Métodos de estudio en

parasitología y micología
 Métodos directos
o parasitológicos
Son los que permiten visualizar
directamente parásitos u hongos en
un material patológico, o aislarlos del
mismo.

Los parásitos y hongos pueden ser vistos

estudiando el material “en fresco” o
mediante coloraciones u otros artificios.
 Métodos directos
o parasitológicos
Los materiales pueden ser tratados
previamente, para concentrar y/o
mejorar la visualización de parásitos y
hongos en ellos.

Ejemplos:
-Coproparasitario (incluye “limpieza” de la suspensión de
materias fecales y enriquecimiento por centrifugados)
-Tratamiento de expectoraciones con soluciones cáusticas
(reblandece el mucus y “aclara” las preparaciones)
 Métodos parasitológicos I

9 Examen en fresco: el material se coloca

sobre una lámina portaobjetos, montado en
algún medio líquido o no, cubierto con una
laminilla, para su observación al microscopio.

Los líquidos de montaje (solución salina fisiológica,

hidróxido de sodio o potasio 10-20%, lactofenol-azul
algodón, lugol, glicerina tamponada) facilitan la observación
microscópica evitando distorsiones de la luz, reblandeciendo
el material y/o aumentando el contraste de los objetos
buscados
Métodos parasitológicos II

9Frotis coloreados:
¾Coloraciones panópticas: May-Grunwald-Giemsa, Giemsa,
otras coloraciones hematológicas

¾Coloraciones específicas:
ƒZiehl-Neelsen, Kinyoun (ácido- alcohol resistencia)
ƒGomori, Methenamino plata (pared de los hongos)
ƒTinción Tricrómica (protozoarios entéricos, microsporidios)
ƒHematoxilina férrica (membrana, núcleos y otros
componentes de protozoarios)

9Cortes histológicos:
ƒHematoxilina-eosina
ƒPAS
ƒGomori, Giemsa, Kinyoun para cortes
Método parasitológicos III

Técnicas inmunológicas directas:

IFD – Inmunofluorescencia directa
Microscopio de

– fluorescencia
+ Parásito
fluorescente

‫٭٭٭٭‬
YYYY Conjugado:
anti-Ac y Fluoresceína

YYYY
Ac específicos ‫٭٭٭٭‬
YYYY
YYYY

Material patológico
OOO
(sin parásitos) (con parásitos)
También son métodos
parasitológicos los que
permiten poner en evidencia
componentes del parásito
(antígenos u otras moléculas,
ácidos nucleicos, etc.),
mediante diversas técnicas.
 Métodos parasitológicos IV

Técnicas moleculares:
PCR – Polymerase Chain Reaction

2- Reconocimiento de 4- Identificación del conjunto

una secuencia específica de secuencias reproducidas,
mediante un “primer” mediante electroforesis y
~
~
cromatografía
~
~ ~ ~
~~~~ ~~~~ ~
~~~~ ~
~
1- ADN 3- Multiplicación (amplificación) ~
de la secuencia específica
parasitario mediante polimerización en
cadena
 Métodos parasitológicos V

Técnicas para identificación de antígenos:

Aglutinación de Látex
Aglutinación
2- Suspensión de +
partículas de látex, (Presencia de Ag)
1- Suero de adsorbidas (cubiertas) Ag Ag
paciente, con Ac específicos
Ag Ag Ag
con Ag o no
Ag
Ag Ag Ag

Ag Ag

No Aglutinación
(Ausencia de Ag)
 Métodos parasitológicos VI

Técnicas de aislamiento por cultivo:

Medios generales Medios selectivos

-Sirven para el aislamiento
primario de una variedad de
agentes
- Pueden ser modificados con
el agregado o cambio de
algun componente para darle
mayor especificidad
ejemplos:
•Sabouraud, para hongos
•NNN, para protozoarios
hemoflagelados
-Sirven para el aislamiento
de un agente o grupo de
agentes determinados
-Tienen una formulación
muy bien definida
ejemplos:
DTM, para dermatofitos
LIT: para tripanosomas
Métodos parasitológicos VII

Técnicas de aislamiento por inoculación

de animales de experimentación:

Excepcional (aunque es necesario frente a

determinados agentes de dificil identificación o
aislamiento por otros medios; ej: Toxoplasma
gondii en líquido amniótico)

Exige seguir rigurosas normas de bioética,

bioseguridad y calidad operacional
 Métodos indirectos
inmunológicos

Son los que permiten suponer la

presencia de parásitos u hongos
infectando el organismo, mediante el
estudio de la respuesta del hospedero
(producción de Ac específicos,
reacciones de hipersensibilidad tardía,
producción de linfoquinas, etc.)
 Métodos inmunológicos I

Técnicas de precipitación en gel de agar:

DD: Doble difusión

pocillo “Arcos de precipitación”
Agar
donde se forman y
Vidrio concentran los
complejos Ag-Ac

Ag Suero
Métodos inmunológicos II
Y

Y
Técnicas de aglutinación : Y

Y
Y Y
-Aglutinación directa:
Suspensiones de parásitos enteros son enfrentadas a
sueros de pacientes. Los Ac (Y) presentes aglutinan
los parásitos, formando acúmulos consistentes.

Y
-Aglutinación de partículas

Y
Y
Y
(látex, betonita, carbón,etc.): Y

Y
Suspensiones de partículas inertes, con su superficie
cubiertas de Ag parasitarios, son enfrentadas a sueros
de pacientes. Los Ac presentes aglutinan estas
partículas, formando acúmulos consistentes
 Métodos inmunológicos III

Técnicas de aglutinación :

HAI - hemaglutinación indirecta

3a- Positivo: los GR
aglutinan por la presencia
2- Suspensión de GR de Ac en el suero. La malla
1. Suero de con su superficie de GR aglutinados impide
paciente con cubierta de Ag la sedimentación de los
Ac Ac
Ac o no parasitario Ac Ac mismos
Ac
Ac Ac Ac
3b- Negativo: los GR no
Ac Ac
aglutinan por la ausencia
de Ac en el suero y
(Los GR se comportan como partículas
inertes y no participan de la reacción Ag-Ac)
sedimentan en el fondo del
recipiente.
 Métodos inmunológicos IV

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

IFI – Inmunofluorescencia indirecta

1- Parásito o 2- suero de 3. Conjugado anti-Ig 4a. Positivo: si
corte del mismo, paciente con Ac (IgG, IgM, otras Ig) en el suero
sobre lámina o no con fluoresceína hay Ac, el
portaobjetos parásito se
Ac Ac observa verde
Ac fluorescente
Ac

Ac Ac
Ac Ac Ac Ac
Ac Ac

¾Las sustancias fluorescentes, cuando sen excitadas

por una luz de longitud de onda corta, emiten luz de
longitud de onda mayor. 4b- Negativo:
¾Pueden ser utilizadas otras sustancias fluorescentes si en el suero
(rhodamina, auramina, etc.). no hay Ac, el
¾En la técnica de Inmunoperoxidasa, la fluoresceína es parásito no
sustituída por un sustrato enzimático cromogénico que
puede ser observado en el microscopio común.
fluoresce
 Métodos inmunológicos V

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay

(y otras técnicas inmunoenzimáticas)

1. Ag parasitarios
adheridos a una base
Ac Ac AgAc Φ Ac AcAg
inerte (plásticos) Ac Ac Φ Φ Ac Ag ΦAc
Ag Φ Ag
Φ Φ
4a- Positivo:
Ag Ag Ag Ag AgAc AcAg contenido coloreado
Ac
Ac Ag Ag
Ac
Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag

2- Suero de 3- conjugado anti-Ac

paciente con con enzima y luego, Ag Ag
Ac o no sustrato cromogénico Ag Ag Ag

NOTA: La producción de color puede ser observada a 4- Negativo:

simple vista o con la ayuda de un fotocolorímetro contenido incoloro
 Métodos inmunológicos VI

Técnicas de marcado de la reacción Ag-Ac:

Quimioluminiscencia
fotómetro

1. Ag parasitarios
adheridos a una base
Ac Ac AgAc Φ Ac AcAg
inerte (plásticos) Ac Ac Φ Φ Ac Ag ΦAc
Ag Φ Ag
Φ Φ
4a- Positivo:
Ag Ag Ag Ag AgAc AcAg contenido produce
Ac
Ac Ag Ag
Ac
Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag luminiscencia
2- Suero de 3- conjugado anti-Ac
paciente con con enzima y luego, Ag Ag
Ac o no sustrato luminiscente Ag Ag Ag

NOTA: La producción de luminiscencia es observada 4- Negativo:

con la ayuda de un fotómetro o luminómetro contenido opaco
 Métodos inmunológicos VII

El desarrollo de las técnicas de marcado de la reacción Ag-

Ac, donde los valores finales puede ser leídos e
interpretados mediante la utilización de equipos electrónicos
(colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc.), ha posibilitado
la automatización de los procedimientos y el análisis
computacional de los resultados.

Esto facilita la padronización y reproducibilidad de los

procesos, mayor precisión en la lectura y registro de
resultados y una mejor cuantificación y valoración de los
mismos. La automatización de todo el procedimiento
disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.
 Métodos inmunológicos VIII

Los resultados de los estudios serológicos pueden se cualitativos

(positivos o negativos) o cuantitativos. Los resultados cuantitativos
pueden ser expresados como:

¾ Títulos: máxima dilución del suero problema que arroja un resultado

positivo (Ej: 1/16; 1/128; 1/2048)

¾ Unidades predeterminadas: cuando el valor obtenido como resultado es

comparado a un patrón predeterminado de densidad óptica, fluorescencia ,
luminiscencia o concentración conocida de Ac específicos, que expresa el
“punto de corte” de la técnica (cutoff o valor límite que diferencia positivos
y negativos) (Ej: UI/ml; Index Value; MIU/ml; OD; etc.)
 Métodos inmunológicos IX

Los títulos o valores límites de cada técnica, son determinados con

base en el comportamiento de las mismas frente a grandes conjuntos
de sueros que expresan positividad, negatividad o resultados dudosos
en la reacción.

Dos grandes conceptos definen el comportamiento de las técnicas

serológicas: Sensibilidad y Especificidad

Desde el punto de vista inmunológico o experimental, la sensibilidad

expresa la capacidad de la técnica para detectar las menores
concentraciones posibles de los anticuerpos (o antígenos) buscados.

La especificidad expresa la capacidad de esa técnica para diferenciar

los anticuerpos específicos (o antígenos) buscados de otros presentes
en el material en estudio.
 Métodos inmunológicos X

Respecto al comportamiento de las técnicas cuando son utilizadas en poblaciones humanas,

la sensibilidad expresa la capacidad de la misma para diagnosticar casos positivos en el
conjunto de personas estudiadas (expresión de índole cuantitativa).
La especificidad expresa, por su parte, la capacidad de determinar resultados verdaderos
(expresión de ídole cualitativa).
El comportamiento de una técnica en una población determinada, está signada no sólo por la
presencia del fenómeno investigado (presencia de determinado agente o de la enfermedad
producida por el mismo) sino también por otros fenómenos biológicos que pueden interferir
en el procedimiento y en la interpretación de los resultados:

Fenómeno Presencia de otros agentes

investigado que estimulan la formación
de Ac específicos e
inespecíficos que pueden
interferir con la técnica en
cuestión
Ac naturales, reaginas
factor reumatoideo y
otras moléculas de
acción inespecífica
 Métodos de estudio

Cuidados particulares en cada una de las etapas de

un estudio paraclínico

Etapa preanalítica: registro de datos, recolección, preparación y

conservación de la muestra...

Etapa analítica: manejo de la muestra, bioseguridad, calidad

operacional, control de calidad interno y externo...

Etapa postanalítica: registro, interpretación y validación de los

resultados, expresión de los resultados, expresión de los
valores de referencia...