APNDICE A - FRACIONAMENTO DO FSFORO DO SOLO (Hedley et al., 1982 com modificaes de Condron et al.

, 1985) SOLUES: NaHCO3 0,5 mol l-1 Pesar 42,00 g de NaHCO3 para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Ajustar o pH a 8,5 com o uso de NaOH ou HCl. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. Preparar a soluo imediatamente antes do uso. NaCl 0,5 mol l-1 Pesar 29,25 g de NaCl para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. NaOH 0,1 mol l-1 Pesar 4,00 g de NaOH para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. HCl 1 mol l-1 Adicionar 84 ml de HCl conc. em Becker de 1000 ml contendo 700 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. NaOH 0,5 mol l-1 Pesar 20,00 g de NaOH para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. PROCEDIMENTO: a) pesar 0,5 gramas de solo para tubo de centrfuga com tampa rosca; b) adicionar 10 ml de gua destilada; c) adicionar 1 lamina de RTA preparada segundo apndice B; d) agitar por 16 horas no "end-over-end" (rotao de 33 rpm); e) retirar a RTA do tubo com auxlio de uma pina; f) lavar o excesso de solo da RTA com jato d'agua (pisceta); g) colocar a RTA em recipiente com tampa contendo 15 ml de HCl 0,5 mol l-1 h) deixar em repouso por 90 min (com a tampa aberta); i) agitar por 30 min em agitador horizontal; j) retirar a RTA com auxlio de pina e recuper-la conforme Apndice B; k) centrifugar o solo + gua 6000 rpm por 15 min e descartar o sobrenadante; l) determinar Pi no extrato de HCl 0,5 mol l-1 (Apndice C); m) adicionar 10 ml de NaHCO3 0,5 mol l-1; n) agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; o) agitar por 16 horas no "end-over-end"; p) centrifugar 6000 rpm por 15 min; q) reservar o sobrenadante para anlise de Pi (apndice D) e Pt (Apndice E); r) adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol l-1 com cuidado para no mexer o solo; s) centrifugar 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato; t) adicionar 10 ml de NaOH 0,1 mol l-1; u) agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; v) agitar por 16 horas no "end-over-end"; w) centrifugar 6000 rpm por 15 min;

x) reservar o sobrenadante para anlise de Pi (apndice D) e Pt (Apndice E); y) adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol l-1 com cuidado para no mexer o solo; z) centrifugar 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato anterior; aa) adicionar 10 ml de HCl 1,0 mol l1; bb agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; cc) agitar por 16 horas no "end-over-end"; dd) centrifugar 6000 rpm por 15 min; ee) reservar o sobrenadante para anlise de Pi (Apndice C); ff) adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol l-1 com cuidado para no mexer o solo; gg) centrifugar 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato anterior; hh) adicionar 10 ml de NaOH 0,5 mol l-1; ii) agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; jj) agitar por 16 horas no "end-over-end"; kk) centrifugar 6000 rpm por 15 min; ll) reservar o sobrenadante para anlise de Pi (apndice D) e Pt (Apndice E); mm adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol l-1 com cuidado para no mexer o solo; nn) centrifugar 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato anterior; oo) secar o solo em estufa 50o C e digerir o solo conforme apendice F. 216

APENDICE C: DETERMINAO DE FSFORO EM EXTRATOS CIDOS DO SOLO (Murphy & Riley, 1977) SOLUES: Soluo A: dissolver 15,35 g de (NH4)Mo7O24.4 H2O com 200 ml de H2O destilada em Becker de 500 ml. Dissolver 0,3511 g de K(SbO)C4O6. H2O com 100 ml de H2O destilada em Becker de 200 ml. Colocar 300 ml de H2O destilada em becker de 1000 ml e adicionar lentamente 178 ml de cido sulfrico concentrado. Aps esfriar, transferir para balo volumtrico de 1000 ml, adicionar as solues de molibdato de amnio e antimoniato de potssio e ajustar o volume com H2O destilada. Soluo B: dissolver 1,356 g C6H8O6 (cido ascrbico) com 100 ml de soluo A em balo volumtrico. Esta soluo deve ser preparada no momento do uso. NaOH 10 mol l-1: dissolver 400 g de NaOH em 600 ml de H2O destilada em Becker de 1000 ml. Aps esfriar, transferir para balo volumtrico de 1000 ml e ajustar o volume com H2O destilada. Armazenar em frasco plstico. p-nitrofenol 0,25%: pesar 0,25 g de p-nitrofenol e dissolver em 100 ml de H2O destilada em balo volumtrico. Armazenar em geladeira em frasco escuro. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) pipetar uma alquota do extrato para copo de cafezinho; b) adicionar H2O destilada para atingir volume de 3 ml; c) adicionar uma gota de p-nitrofenol 0,25%; d) neutralizar a soluo com NaOH 10 mol l-1; e) adicionar 0,5 ml de soluo B; f) ler a absorbncia em 882 nm aps 30 minutos.

APENDICE D: DETERMINAO DE FSFORO INORGNICO EM EXTRATOS ALCALINOS DO SOLO (Dick & Tabatabai, 1977) SOLUES: Soluo A: dissolver 8,80 g de C6H8O6 (cido ascrbico) e 41,00 g de cido tricloroactico com 400 ml de H2O destilada em Becker de 500 ml. Transferir para balo volumtrico de 500 ml e ajustar o volume com H2O destilada. Esta soluo deve ser preparada no momento do uso. Soluo B: dissolver 6,20 g de (NH4)Mo7O24.4 H2O com 400 ml de H2O destilada em Becker de 500 ml. Transferir para balo volumtrico de 500 ml e ajustar o volume com H2O destilada. Soluo C: dissolver 29,40 g de citrato de sdio e 26,00 g de arsenito de sdio com 800 ml de H2O destilada em Becker de 1000 ml. Adicionar 50 ml de cido actico glacial (99%).Transferir para balo volumtrico de 1000 ml e ajustar o volume com H2O destilada. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) adicionar 5 ml de soluo A em copo de cafezinho; b) adicionar imediatamente uma alquota de extrato alcalino; c) adicionar imediatamente 1 ml de soluo B; d) adicionar imediatamente 2,5 ml de soluo C; e) completar o volume at 12,5 ml; f) ler a absorbncia no fotocolormetro em 700 nm aps 15 minutos. APENDICE E: DIGESTO DOS EXTRATOS ALCALINOS DO SOLO (extrados com NaOH e NaHCO3) PARA ANLISE DO FSFORO TOTAL (USEPA, 1971) SOLUES: H2SO4 1:1: Adicionar, vagarozamente, 500 ml de H2SO4 conc. em 500 ml de H2O destilada. Esperar esfriar, transferir para balo volumtrico de 1000 ml e completar o volume com H2O destilada. Persulfato de amnio 7,5% (m/v): Dissolver 75 g de persulfato de amnia (Merck) em em 800 ml de H2O destilada. Transferir para balo volumtrico de 1000 ml e completar o volume com H2O destilada. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) Pipetar uma alquota do extrato alcalino para solo em tubo de digesto; b) adicionar 10 ml de persulfato de amnio 7,5%; c) adicionar 1 ml de H2SO4 1:1; d) cobrir o tubo com papel alumnio; e) colocar os tubos em recepiente maior e cobri-lo com papel alumnio; f) autoclavar 121o C e 103 kPa por 2 horas; g) deixar esfriar e completar o volume 20 ml. h) Determinar fsforo conforme apndice C APENDICE F: DIGESTO DO RESDUO DO SOLO PARA ANLISE DO FSFORO TOTAL (Brookes & Powlson, 1982) SOLUES:

Soluo MgCl2 saturado: adicionar MgCl2 em H2O destilada at a saturao da soluo. H2SO4 concentrado. H2O2 concentrado. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) pesar 0,10 g de solo em tubo de digesto; b) adicionar 1 ml de MgCl2 saturado; c) adicionar 1 ml de H2SO4 conc.; d) colocar funil de refluxo no tubo de digesto; e) aquecer por 1 hora no bloco digestor 200o C; f) deixar esfriar e adicionar 2 ml de H2O2 conc.; g) aquecer por 1 hora no bloco digestor 100oC; h) deixar esfriar e completar o volume 50 ml. i) Determinar fsforo conforme apendice C. APENDICE G: FSFORO ORGNICO TOTAL (Olsen & Sommers, 1982) SOLUES: Soluo H2SO4 0,5 mol l-1 Adicionar, vagarosamente, 27,75 ml de H2SO4 concentrado em um Becker de 1000 ml contendo 700 ml de gua destilada. Aps frio, transferir para balo volumtrico de 1000 ml e completar o volume. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) pesar 1 g de solo em duplicata: Conjunto A para cadinho de porcelana e o Conjunto B para snap-cap de 100 ml; b) levar o Conjunto A para mufla e ignificar a 550o C por 2 horas (elevar a temperatura gradualmente); c) transferir o solo ignificado para snap-cap de 100 ml e adicionar 50 ml de H2SO4 0,5 mol l-1; d) adicionar 50 ml de H2SO4 0,5 mol l-1 ao Conjunto B; e) agitar os conjuntos A e B por 2 horas em agitador horizontal; f) centrifugar o sobrenadante a 6000 rpm por 10 minutos; g) Determinar fsforo conforme apendice C. Obs: Fsforo orgnico total = P ignificado P no ignificado

APENDICE H: FSFORO TOTAL (modificado de Olsen & Sommers, 1982)

SOLUES: Soluo MgCl2 saturado: adicionar MgCl2 em H2O destilada at a saturao da soluo. H2SO4 concentrado. H2O2 concentrado. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) pesar 0,05 g de solo para tubo de digesto; b) adicionar 1 ml de MgCl2 saturado; c) adicionar 7,5 ml de H2SO4 conc.; d) aquecer por 1,5 horas no bloco digestor 200o C; e) deixar esfriar e adicionar 3 ml de H2O2 conc.; f) aquecer por 1 hora no bloco digestor 100 oC; g) deixar esfriar e tranferir para balo de 100 ml e completar o volume; h) Determinar fsforo conforme apendice C. APENDICE K: FSFORO POR NaOH 0,1 mol l-1 (adaptado de Hedley et al., 1982) SOLUES: NaOH 0,1 mol l-1 Pesar 4,00 g de NaOH para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. NaCl 0,5 mol l-1 Pesar 29,25 g de NaCl para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) Pesar 0,5 g de solo para tubo de centrfuga com tampa rosca; b) adicionar 10 ml de NaOH 0,1 mol l-1; c) agitar manualmente para soltar o solo do fundo do tubo; d) agitar por 16 horas no "end-over-end"; e) centrifugar 6000 rpm por 15 min; f) reservar o sobrenadante para anlise; g) adicionar 10 ml de NaCl 0,5 mol l-1 com cuidado para no mexer o solo; h) centrifugar 6000 rpm por 5 min e adicionar o sobrenadante ao extrato anterior; i) Determinar fsforo inorgnico segundo o Apndice D.

APENDICE L: FSFORO NA BIOMASSA MICROBIANA (Hedley & Stewart, 1982; Brookes et al., 1982; Morel et al., 1996)

SOLUES: NaHCO3 0,5 mol l-1 Pesar 42,00 g de NaHCO3 para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Ajustar o pH a 8,5 com o uso de NaOH ou HCl. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. Preparar a soluo imediatamente antes do uso. NaHCO3 0,5 mol l-1 + 50 mg l-1 de P: Pesar 42,00 g de NaHCO3 para Becker de 1000 ml e adicionar 900 ml de H2O dest. Adicionar 50 ml de uma soluo estoque de 1000 mg l -1 de P. Ajustar o pH a 8,5 com o uso de NaOH ou HCl. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. Preparar a soluo imediatamente antes do uso. HCl 0,5 mol l-1 Adicionar 42 ml de HCl conc. em Becker de 1000 ml contendo 700 ml de H2O dest. Transferir para balo de 1000 ml e completar o volume. CHCl3 concentrado. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) Incubar o solo com umidade equivalente a 80% da CC por 30 dias temperatura ambiente b) pesar 0,5 gramas de solo mido, em triplicata (conjuntos a, b, c), para tubo de centrfuga com tampa rosca; c) adicionar 10 ml de gua destilada; d) adicionar 1 lamina de RTA preparada segundo apndice B; e) agitar por 16 horas no "end-over-end" (rotao de 33 rpm); f) retirar a RTA do tubo com auxlio de uma pina (pode-se medir o Pi analogamente ao apndice A.; j) centrifugar o tubo a 6000 rpm por 15 minutos e descartar o sobrenadante; k) no conjunto A, adicionar 0,5 ml de CHCl3 conc. e nos conjuntos B e C 0,5 ml de H2O dest.; l) deixar o solo em repouso por 24 horas; m) Nos conjuntos A e B adicionar 10 ml de NaHCO3 0,5 mol l-1 e no conjunto C 10 ml de NaHCO3 0,5 mol l-1 + 50 mg l-1 de P; n) agitar por 16 horas no nd-over-end"' o) centrifugar 6000 rpm por 15 min e reservar o sobrenadante para anlise; p) determinar o Pi segundo o Apndic D. P mic = 50*(Pa - Pb) / 0,40*(Pc - Pb)

APENDICE N: ATIVIDADE DE FOSFATASES CIDAS (Tabatabai & Bremner, 1969) SOLUES:

MUB pH 6,5: Em um Becker de 1000 ml, adicionar 12,1 g de TRIS, 11,6 g de cido maleico, 14 g de cido ctrico e 6,3 g de cido brico. Adicionar 500 ml de NaOH 1 mol l1 e ajustar o pH para 6,5 com HCl. Tranferir para balo volumtrico de 1000 ml e ajustar o volume com gua destilada. p-nitrofenyl fosfato: Adicionar 1,927 g de p-nitrofenyl fosfato disdico tetrahidratado em um balo volumtrico de 50 ml e completar o volume com MUB (preparar no momento do uso). CaCl2 0,5 mol l-1 Pesar 55,5 g de cloreto de clcio, transferir para balo de 1000 ml e completar o volume com gua destilada. NaOH 0,5 mol l-1 Pesar 20,00 g de NaOH, transferir para balo de 1000 ml e completar o volume com gua destilada. Tolueno. PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) Incubar o solo com umidade equivalente a 80% da CC por 30 dias temperatura ambiente b) pesar 1 g de solo mido para erlenmeyers de 50 ml com rolha de silicone; c) em capela de exausto, adicionar 1 ml da soluo de p-nitrofenyl fosfato + 4 ml de MUB + 0,25 ml de tolueno e tampar o erlenmeyer; c) incubar por 1 hora a 37oC no escuro; d) adicionar 1 ml de CaCl2 0,5 mol l-1 + 4 ml de NaOH 0,5 mol l-1 e agitar manualmente; e) filtrar com Whattman 2v; f) ler a absorbncia no fotocolormetro em 400 nm. Para regulagem do aparelho, construir uma curva utilizando p-nitrofenol (para sntese), e submete-la aos passos "c" a "f", exceto a adio de p-nitrofenyl-fosfato. p-nitrofenol (g g-1 solo seco h-1) = C*V/Ss*Su*t onde, C = concentrao de p-nitrofenol (g ml-1 filtrado); V = volume da suspenso (em ml); Ss = quantidade de solo seco incubada; Su = quantidade de solo mido utilizada (1 g); t = tempo de incubao (1 hora).

APENDICE O: ANLISE DE RESSONNCIA NUCLEAR MAGNTICA DE 31P (Rheinheimer, 2002) SOLUES: NaOH 0,5 mol l-1 + EDTA 0,1 mol l-1

Pesar 37,22 g de Na-EDTA e 20,00 g de NaOH e diluir a 1000 ml em balo volumtrico. gua deuterada (D2O). PROCEDIMENTO DE ANLISE: a) Pesar 1 g de solo, com nove repeties, e colocar em tubos de centrfuga com tampa rosca; b) Realizar a extrao do fsforo inorgnico com RTA segundo Apndice A (passos "a"a "l"); c) adicionar 10 ml de NaOH 0,5 mol l-1 + EDTA 0,1 mol -1; d) agitar por 16 horas no "end-over-end" (rotao de 33 rpm); e) centrifugar o tubo a 6000 rpm por 15 minutos e recolher o sobrenadante das nove repeties em um snap-cap de 100 ml; f) agitar por 6 horas no end-over-end dicionar ao snap-cap 5 cm3 de resina Chelex-100 saturada com cloro; g) agitar por 6 horas no "end-over-end" (rotao de 33 rpm); h) filtrar em Whattman 42, recuperar a resina, transferir o filtrado para becker de 100 ml e congel-lo; i) liofilizar o extrato congelado at secagem completa (16 24 horas); j) recuperar o extrato liofilizado para tubo de centrfuga com tampa rosca e adicionar 3 ml de NaOH 0,5 mol l-1 + EDTA 0,1 mol l-1 e 0,5 ml de D2O; k) deixar em repouso por 2 horas; l) agitar por 5 min em vortex, centrifugar e recolher o sobrenadante para tubos de RNM; m) realizar a leitura no espectrmetro de RNM. 2