Vacunas recombinantes

Introduccin histrica

Historia de las vacunas

Entendemos por vacuna, sustancia generalmente fabricada a partir de microorganismos patgenos para el ser vivo, que al ser administrada produce defensas frente a la enfermedad que queremos prevenir. A lo largo de la historia se ha producido un gran avance en lo que a vacunas se refiere que nos ha permitido pasar de la primera vacuna rudimentaria contra la viruela a la vacunologa reversa que est en vas de desarrollo y expansin en la actualidad.

Variolizacin

Los primeros escritos relacionados con la vacunacin (el tratamiento correcto de la viruela) se remontan al siglo XI en China, donde una monja budista realiz inoculacin antivarlica a partir de enfermos que padecan viruela. Otros textos (El espejo dorado de la medicina) tambin sitan en China hasta 4 formas diferentes de inoculacin antivarilica.

Primera vacuna

Edward Jenner (mdico britnico) invent en 1796 la primera vacuna contra la viruela. El experimento consisti en inyectar a un nio de 8 aos la vacuna procedente de una pstula del brazo de una ordeadora (sta haba sido contagiada por una vaca) a travs de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al nio ante la viruela humana.

Vacunas de Pasteur

Louis Pasteur realiz en 1881 una demostracin pblica de vacunacin inoculando bacilos atenuados de ntrax para demostrar que se podan obtener vacunas a partir de cultivos de laboratorio; esto le permiti desarrollar la vacuna contra el clera de las aves y el carbunco. En 1885 obtuvo la vacuna contra la rabia, que estaba compuesta de agentes debilitados productores de la enfermedad sacados de mdula espinal de animales rabiosos.

Vacunas de principios del XX

El siguiente paso en la evolucin fue la inactivacin qumica de toxinas. En 1909 se desarroll la vacuna contra la tuberculosis (cuestionada durante toda su historia). En 1935 se desarroll la vacuna contra la fiebre amarilla. En 1936 se desarroll la vacuna contra el virus influenza A y en 1938 contra la rickettsia.

Edad de oro de la vacunacin

A partir del impulso del cultivo celular y la capacidad de desarrollar virus humanos fuera de un organismo vivo de manera bastante sencilla y segura, se produjo el boom en vacunologa. Se obtuvieron en esta poca vacunas contra poliomielitis (1954), sarampin, paratiroiditis, rubeola y varicela.

Vacunas en los 70 y 80

En estas dcadas se introdujeron las vacunas formuladas con polisacridos capsulares o protenas purificadas, es decir las que se conocen como vacunas de subunidades. En esta poca destaca la paricin de la vacuna meningoccica, la vacuna neumoccica y la primera generacin frente a haemophilus influenzae tipo B.

Vacunas finales del XX

Avery y Goebel demostraron que la inmunogenicidad del polisacrido podra incrementarse si se uniese a una protena transportadora, de esta idea surgen las vacunas conjugadas. La primera vacuna conjugada comercializada fue contra el haemophilus influenzae tipo B.

Presente y futuro de las vacunas

En 1986 gracias al uso de la ingeniera gentica se formula la primera vacuna DNA recombinante frente a Hepatitis B. Actualmente existen diversas vacunas de este tipo en el mercado y en vas de desarrollo. En el futuro las expectativas estn focalizadas en la vacunologa reversa, es decir el hecho de que un ordenador sea capaz de elaborar la vacuna sin pipetas, ni mascarillas ni tubos de ensayo

Vacunas recombinantes

Caractersticas

Definicin

Vacunas obtenidas utilizando la tecnologa del ADN recombinante en alguna etapa de la produccin.

Bondades de una vacuna ideal

Precio competitivo. Inocuidad. Estabilidad fsica y gentica. Posible inmunizacin simultnea contra mltiples componentes protectores de diversos patgenos. Proteccin de larga duracin con 1 sola dosis VO. Induccin de inmunidad mucosal en mximo 2 semanas. Estimulacin de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistmico.

La vacuna recombinante es un rea multidisciplinaria

Inmunologa

Biologa de patgenos

Qumica Bioinformtica Nuevas vacunas

Genmica de patgenos

Protemica de patgenos

Son un plsmido bacteriano diseado para expresar un gen (o genes) de inters que codifiquen, por ejemplo, para una protena inmunognica de un patgeno determinado, contra la cual se desea inducir una respuesta inmune protectora en el individuo vacunado.
Por tanto su accin imita lo que ocurre en una infeccin por patgeno completo).

Renen en un mismo producto biolgico:

Eficacia de vacunas vivas convencionales. de vacunas inactivadas convencionales.

Seguridad

Componentes bsicos del vector que garantizan ptima expresin celular: Origen de replicacin procaritico para amplificacin y propagacin del plsmido en bacteria.

Gen marcador de seleccin de las clulas bacterianas portadoras del plsmido. Promotor eucaritico fuerte que garantiza elevados niveles de transcripcin del gen de inters en la clula eucariota. Sitio de mltiple clonaje justo despus del promotor para insertar la secuencia de inters. Secuencia de terminacin de la transcripcin y secuencia estabilizadora del ARNm transcrito.

En el proceso de obtencin de las vacunas recombinantes hemos de prestar especial atencin a 3 caractersticas:
Calidad. Seguridad. Eficacia.

Calidad

Certificar que no se han experimentado ni cambios ni mutaciones. Descripcin completa de las clulas, las bacterias o las variedades de virus y los plsmidos* con los que se comienza la construccin de la vacuna recombinante. *En caso de presentar indicios de inestabilidad sern rechazados.

Estrategia de construccin de los vectores segn lo descrito en la directiva 2001/18/EC . Caracterizar con mtodos bioqumicos, inmunolgicos y moleculares el antgeno expresado por la vacuna , para garantizar la calidad del producto obtenido.

Seguridad

Ensayos que acrediten la seguridad de la vacuna en la misma especie animal que vaya a ser la destinataria del producto (Directiva 2001/82/EC -Annexo I, ttulo II, Parte 7 -). Cerciorar que los animales vacunados no pueden trasmitir la enfermedad a los humanos o otros animales (si puede suceder, se especifica claramente en las condiciones de uso).

Acreditar que no son patognicas o lo son en un nivel insuficiente para poner en peligro la seguridad del animal vacunado.

Demostrar que la insercin de genes forneos no provoca un aumento de la virulencia ni una modificacin en el tropismo tisular.

Cumplir normativa comunitaria sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):

Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies (tanto diana como no diana). Estudio de posible transmisin horizontal y recombinacin potencial del vector vacunal o de parte de l. Estudio de especificidad de especie diana. Estudio de la posible instalacin en el ambiente. Mtodo validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo salvaje, especialmente en situaciones de planes de control y erradicacin de la enfermedad. Utilizacin de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompaado de otras secuencias.

Eficacia

Estudiar el efecto de la inmunidad preexistente al vector y/o al antgeno. Documentar la inmunorespuesta postvacunacin y considerar impacto en planes de vacunacin en vigor. En vacunas que contienen ms de un antgeno, es necesario evaluar la respuesta a cada antgeno.

TIPOS

Podemos subdividirlas en 3 subtipos:

Vacunas

que utilizan virus o bacterias como vectores. de ADN desnudo. comestibles.

Vacunas

Vacunas

VACUNAS QUE UTILIZAN VIRUS O BACTERIAS COMO VECTORES

Se incorpora un gen que codifica para una protena inmunognica en el genoma de un microorganismo atenuado que se denomina vector. El vector al replicarse en el organismo receptor, expresa los genes propios y el que produce la protena incorporada. La proteina incorporada se presenta al sistema inmune en su superficie celular. Induce respuesta inmune humoral y celular.

Los vectores ms usados son:

Virus

de famlia poxviridae. Adenovirus. Herpevirus. Influenza. Bacterias como Salmonella, Streptococcus, Staphilococcus y E-coli.

Existen riesgos asociados:

La multiplicacin viral es intracelular, por tanto una sola partcula en una sola clula puede dar lugar a millones de virus en poco tiempo. ADN viral puede integrarse en el genoma de los hospedadores de forma latente (esta integracin puede tener consecuencias no deseables).

Posibilidad de recombinacin gentica entre virus MG y otro cercano que est circulando en el receptor, que generara genotipos y fenotipos alterados.

Cambios menores en los virus pueden dar lugar a cambios drsticos en espectro de hospedador, permisividad y patogenidad.
Caractersticas especficas de los nuevos virus introducidos en el ecosistema.

Vacunas de ADN desnudo

Son plsmidos de DNA en los que se incorpora gen que expresa antgeno inmungeno del patgeno e induce inmunidad contra l. Se expresan dentro de clulas del organismo receptor y se presentan al sistema inmune en combinacin con antgenos celulares de clase I (igual que en infeccin natural).

tiles particularmente en induccin de clulas T-citotxicas, por tanto protegen ms ampliamente ante diferentes cepas virales. Presentan el antgeno con modificaciones translacionales y conformacionales nativas, por tanto estimulan anticuerpos de ptima especificidad.

Existen riesgos asociados:

Integracin potencial del plsmido en el genoma de las clulas hospedadoras. Induccin potencial de anticuerpos contra ADN del plsmido inyectado. Problema de conformacin no nativa de proteinas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales.

 Induccin

potencial de autoinmunidad.

Liberacin

accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes.

Tienden

a la inestabilidad, por tanto posibilidad de generar nuevos virus.

Existen beneficios asociados:

Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administracin. Solo expresan genes que inducen inmunidad. Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plsmido de expresin. Menor dependencia de la cadena de fro que las vacunas con protenas.

Vacunas comestibles

Se producen a partir de plantas modificadas genticamente que actan como bioreactores de antgenos de patgenos que inducen inmunidad. Administracin tan segura como el simple hecho de comer una fruta.

Su produccin puede resultar barata. Son ideales contra patgenos que causan enfermedades respiratorias, urogenitales e intestinales, donde es bsico sensibilizar el sistema inmunitario mucosal.

Se evita el problema de degradacin de protenas inmunognicas por temperatura

Existen riesgos asociados:

Posibilidad de intercambio gentico entre la planta modificada genticamente y especies silvestres asociadas.

Actualmente la ingeniera gentica controla con precisin las caractersticas que se quiere implementar en las plantas, pero no controla totalmente la localizacin de la insercin dentro del genoma de la planta hospedadora.

 La

mayora de los intentos realizados para producir antgenos de patgenos animales en plantas, han resultado ser txicas para la planta. cantidad del antgeno producido no es uniforme, por tanto la dosificacin es difcil de controlar.

La

Mecanismo de accin

Estrategias de inmunizacin

Es ventajoso combinar 2 o ms tipos de vacuna (se administra 1 o ms dosis de la 1 vacuna seguida de 1 o ms dosis de la 2). Estrategia ideal :Inmunizar primero con vacuna de ADN y despus administrar una vacuna de subunidades como recuerdo.

El resultado final de la respuesta inmune puede verse influido por:

Modo

de administracin. Dosis (nmero, tamao y frecuencia). Adyuvantes.

Modo de administracin

Mltiples rutas de inoculacin:

Intramuscular. Subcutnea. Intraperitoneal. Intradrmica. Intravenosa. Oral. Rectal. Vaginal. Intraorbital. Intratraqueal. Intranasal.

Administracin va inyeccin con aguja (parenteral) o va mtodos biolsticos con pistola de genes.
La pistola de genes garantiza una mayor eficiencia, porqu hace que ADN penetre al interior de la clula, adems tambin representa un ahorro porqu se necesitan dosis hasta 100 veces menores. La administracin parenteral es menos eficaz porqu se queda en medio intersticial (es decir desprotegida frente a nucleasas).

Dosis

El nmero de dosis afecta la respuesta inmune (generalmente, se necesita > 1 inmunizacin para obtener respuesta lo suficientemente fuerte como para ser protectora). El intervalo entre las dosis resulta crtico (al aumentarlo aumenta la respuesta inmune conferida por la vacuna). La cantidad; depende de diferentes factores: Tamao del individuo. Inmunogenicidad del antgeno utilizado. Eficiencia de transfeccin durante la administracin.

Adyuvantes

Seleccin en funcin del tipo de respuesta inmune que busquemos. Existen diferentes tipos: Adyuvantes qumicos (hidrxido de aluminio). Adyuvantes genticos (consisten en coinmunizar con un gen estimulatorio). Adyuvantes que potencian la inmunidad mucosal (toxina lbil de E.coli mutante, IL proinflamatorias,)

El MECANISMO DE ACCIN se resume en : Inmunizacin con un plsmido que contiene la informacin gentica de uno o varios genes que codifican para protenas inmunognicas de determinado patgeno. El plsmido acta como un vector permitiendo la expresin en el interior de las clulas que son transfectadas por la inmunizacin. La respuesta inmune generada (humoral o celular), ayuda a contrarrestar una infeccin con el patgeno, por tanto es una buena herramienta de profilaxis, sobre todo en las enfermedades (como las virales) que requieren ambas ramas de la respuesta inmune.

Mecanismos de presentacin antignica

Existen al menos tres que garantizan la induccin de una respuesta inmune: Estimulacin directa mediada por clulas somticas (miocitos, queratinocitos o cualquier clula MHC II negativa). Transfeccin directa de APC. Presentacin cruzada (Cross-priming), donde el plsmido transfecta una clula somtica y/o APC, y la protena secretada es captada por otra APC donde es procesada para su presentacin a linfocitos T CD8+ .

Mecanismos de respuesta inmune

Inmunidad HUMORAL frente a numerosas protenas en diversas especies. La respuesta es menor que la obtenida con virus vivo a dosis subletales y el pico de anticuerpos es ms tardo (no es desventaja, porqu al ser vacunas de ADN pueden generar respuesta de memoria).

Inmunidad CELULAR va LT CD4+ cooperadores . Si se administra va IM, el carcter proinflamatorio de los motivos CpG no metilados del ADN bacteriano induce sntesis y excrecin de IL-12 y por tanto una respuesta Th-1. Si se administra con pistola de genes, se genera una respuesta de tipo Th-2.

Inmunidad CELULAR va LT CD8+ citotxicos, es una de las principales ventajas de las vacunas de ADN porqu es difcil de inducir con las vacunas convencionales.

Inmunidad MUCOSAL, es decisiva en la proteccin contra los microorganismos invasores, ya que la mayora de patgenos veterinarios se transmiten a travs del epitelio de los tractos respiratorio, gastrointestinal y genital. Las estructuras linfoides asociadas a estas mucosas, tienen epitelio con clulas especializadas que transportan el antgeno intacto desde la membrana apical expuesta hasta la superficie basolateral donde el antgeno interacta con la APC y se inicia la estimulacin de la respuesta mediada por LT y LB.

Memoria inmunitaria

Esta respuesta depende del tipo de antgeno empleado en la vacuna. Existen varias posibilidades para explicarla : El antgeno est presente continuamente a bajos niveles (suficientes para la presentacin antignica pero por debajo del lmite de deteccin) o bien el ADN no se detecta pero el antgeno sintetizado pudiera persistir in vivo, proporcionando as un reservorio para mantener la respuesta inmune El plsmido y el antgeno sintetizado desaparecen y las respuestas observadas son antgenoindependientes. Las clulas memoria generadas por esta vacunacin son cualitativamente diferentes de las inducidas por otros tipos de vacuna.

VACUNAS COMERCIALIZADAS

Vacuno

(1997) Vacuna contra virus sincitial respiratorio bovino, a partir del gen que codifica para la protena G del virus; se ha comprobado que la vacunacin intradrmica sin aguja confiere mayor proteccin que la intramuscular o intradrmica con aguja. (1999)Vacunas contra IBR-1 (virus de rinotraqueitis infecciosa bovina 1), a partir del gen de la glicoprotena D del virus (con o sin regin transmembrana) ; protege aunque en general el ttulo de anticuerpos que se obtiene no es elevado (ni se incrementa con un aumento del nmero de dosis); adems tambin protege a terneros recin nacidos con nivel detectables de anticuerpos calostrales. (1999) Vacuna contra BVDV (virus de la diarrea viral bovina), a partir de la protena E2 del virus, clonada en un vector de ADN. Se ha demostrado que su administracin por va intramuscular en solucin salina o en liposoma, induce respuesta de anticuerpos neutralizantes y respuestas linfoproliferativas especficas a este antgeno.

Porcino

(1996) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen clonado de la glicoprotena D del virus, con la que se ha podido obtener grandes resultados en lechones de 1 da provenientes de madres no vacunadas y sin AC anti-virus de la pseudorrabia.
(1997) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen de la glicoproteina C, con la que se ha podido conseguir proteccin en animales de ms de 1 da. (2001) Vacuna contra virus de gastroenteritis transmisible, a partir del gen que codifica para la glicoprotena S, utilizando como vector el serotipo 5 de adenovirus (se obtiene respuesta inmune de AC neutralizantes a los 6-7 das post-inoculacin). (2005) Vacuna contra la PPC, a partir del gen de la glicoprotena E2 del virus, con la que se ha obtenido proteccin total frente al desafo letal (los animales desarrollaron una marcada respuesta de LT cooperadores, y una rpida elevacin de los niveles de AC neutralizantes, lo que se correlacion con la proteccin ante los sntomas clnicos y la infeccin viral ).

Aves

(1993) Vacuna contra la influenza aviar, a partir del gen de la hemaglutinina viral , donde la administracin de 2 dosis de 100 g cada una separadas 1 mes entre s, confiri proteccin ante el desafo 1-2 semanas despus de la segunda dosis. (1996) Vacuna contra la enfermedad de Newcastle, a partir del gen clonado que codifica para la protena F del virus ( con la peculiaridad que tan slo los animales vacunados con ADN lineal obtuvieron la proteccin deseada; lo cual avala el hecho de que la induccin de inmunidad mucosal en el modelo de infeccin por este virus, resulta decisiva).

Equino

(2003) Vacuna contra Influenza Equina y Ttanos , a partir de Virus canaripox recombinante Influenza A equina; se utiliza en Inmunizacin activa ( efectos visibles 14 das despus) de los caballos de > 4 meses contra la influenza equina para la reduccin de los signos clnicos y de la excrecin vrica despus de la infeccin y contra el ttanos para prevenir la mortalidad, su efecto dura 5 meses despus de la primera vacunacin y 1 ao despus de la tercera vacunacin.

Gatos y perros

(1997) Recombitek (vacuna contra moquillo canino),a partir de canarypox inocuo donde se ha implantado material gentico de vmc, con esta vacuna se ha conseguido evitar todos los problemas post-vacunales tpicos de las vacunas tradicionales. (2005)Purevax FelV (vacuna contra la leucemia felina),a partir de canaripox recombinante que expresa los genes env y gag del FeLV-A (en condiciones de campo, tan slo subgrupo A es infeccioso y la inmunizacin frente a este subgrupo induce una proteccin total contra los subgrupos A, B y C, porqu despus de la inoculacin, el virus expresa las protenas protectoras, pero sin replicarse) y consigue inducir inmunidad contra la leucemia felina.

ESTUDIOS ACTUALES

Ejemplos de empresas privadas que trabajan actualmente en el desarrollo de nuevas vacunas: Large Scale Biology corp (http://www.lsbc.com) que trabaja en vacunas personalizadas contra linfoma no-hodgkins, papilomavirus y parvovirus.

Chlorogen (http://www.chlorogen.com) que trabaja en vacunas contra clera, ntrax y peste.

Ejemplos de empresas e instituciones que actualmente estudian nuevas vacunas: Universidad de Navarra (http://www.unav.es/) que estudia vacunas en plantas va transformacin cloroplstica del tabaco. INIA (http://www.inia.es) que estudia el diseo de vacunas recombinantes mejoradas y el desarrollo de vacunas contra PPA. Fort Dodge Veterinaria S.A que estudia vacunas para prevencin de infecciones entricas y respiratorias en humanos, nueva vacuna marcadora para PPC, . CNB (http://www.cnb.uam.es) que estudia vacuna contra infecciones entricas y respiratorias en porcino, vectores vacunales basados en genoma de coronaviurs para porcino, .

Maltagen Forschung GmBH (http://www.maltagen.de) que estudia vacuna contra hepatitis ( a partir de la cebada). Biocem S.A que estudia vacuna contra la rabia a partir del maz y el tabaco. Genomine inc. (http://www.genomine.com) que estudia vacunas comestibles (veterinarias y humanas). Guardian Biotechnologies (http://www.guardianbio.com) que estudia vacunas a partir de meln coreano, tabaco, cnola y mostaza. Nexgen biotechnologies inc. (http://www.nexgenbiotech.com) que estudia vacunas veterinarias comestibles a partir de meln coreano. Dow agrosciences (http://www.dowagro.com) que estudia vacunas veterinarias a partir de maz.

Algunos de los ltimos estudios

(2005) Recombinant vaccines based on translocated effector proteins of salmonella pathogenicity island 2 (Erlangen Alemania-).

La Salmonella viva entrica atenuada es til como portadora de antgenos heterlogos para la vacunacin , la eficacia de estas fue demostrada con experimentos de vacunacin usando antgenos protectores de Lysteria Monocytogenes.

(2006) Durable HIV-1 antibody and T-cell responses elicited by an adjuvanted multiprotein recombinant vaccine in uninfected human volunteers (university of Rochester USA-). Se vacunaron intramuscularmente 48 personas no infectadas de HIV para analizar la presencia de respuestas ( AC y LT) inducidas por la vacuna y como se esperaba no se detect respuesta de clulas T CD8 HIV-especficas.

(2006) Evaluation of recombinant BCG expressing rotavirus VP6 as an anti-rotavirus vaccine (La boratorio nacional de salud de Ciudad del Cabo). BCG recombinante que expresaba el rotavirus VP6 se estudia como vacuna contra rotavirus y los resultados (se observa proteccin por tanto inmunidad celular- en ausencia del anticuerpo perceptible del anti-rotavirus en suero o heces) sugieren que el transporte de VP6 a la membrana de BCG es importante para la induccin de una inmunorespuesta protectora.

(2006) Generation and evaluation of a recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine for rabies (Instituto agrcola de investigacin veterinaria Sudafrica- ). Este estudio intenta demostrar la eficacia e inocuidad del uso de MVA (virus de Ankara modificado) recombinante con un gen de glicoproteina del virus de la rabia administrado va oral; los resultados demuestran que es inocuo y obtiene respuesta inmunolgica humoral pero si se administra perifricamente pero no se obtiene si se administra va oral.

(2007) Improved formulation of recombinant ricin A-chain vaccine increases its stability and effective antigenicity ( US Army medical research institute of infectious diseases USA-). El ricino es una toxina muy potente asociada al bioterrorismo para la cual, an no existe ninguna vacuna disponible; este estudio se basa en el prototipo de vacuna recombinante hecho a partir de cadena A de ricino y se centra en intentar incrementar su estabilidad y efectividad; se llega a la conclusin que la optimizacin de la adherencia de un antgeno de la protena al coadyuvante de aluminio puede ser de gran utilidad para alcanzar tal fin.