ANLISIS DE TODOS LOS PASOS SEGUIDOS EN LA ACTIVIDAD PRCTICA 6, Y TERMINOLOGA BSICA USADA La OXIDACIN en los sistemas biolgicos es una

deshidrogenacin, es decir, la prdida de un tomo de hidrgeno (H), o lo que es equivalente a la prdida de un protn (H+) y su electrn (e-) correspondiente; o la ganancia de oxgeno. La enzima que cataliza la oxidacin de una molcula debe presentar una coenzima de xido-reduccin como por ejemplo NAD+, capaz de aceptar los hidrgenos. La REDUCCIN en los sistemas biolgicos es una hidrogenacin, es decir, la ganancia de un tomo de hidrgeno, lo que es equivalente a la ganancia de un protn (H+) ms su electrn (e-) correspondiente, o la prdida de oxgeno. La enzima que cataliza la reduccin de una molcula debe presentar una coenzima reducida como por ejemplo NADH, capaz de ceder hidrgenos. La oxidacin y la reduccin siempre ocurren simultneamente porque los electrones que pierden un tomo o molcula oxidados son aceptados por otro tomo o molcula que se ha reducido en el proceso. PROCESO DE TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA FOTOSINTESIS

Transporte de electrones

Los electrones son transportados a lo largo de una cadena de aceptores de electrones en las membranas tilacoidales; los Electrones, NADP+, electrones , reducen el H2. NADP+, la divisin del agua genera H+, que se acumulan dentro de los tilacoides.

NADPH + H+ + O2; H+

CLOROPLASTOS Los cloroplastos son caractersticos en vegetales y en algunas algas unicelulares. Estn rodeados por una membrana doble: la externa que presenta plegamientos o crestas y es muy permeable, y la interna lisa, es decir sin crestas, menos permeable que la externa y con numerosas protenas especializadas en el transporte selectivo de sustancias.

La membrana interna contiene un semifluido denominado estroma compuesto de enzimas, ADN y ribosomas. Dentro del estroma se localizan unos sculos aplanados y membranosos, a los cuales en forma individual se les llama tilacoides y contienen el pigmento verde o clorofila, as como otros pigmentos. Los tilacoides tienden a formar apilamientos denominados grana, los cuales se conectan entre s formando una red de cavidades. Los cloroplastos tienen como funcin realizar la fotosntesis. AMORTIGUADOR O TAMPON Elemento de un sistema qumico cido-base, mediante el cual se regula el grado de pH. Elemento que sustrae la energa de un sistema generalmente vibrante, con el fin de suprimir el efecto original. La solucin aislante con hielo (NaCl 0,35 y Fosfato 0,04M pH 608) tiene como funcin la lisis o ruptura celular. En el cloroplasto ocurre un proceso endotrmico: la utilizacin de la energa de la luz para fabricar hidratos de carbono que conocemos como fotosntesis, y que con fines didcticos se divide arbitrariamente en dos grupos de reacciones denominadas reacciones fotodependientes (fase luminosa), que ocurre en los tilacoides y en las que se absorbe energa luminosa por parte de la clorofila y otros pigmentos, conservndola en forma de energa qumica en la molcula de ATP y poder reductor en forma de NADPH y reacciones fotoindependentes (fase oscura), en la que a partir de la energa y poder reductor formado previamente se reduce a glucosa. El ATP y NADPH producidos durante la fotosntesis tambin pueden ser utilizados para la sntesis de otros compuestos orgnicos. Una clula vegetal tpica contiene diferentes tipos de orgnulos y molculas, luego el estudio de la funcin o de las caractersticas de un componente especfico debe normalmente comenzar por un proceso de purificacin. El primer paso es normalmente la lisis, o la ruptura traumtica, de las clulas pero siendo lo suficientemente suaves como para liberar el orgnulo o molcula deseada intacta. Esto puede hacerse mecnica, qumicamente o usando agentes biolgicos. La lisis celular se hace normalmente en la presencia de un tampn biolgico de apropiado potencial osmtico y pH (como el NaCl 0,35M y Fosfato 0,04M a pH 4.6 grados usados en la experiencia), a menudo se aaden inhibidores de proteasas y el procedimiento general se realiza a temperaturas bajas (aprox. 4 C) con el propsito de demorar la degradacin de los componentes celulares. El aislamiento de los cloroplastos

se lleva a cabo en condiciones de luz dbil para minimizar la fotodestruccin de la clorofila. Una vez lisadas las clulas vegetales hace falta separar los componentes celulares o moleculares que se precise. Existen diversidad de tcnicas que permiten la separacin: centrifugacin, dilisis, decantacin, cromatografa y electroforesis. Normalmente se utiliza una combinacin de varios mtodos para retirar el material no deseado. El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioqumica y fisiologa de organelos fuera del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos del tejido de plantas por el mtodo de fraccionamiento celular. HOMOGENIZACIN Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionacin, todas las soluciones y cristalera deben mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llama homogenado. En esta prctica los cloroplastos se aislarn de la espinaca. CENTRIFUGACION Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje de rotacin. CENTRIFUGACION DIFERENCIAL En la centrifugacin diferencial. Los cloroplastos de las clulas de espinaca se aislarn utilizando el mtodo modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). Despus que el tejido de la planta se macera en un mortero. La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentndolo progresivamente en pequeas partculas. Luego del filtrado (a travs de una gaza para remover los pedazos grandes de tejidos) se produce la primera centrifugacin, la cual es a 1000 rpm por 2 minutos, el cual cimienta restos celulares. Este pellet contiene clulas intactas; luego es transferido a otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 4000 rpm por 5 minutos en una centrfuga refrigerada (4 grados centgrados), donde se preparan los fragmentos de cloroplastos. La centrfuga permite aislar y purificar los cloroplastos enteros.

Relacin de los dos tubos con respecto al reactivo 2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP) Con el reactivo 2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP) es posible demostrar y caracterizar la relacin de electrones con la reaccin lumnica de fotosntesis. El NADP+, receptor natural final de la cadena transportadora de electrones, toma dos electrones y dos protones y es reducido a NADPH + H+. La reduccin de este reactivo (indicador de la presencia de clorofila) se exterioriza como un cambio de color de la solucin, que en la luz se torna como un color verde oscuro, que indica claramente la presencia de cloroplastos debido a la excitacin de la clorofila A por la presencia de la luz solar (en el tubo expuesto a la luz); hay, por tanto, estimulacin del flujo de electrones, acelerndose la reaccin (liberacin de oxigeno). Por otro lado en el tubo expuesto a la oscuridad, no hubo tonalidad oscura verdosa (o muy poca), debido a que no hay presencia de luz solar, ni produccin fotosinttica lgicamente (tampoco liberacin de oxigeno). FLUJO ELECTRONICO NORMAL EN LAS PLANTAS La fotosntesis es un proceso que se desarrolla en dos etapas: reacciones lumnicas: es un proceso dependiente de la luz (etapa clara), requiere de energa de la luz para fabricar ATP y molculas portadoras de energa NADPH reducido, a usarse en la segunda etapa. Ciclo de Calvin- Benson: es la etapa independiente de la luz (etapa oscura), los productos de la primera etapa mas CO2 son utilizados para formar los enlaces C-C de los carbohidratos. Las reacciones de la etapa oscura usualmente ocurren en la oscuridad si los transportadores de energa provenientes de la etapa clara estn presentes. Evidencias recientes sugieren que la enzima ms importante de la etapa oscura esta estimulada indirectamente por la luz, de ser as el termino no sera correcto denominarla "etapa oscura". La etapa clara ocurre en la grana y la oscura en el estroma de los cloroplastos, En la etapa clara la luz que "golpea" a la clorofila excita a un electrn a un nivel energtico superior. En una serie de reacciones la energa se convierte (a lo largo de un proceso de transporte de electrones) en ATP y NADPH. El agua se descompone en el proceso liberando oxgeno como producto secundario de la reaccin. El ATP y el NADPH se utilizan para fabricar los enlaces C-C en la etapa oscura. Los fotosistemas son los conjuntos de molculas de clorofila y otros pigmentos empaquetados en los tilacoides. En el "corazn" del fotosistema se encuentra la clorofila que absorbe la luz para convertirse en una forma "activada". La energa contenida en esta clorofila activada se utiliza para hacer funcionar la maquinaria qumica de la cual depende gran parte de la vida.

Muchos procariotas tienen un solo fotosistema: el fotosistema II (si bien fue el primero en la evolucin, fue el segundo en descubrirse, de all el II). Los eucariotas usan el fotosistema II ms el fotosistema I. El fotosistema I usa la clorofila a en una forma denominada P700. El Fotosistema II usa una forma de clorofila conocida como P680. Ambas formas "activas" de la clorofila a funcionan en la fotosntesis debido a su relacin con las protenas de la membrana tilacoide. La fotofosforilacin es el proceso de conversin de la energa del electrn excitado por la luz, en un enlace pirofosfato de una molcula de ADP. Esto ocurre cuando los electrones del agua son excitados por la luz en presencia de P680. La transferencia de energa es similar al transporte quimiosmtico de electrones que ocurre en la mitocondria. La energa de la luz causa la eliminacin de un electrn de una molcula de P680 que es parte del Fotosistema II, el electrn es transferido a una molcula aceptora (aceptor primario), y pasa luego cuesta abajo al Fotosistema I a travs de una cadena transportadora de electrones. La P680 requiere un electrn que es tomado del agua rompindola en iones H+ y iones O-2. Estos iones O-2 se combinan para formar O2 que se libera a la atmsfera. La luz acta sobre la molcula de P700 del Fotosistema I, produciendo que un electrn sea elevado a un potencial mas alto. Este electrn es aceptado por un aceptor primario (diferente del asociado al Fotosistema II). El electrn pasa nuevamente por una serie de reacciones redox, y finalmente se combina con NADP+ e H+ para formar NADPH, un portador de H necesario en la fase independiente de la luz. Electrn del fotosistema II reemplaza al electrn excitado de la molcula P700. Existe por lo tanto un continuo flujo de electrones (no cclico) desde el agua al NADPH, el cual es usado para la fijacin del carbono. El flujo cclico de electrones ocurre en algunos eucariotas y en bacterias fotosintticas. No se produce NADPH, solo ATP. Esto tambin ocurre cuando la clula requiere ATP adicional, o cuando no hay NADP+ para reducirlo a NADPH. En el Fotosistema II, el "bombeo" de iones H hacia adentro de los tilacoides (desde el estroma del cloroplasto) y la conversin de ADP + P en ATP es motorizado por un gradiente de electrones establecido en la membrana tilacoidea.

REFERENCIAS CONSULTADAS Nutricin vegetal, http://www.ediho.es/horticom/tem_aut/nutric.html Dificultades http://platea.pntic.mec.es/~cpalacio/DIFICULTADES.html Fotosntesis http://www.arrakis.es/~lluengo/fotosintesis.html http://www.eduvinet.de/mallig/bio/Repetito/Bfotsys.html http://www.fortunecity.com/victorian/rodin/667/biologia/importan.html http://www.whfreeman.com/LIFE5/CH08/c08_a01_fs.html Devlin, R. M. 1980. Fisiologa Vegetal. Barcelona. Espaa. Omega. P.p: 517