-1 1X10+3 5 X10-3 5-30 150-250 1X10-4 5X10 -2

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TERMOSTATO DE COLUMNA La temperatura no es una variable clave para la resolucin cromatografica de HPLC. No obstante, la temperatura afecta la solubilidad de los solutos en la fase mvil. El tiempo de retencin es el factor que resulta ms afectado, un incremento de 5-6 C puede resultar en una reduccin del 25-30% en los tiempos de retencin.

La mayora de los equipos modernos de HPLC estn equipados con calentadores de columna, que controlan las temperaturas en unas dcimas de grado (+0.3-0.5C).
Las temperaturas utilizadas van desde la cercana a la ambiental hasta cerca de los 200C si es necesario.

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1 1 2 25C 2 3 4

40C
5

3
4 5

1
2 3

10

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10

20

30

4 5

1) 2) 3)

9,10-antraquinona 2-metil-9-10-antraquinona 2-etil-9,10-antraquinona

60C

4)
5)

1,4-di metil-9,10-antraquinona
2-t-butil-9,10-antraquinona
0 5 10

Fase mvil: 45% metanol, 55% agua

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DETECTORES En HPLC no existen detectores universales como en CG. Su seleccin depende de la naturaleza de la muestra.
Detector de HPLC basado en Tipo Sensibilidad mxima (gr/mL) 2x10-10 1X10-6 1x10-11 1x10-7 1x10-8 1x10-12 Sensibilidad a la velocidad de flujo NO NO NO NO SI SI Sensibilidad a la temperatura BAJA BAJA BAJA +1X10-4C + 1 C 1.5%/C Aplicable a elucin en gradiente SI SI SI NO NO NO

Absorcin UV-V Abs. Infrarrojo Fluorescencia I. de Refraccin Conductimetra Electroqumica

S S S G S S

El tiempo de respuesta, , debe ser al menos 10 veces menor que el acho del pico de un soluto en unidades de tiempo.
< W/10 = 2tR / 5N El detector con un tiempo constante de 0.3 seg o menos es el deseado para columnas de alto rendimiento y particulas pequeas
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Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos

Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: Tipo Deflexin Tipo Fresnel
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser Segn la Fuente de Excitancin Segn el sistema ptico

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Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperomtrico Detector Conductimtrico Detector Potenciomtrico Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis reproducicbles: Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador. Usar bombas reciprocantes de doble piston Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector. Operar con el voltaje adecuado Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos. Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana. Desconectar el detector electroqumico cuando este llimpiando las columnas. Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza.

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE ALTO RENDIMIENTO Existen varios tipos de Cromatografa Liquida de Alto Rendimiento y se clasifican en : HPLC de Adsorcin HPLC de Particin HPLC de Intercambio Inico HPLC de Exclusin

ADSORCIN
El mecanismo en la cromatografa de adsorcin involucra la interaccin entre las molculas de la muestra y la fase estacionaria.
Esta interaccin es una situacin competitiva en la cual las molculas de la fase mvil y el soluto estn en competicin por los sitios de adsorcin sobre la superficie del empaque de la columna. As si los solutos tienen diferentes grados de atraccin hacia la fase estacionaria, se llevar a cabo la separacin de los compuestos.
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Los adsorbentes ms empleados son slice y alumina. El slice es ms adsorbente que la alumina. En la cromatografa de adsorcin, la nica variable que afecta el coeficiente de particin K de los analitos, es la composicin de la fase mvil. Y este efecto depende de la fuerza de elucin de la fase mvil.

Los solventes ms utilizados con el Cloroformo, el hexano y el 2propano.


Existe una correlacin positiva entre las propiedades de adsorcin y el nmero de grupos funcional ms polares en la muestra, por ejemplo en los alcoholes el grupo es el hidroxilo y en acetato y cetonas es el grupo carboxilo.

Basado en lo anterior la tendencia a ser adsorbidos decrece en este sentido : cido > Alcohol > Carbonilo > ster > Hidrocarburo
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Aplicaciones: Separacin de compuestos orgnicos insolubles en agua con pesos moleculares inferiores a 5000 Eteres, esteres, porfirinas, vitaminas.

PARTICIN
Esta se puede dividir en liquido-liquido y de fase unida qumicamente. La diferencia es solo en la forma de unin. En la primera es por adsorcin fsica, mientras que en la segunda la unin es por enlaces covalentes.
La separacin se lleva acabo porque el soluto se particiona entre dos fases lquida por su solubilidad. Por lo tanto las especies retenidas por la fase estacionaria tiene una gran afinidad por esta. Basado en la polaridad de la fase estacionaria y la fase mvil la cromatografa de particin de divide en dos cromatografa de fase normal y cromatografa de fase inversa.
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Cromatografa de fase normal la fase estacionaria es altamente polar (trietilen glicol o agua) y la fase mvil es relativamente no polar (hexano o eter isopropilico).
En cambio en la cromatografa de fase inversa la fase estacionaria ( un hidrocarburo) es no polar y la fase mvil es relativamente polar (agua, metanol o acetonitrilo) En la cromatografa de fase normal el componente menos polar es eluido primero. En contraste, en el mtodo de fase invertida, el componente ms polar se eluye primero y si se incrementa la polaridad de la fase mvil se incrementa el tiempo de retencin. La fase estacionaria slida ms usada es el cido salicilico o gel de slice.

La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes, la polaridad puede ser notablemente diferente a la del lquido estacionario de modo que ambos sean inmiscibles.

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Los solventes ms utilizados en la cromatografa de fase normal son: teres alifticos Benceno y derivados, cloroformo, agua, cido actico. Los que no se pueden usar son:

No se pueden usar en cualquier proporcin. Los que pueden interactuar qumicamente con la muestra. Si la absorcin UV o viscosidad son altas Si son txicos Si tienen alta presin de vapor Son costosos
Los solventes ms utilizados en la cromatografa de fase inversa son: metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano agua. Se puede usar tambin el mtodo de los 4 solventes para obtener un solvente con la polaridad necesaria. Se puede seguir una serie de etapas para obtener la mezcla ptima de solventes en la fase inversa.

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1 Iniciar con un solo solvente y agua. Ajustar el % de agua desde cero y aumentando, hasta que se obtenga la mejor separacin posible. As se obtiene el valor de k optima de los picos de interes. 2 Hacer mezclas con diferentes solventes y agua que tengan la misma polaridad. 3 Evaluar cada solvente para mejorar la fig. del pico o el movimiento del pico selectivo. 4 la mezcla de cualquiera de los solventes es evaluada para obtener la resolucin ptima

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41% ACN,59% Agua K=5

30% ACN,70% Agua K=10

21% MeOH, 79% Agua


K=10

11% ACN, 12% THF,77% agua K=10

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El empaques con la fase unida qumicamente:

Se preparan por reaccin de un organoclorosilano con gripos OH de slice por hidrlisis en caliente con HCl diluido.
Otros grupos funcionales unidos a la superficie pueden mencionarse aminas alifticas, esteres, nitratos y los hidrocarburos aromticos. La ventaja de esta es que es ms estable que las que estn unidas solo fsicamente. La desventaja es que la superficie tratada qumicamente tiene el defecto de su limitada capacidad de carga. Aplicaciones: Farmaceutico: antibioticos; Bioqumico: AAS, CHOS; Pdtos alimenticios: edulcorantes artificiales, Qumica forense: drogas venenos, alcohol en sangre.
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INTERCAMBIO IONICO
El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones. En esta la fase estacionaria tiene una carga inica opuesta a la de lo eluyentes. En la mayora de los casos, se utilizan las mediciones de conductividad para la deteccin de los eluyentes. Se lleva a cabo con materiales de estructura porosa e insoluble. Estos contienen grupos reactivos que estn asociados a iones capaces de intercambiarlos con el medio que los rodea. Hay dos tipos de cromatografa inica de uso comn: Basadas en supresores y de columna sencilla, difieren en el mtodo usado pasra evitar que la conductividad del elctrolito que se eluye interfiera con la medicin de la conductividad de los analitos.

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Cromatografa inica basada en supresores


Se utilizan columna supresoras de eluyente situada inmediatamente despus de la columna de intercambio inico.
la razn es que en la cromatografia de iones se necesitan elevadas concentraciones de electrolitos para eluir la mayor parte de los iones de los analitos en un tiempo razonable. En consecuencia, la conductividad de los componentes de la fase mvil tiende a enmascarar la que proviene de los iones del analito, reduciendo en gran medida la sensibilidad del detector. La columna supresora es empacada con una segunda resina intercambiadora de iones que convierten los iones del disolvente eluyente a especies moleculares de ionizacin limitada sin afectar la conductividad debida a los iones del analito.

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Para cationes: se usa HCl como eluyente y la columna supresora es una resina intercambiadora de iones en forma de hidrxido. El pdto. De la relacin entre el eluyente y el supresor es agua. (H+) + (Cl-) + resina+ (OH-) resina+ (Cl-) + H2O

Los cationes del analito no son retenidos por la segunda columna. Para aniones: El empaque de empaque del supresor es la forma cida de una resina intercambiadora de iones, y el agente de elucin es un carbonato o carbonato de sodio. La reaccin de supresor es:

(Na+) + (HCO3-) + resina+( OH-)

resina+ (Cl-) + H2CO3

El cido carbnico, muy poco disociad, no contribuye significativamente a la conductividad.

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Cromatografa de iones de columna sencilla


Este tipo de cromatografa necesita columna supresora, ya que depende de las pequeas diferencias en conductividad entre lo iones eluidos de la muestra y los iones eluyentes que permanecen. Para amplificar estas diferencias, se emplean intercambiadores de cationes de baja conductancia equivalente. Aunque es un mtodo menos sensible para la determinacin de aniones que el mtodo con la columna supresora. Los materiales ms utilizados para fase estacionaria: Resinas: se emplean en separacin de sustancias de pequeo peso molecular ya que tiene un tamao de poro ms pequeo

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Pelcula de intercambio inico

microporos

macroporos

Ncleo inerte

Resina microretricular Geles celulosa: polielectrolitos

Resina pelicular

Resinas sintticas de intercambio inico Para cationes: grupos sulfinicos (RSO3-) y sdico (Na-) cationes de Para aniones: aminas cuaternarias para aniones fuertes y aminas primarias para aniones debiles o compuestos que contienen iones cloruros u hoxidrilos. Geles o celulosas de intercambio inico

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EXCLUSIN Llamado tambin permeacin en gel, o de tamizado molecular. La separacin esta basada en el tamao molecular de las sustancias y se lleva acabo porque las molculas pueden ser atrapadas en los poros y se separan del flujo de la fase mvil. Las molculas mas grandes salen primero y las ms pequeas despus esto por su tendencia a ser absorbidas por el gel. El empaque son partculas de esfricas de slice (-10m) o vidrio. a) Poro de fase estacionaria b) Vista del dimetro del poro y las molculas que pueden entrar y las que no pueden entrar a los poros. Las verdes pueden entrar, las amarillas estn el lmite de la exclusin y las rojas son excluidas.
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Los empaque de carcter hidrofilico son para usarse en fases mviles acuosas llamada filtracin en gel; otros son hidrofobicos y se utilizan disolvente no polares y de denomina penetracin en gel. El tamao de los poros se relaciona directamente con la cantidad de disolventes adsorbido; esta a su vez es determinada por la cantidad de enlaces cruzados existentes en las molculas del polmero. Los polimeros ms utilizados son resinas comerciales: Sephadex, gel a base de de polisacarido dextrano con epiclorhidrina y la policrilamida entre cruzada con metil-bisacrilamida.

Aplicaciones : los geles de poro pequeo (Saphadex G-25 y G-50 )se usan para la separacin de molculas de bajo peso molecular de los productos naturales de alto peso molecular, til para el fraccionamiento de pptidos de tamaos intermedio.
Los geles ms porosos, se aplican en el fraccionamiento y purificacin de macromolculas como protenas, cidos nucleicos y polisacridos

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