PROLOGO La presente Gua de Prcticas para el Laboratorio de Biologa Celular contempla experimentos y actividades debidamente organizados de acuerdo al programa

establecido; que permitir al estudiante vincular los aspectos estudiados en teora con actividades prcticas mediante la realizacin de proyectos comunes. Cabe mencionar que esta gua de Laboratorio de Biologa Celular tuvo un antecedente muy importante, ya que en el plan rgido tambin hubo un manual de laboratorio para esta materia, pero debido a que el plan de estudios de la Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica en el ao 2002 fue reestructurado por consiguiente tuvo que ser modificado el contenido de esta experiencia educativa y por lo tanto, las practicas de laboratorio en su mayora cambiaron. Por otra parte, la Biologa Celular es una ciencia bien fundamentada, reconocida como disciplina despus de establecerse la teora celular; dotada de instrumentos de anlisis cada vez ms poderosos para explorar los procesos internos de la clula. Su objetivo inicial fue describir con mxima precisin todas las estructuras caractersticas de las clulas animales y vegetales y de los seres unicelulares, las modificaciones en el curso de la vida de las clulas, su diversidad dentro de estos seres o a lo largo del desarrollo embrionario, etc. La Biologa Celular, se coloc con prontitud dentro de los campos ms importantes de la biologa y constituy un foco de convergencia y fundamento de todos los mtodos; slo el estudio de las propiedades de las clulas individuales permitira comprender el funcionamiento y la constitucin de las estructuras pluricelulares. De ser una ciencia descriptiva, la biologa celular se transform en ciencia experimental con el objetivo esencial de mejorar la comprensin de las estructuras y de los mecanismos a nivel molecular. Actualmente sus principales metas de estudio son: el trfico membranario en el interior de las clulas, el citoesqueleto, la biognesis de los organelos llamados semiautnomos, las funciones de las matrices extracelulares y la sealizacin de la membrana. Por ser una ciencia integrativa y multidisciplinaria, la biologa celular suprime las fronteras artificiales entre diversos mtodos y aporta una visin ms completa de las estructuras y de las funciones celulares; identifica a las molculas constitutivas de los organelos, ubica las enzimas en compartimientos, estudia las relaciones fisiolgicas entre ellas y mide los flujos metablicos y energticos en las condiciones fsico-qumicas que se encuentran in vivo. Los experimentos que aqu se incluyen estn diseados para realizarse con el equipo de laboratorio con el que cuenta nuestra facultad, la metodologa incluida est centrada en el desarrollo de habilidades de ejecucin y de razonamiento que permitan al alumno tener un buen desempeo en un laboratorio de biologa celular; fomentando as, tanto el trabajo individual como colectivo.

Cada prctica incluye una breve revisin terica, sin la intencin de suplir los libros de texto, que contienen informacin ms detallada. En la evaluacin del aprendizaje se consideran la realizacin de prcticas, participacin, entrega de reportes escritos y exmenes tericos. Adems, sta gua de prcticas para el laboratorio de biologa celular incluye un glosario de trminos para que el alumno alcance una mayor comprensin en su aprendizaje.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 01 USO Y CUIDADO DE UN MICROSCOPIO OBJETIVO: Conocer la importancia del microscopio en el campo de la Biologa Celular, as como las partes que lo integran, uso y cuidado del mismo. FUNDAMENTO: Un microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a simple vista (Ver Fig. 1.1). Ello se consigue mediante un sistema ptico compuesto por lentes de cristal, que al ser atravesadas por los rayos de luz reflejados por el objeto, forman una imagen amplificada de l.(5)
Ocular binocular Cabezal Anillo de dioptra Ocular Tornillo del cabezal

Portaobjetos giratorio Brazo Platina Condensador Tornillo del carro mvil Tornillo micromtrico Anillo para la abertura del diafragma del condensador Transportador del condensador Tornillo para fijar el condensador Tornillo macromtrico Fuente de luz Base Botn de encendido Objetivo

Figura 1.1 Partes del microscopio

Los microscopios se pueden clasificar desde un punto de vista muy sencillo en: Simples y compuestos. Se le da el nombre de microscopio simple a todas aquellas lentes con montura o sin ella, de distintos espesores y dimetros, biconvexas o planoconvexas, que nos permiten amplificar los objetos, comnmente conocidas como lupas. Un microscopio compuesto est constituido por la combinacin de dos sistemas de lentes convergentes. Uno,

prximo al ojo del observador, por lo cual se llama ocular y que acta como microscopio simple. Otro prximo al objeto denominado objetivo.(1) GENERALIDADES: Descripcin del microscopio compuesto: Sistema de soporte: Pie o base: la funcin de esta pieza es dar estabilidad al microscopio y soporte a las dems partes que lo integran. Platina: es una pieza metlica cuadrada con un orificio en el centro por el cual pasa la luz, posee a su vez un carro mvil con una pinza que sujeta la muestra permitiendo su movilizacin para la observacin. Brazo: es el soporte que va desde la base hasta el sistema ptico, es el sostn de dicho sistema. Sistema ptico: Oculares: son lentes que se encuentran en el cabezal del microscopio, separados por un diafragma que permite el movimiento de estos para obtener una imagen con mejor calidad y comodidad de visin. Objetivos (seco dbil 10X, seco fuerte 40X e inmersin 100X): es la parte mas importante del microscopio, se conforman por varias lentes que corrigen las aberraciones, se encuentran en la parte baja del cabezal sujetos a un carrusel o revolver que permite el cambio de un objetivo a otro. Sistema de iluminacin: Fuente luminosa: es la luz proporcionada por una lmpara ubicada en la base del microscopio, la cual pasa a travs de la platina proporcionando iluminacin a la muestra. Condensador: es un sistema de lentes con gran abertura, que se encuentra entre la platina y la fuente de iluminacin; puede subir o bajar dependiendo del objetivo que se este utilizando. Diafragma: se encuentra situado debajo de la platina y permite regular la cantidad de luz que pasa por el condensador. Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico o de enfoque rpido: se utiliza para conseguir un ajuste aproximado de la imagen a observar. Tornillo micromtrico o de enfoque fino: su desplazamiento es mucho ms lento y permite enfocar claramente nuestra imagen. Tornillo de carro mvil: se utiliza para desplazar la laminilla sobre la platina hacia los lados, hacia atrs y hacia delante. MANIPULACIN DE UN MICROSCOPIO: 1. El banco y la mesa debern encontrarse a una altura que le permita al observador el uso del microscopio en posicin vertical y de manera confortable. 2. Encender la fuente de iluminacin.

3. Montar la preparacin que se desea observar. 4. Separar los binoculares ajustndolos a su propia distancia interpupilar. 5. Enfocar entre el ojo derecho y el izquierdo. Los tubos portaoculares son susceptibles de ajuste, esto se logra enfocando primero la imagen con el objetivo de menor aumento, usando los tornillos macro y micromtrico. Si la imagen no es clara, sube o baja el ocular izquierdo mediante el movimiento del anillo que rodea el tubo portaocular hasta obtener una imagen ntida, as el microscopio queda ajustado a su propia visin ocular. 6. Para enfocar con cualquier objetivo, especficamente el seco fuerte (40 X) y con el de inmersin (100X), debers acercar el objetivo a la preparacin, mirndolo de lado para controlar el descenso hasta que la lente frontal de dicho objetivo quede dentro de la distancia focal. Solamente entonces debers mirar por el ocular alejando lentamente el objetivo hasta obtener el enfoque correcto, el cual se obtendr moviendo el tornillo micromtrico. A) Objetivos de menor aumento (5X Y 10X): descender el condensador a fondo, bajar el objetivo sobre la preparacin (sin tocarla), subir el objetivo con el tornillo macromtrico hasta ver la imagen a travs de los oculares. Suba un poco el condensador en caso de que la iluminacin sea insuficiente. B) Objetivo de gran aumento (40X): Colocar el condensador a la mitad de la distancia, bajar el objetivo sobre la preparacin (sin tocarla). Subir el objetivo con el tornillo macromtrico muy lentamente hasta ver la imagen en el campo y perfeccionar el enfoque con el tornillo micromtrico. Mover el condensador hasta obtener iluminacin suficiente. C) Objetivo de inmersin: Colocar la preparacin perfectamente seca, poner una pequea gota de aceite de inmersin sobre la parte a examinar, subir el condensador a tope. Observa por los oculares y enfoca con el tornillo micromtrico.(1) ABERTURA NUMRICA. La abertura numrica (A.N.) de un objetivo es una cifra exacta calculada matemticamente a partir de su dimetro y su longitud focal equivalente, pero a pesar de ser una caracterstica importante, slo es necesario saber que la abertura numrica se encuentra marcada sobre la lente, que expresa el tamao del cono de la luz y que de ella depende la cantidad que atraviesa la lente y en particular su poder de resolucin y su mxima amplificacin til.(5) CUIDADOS PARA UN MICROSCOPIO.

 El microscopio deber guardarse en un lugar seco y cubierto del polvo, ya que ste adems de dificultar la observacin, daa las lentes cuando se frotan sin que stas se hayan limpiado. Al trasladarlo de un lugar a otro debe tomarse del brazo con una mano y con la otra sostenerlo de la base. Debers de cerciorarte que las lentes se encuentran limpias de polvo antes de utilizarlo, de no ser as, deben limpiarse cuidadosamente utilizando para ello un papel especial para lentes, el cual se obtiene en las pticas o en las tiendas de artculos fotogrficos. Las lentes no debern quitarse del sitio que les corresponde para que no se llene de polvo el interior del equipo, adems es necesario desmontar partes internas para limpiarlo. Cuando emplees aceite de inmersin debers limpiar las lentes una vez terminada la observacin, ya que si llegara a secarse sera difcil de limpiarse, esto puedes hacerlo con el mismo papel para las lentes. Nunca debers desarmar un microscopio, ya que si lo llegaras a hacer sin tener conocimientos de ello, podrs desajustarlo o daarlo de sus partes. Es por ello que existe personal especializado. Las lentes podrn limpiarse con agua destilada, partes metlicas o plsticas del microscopio debern limpiarse con un trapo de algodn y se les da brillo con aceite mineral. Todas las preparaciones que se hagan y se tengan que teir, limpiarlas del reverso para que no pierdan nitidez. Al terminar la observacin, debers limpiar perfectamente las lentes. En caso de tener alguna duda en el cuidado del equipo o alguna falla mecnica o elctrica, debers de dar aviso al encargado del laboratorio. (6) FACTORES QUE DAAN AL MICROSCOPIO. 1. Lavar las lentes con alcohol. 2. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia. 3. Usar papel ordinario para limpiar las lentes. 4. Poner los dedos sobre las lentes.

5. Limpiar el soporte o la platina con xilol. 6. Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeas y/o utiliza papel seda. 7. Dejar el microscopio sin oculares. 8. Guardar el microscopio con aceite de inmersin en el objetivo. 9. Transportar el microscopio con una sola mano.(3) OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS: Microscopio de Contraste de Fases. o Su sistema est compuesto por lente ocular, anillo de fases, lente del objetivo, lente del condensador y diafragma anular. Tiene una amplificacin de 1,000 a 2,000 nm. Permite observar estructuras muy difciles de distinguir. No requiere de una tincin. Microscopio de Fluorescencia. o Se compone de un primer filtro de corte o filtro de excitacin, espejo dicroico, segundo filtro de corte o filtro de emisin, fuente de iluminacin y condensador. Se observan muestras teidas, inmunofluorescencia directa o indirecta. Microscopio de Interferencia. o Es un instrumento que permite la medida de la masa de regiones pequeas y transparentes de clulas vivas, obtenindose datos de tipo cualitativo y cuantitativo. Sus componentes son analizador rotable, un cuarto de longitud de onda, objetivo de interferencia, condensador, polarizador y filtro de interferencia. Microscopio Electrnico de Barrido. o Est compuesto por un can de electrones (nodo, ctodo y electroimn), sistema de barrido y de lentes. Su resolucin depende de la cantidad de electrones emitidos, contando as con un lmite de resolucin. Tiene una amplificacin de 100,000 a 200,000 veces y una alta resolucin en 3D. Microscopio Electrnico de Transmisin. o Est compuesto por can electrnico, lente condensadora, cmara de muestra, lente objetiva, lente intermedia, proyector, pantalla fluorescente y cmara (placa fotogrfica). Utiliza electrones con una longitud de onda de 0.5 . Proporciona un aumento de las clulas de 100, 000 veces aproximadamente.(4) CONCLUSIONES: CUESTIONARIO:

1) Cul es la diferencia entre un microscopio simple y uno compuesto? 2) Qu importancia tiene el uso del microscopio en la Biologa Celular? 3) Por qu es necesario utilizar aceite de inmersin al utilizar el objetivo del mismo nombre? 4) Qu significa resolucin, poder de resolucin y amplificacin, as mismo de qu factores depende cada uno de ellos? Presenta tus respuestas a manera de tabla. 5) Realiza una tabla comparativa de todos los tipos de microscopios incluyendo: fuente de iluminacin, condensador, longitud de onda, tipo de tincin, resolucin, amplificacin, tipo de lentes, etc. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Bernis, M. 1998. Atlas de Microscopa. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Fernando Aldape Barrera. Pgs. 95-107 2. Coll, J. 2000. Experimentos con el microscopio. Mxico D.F. Primera edicin. Ediciones Omega S.A. Pgs. 63-65 3. Lpez, C. 1987. Microscopia en el laboratorio. Xalapa. Facultad de Bioanlisis, U. V. Pgs. 10-21 4. Nachtigall, W. 2002. Microscopa. Materiales. Instrumental. Mtodos. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Omega. Pgs. 8-13 5. Vovides, A. 2000. Microscopa ptica: para las ciencias biolgicas. Chiapas. Universidad de Ciencias y Artes del Estado de Chiapas. Pgs. 14-19 6. Wallis, T. 1998. Microscopa analtica. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial ACRIBIA. Pgs. 9-23

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 02 MICROTOMO OBJETIVO: Aprender a realizar cortes histolgicos utilizando el microtomo. FUNDAMENTO: Los microtomos son mquinas o instrumentos empleados para obtener lminas muy delgadas (cortes) de los tejidos que sern estudiados. Segn el tipo de trabajo, la forma en que se hizo la preparacin y la inclusin del tejido, se emplean muchos tipos de microtomos; algunos estn adaptados para un trabajo especial (Ver Fig. 2.1).

Botn micromtrico Soporte de muestra Portanavajas

Botn para desbastar Cabezal

Figura 2.1 Microtomo

Generalmente se consideran cinco clases de microtomos: 1) De deslizamiento 2) Rotatorios 3) De balanceo 4) De congelacin 5) Para cortes ultradelgados (microscopia electrnica) Estos tipos pueden ser subdivididos segn sus cuchillas, ya sean mviles o fijas, o tambin segn el plano de seccin, vertical u horizontal.

Los microtomos consisten bsicamente en una base pesada que soporta una superficie por la que se desliza una cuchilla, un tornillo que acerca el material y lo ponga al alcance del filo de la navaja, de modo que siempre su avance ofrezca la misma medida del material. (1) GENERALIDADES: La tcnica histolgica comprende la preparacin de los tejidos para su estudio microscpico, lo cual se logra sometiendo a la totalidad o a una parte seleccionada del tejido por examinar, a una serie de procesos: fijacin, deshidratacin, aclaracin, inclusin, corte y tincin. El tipo de muestras que se procesa con el microtomo es diverso, puede realizarse el corte de cualquier material animal o vegetal; pero lo ms comn son los cortes de rganos perfundidos. Fijacin: Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las clulas, y por tanto de los tejidos, son fijados en cuanto a su estado fsico, y parcialmente en su estado qumico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin prdida, distorsin importante o descomposicin. La mayora de los agentes fijadores actan desnaturalizando o precipitando las protenas, que forman entonces una esponja o malla que tiende a englobar los otros componentes celulares. En condiciones ideales, un fijador debe penetrar rpidamente al tejido, su accin debe ser inmediata, y debe causar una prdida y una alteracin qumica y fsica mnima de las clulas y de sus componentes; debe adems ser barato, estable y de fcil manejo. La mayora de los fijadores producen cierto endurecimiento tisular, facilitando as el corte; pero, generalmente este efecto endurecedor es reforzado por la accin de los alcoholes, que son empleados durante el proceso de deshidratacin. Los fijadores tambin aumentan, por lo general, la diferenciacin ptica de las estructuras celulares y tisulares; al mismo tiempo, hacen que la clula resista a las soluciones hipo e hipertnicas que son empleadas despus de la fijacin; reducen tambin el riesgo de infeccin en las personas que manejan los tejidos. Deshidratacin: Los tejidos contiene gran cantidad de agua, tanto intra como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso debe ser realizado mediante el uso de alguna sustancia que se mezcle con el agua y tenga cierta afinidad con ella, de manera que pueda penetrar fcilmente entre las clulas de los tejidos. El alcohol etlico es el mejor agente para la deshidratacin, esto se logra utilizando alcoholes en distinta concentracin, empezando por el 70%. No se aconseja el paso directo del tejido de formol al alcohol concentrado, porque provoca distorsin de los tejidos; cuando estos son delicados, la deshidratacin debe ser ms gradual. Algunos agentes aclarantes actan parcialmente como deshidratantes. La deshidratacin es tambin indispensable antes de que puedan montarse los cortes teidos. Aclaramiento: Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un lquido que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Los aclaradores adems de eliminar el alcohol, muchas de estas sustancias tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. Ello se debe a sus elevados

10

ndices de refraccin, y a los cambios pticos que se producen cuando el agente aclarante penetra entre los elementos tisulares muy refractantes; es decir, el ndice de refraccin de los agentes aclarantes es aproximadamente igual al de los tejidos. La mayora de las sustancias verdaderamente aclarantes son aceites esenciales. Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar rpidamente sin endurecimiento; no deben disolver los colorantes de anilina, ni evaporarse demasiado rpido en los baos de parafina. Inclusin: Este proceso comprende la impregnacin de los tejidos con un medio que llene todas las cavidades naturales, espacios o intersticios tisulares y an los espacios intracelulares, y que proporcione la consistencia firme necesaria para hacer cortes bastante delgados sin provocar distorsin y sin alterar las relaciones espaciales del tejido y los elementos celulares. Otra ventaja fsica ms en el caso de especmenes pequeos deriva de la maniobra de encerrarlos en un bloque o una masa de material de inclusin, que permite manejar y fijar la muestra al microtomo sin daar el tejido en s. Microtomo de deslizamiento: Se dividen en un tipo en el cual la cuchilla se mantiene entre pinzas, y en el cual la cuchilla es mvil. Este ltimo no es muy satisfactorio, solo si se mantiene la cuchilla bien controlada, la variedad de cuchilla fija, donde lo que se desliza es la pieza de tejido. Este tipo de microtomo es el ms utilizado ya que es rgido, resistente, de diseo y construccin sencillos, fcil de mantener, y que la calidad de los cortes obtenidos con l es difcilmente igualada por cualquier otro instrumento. Asimismo, permite obtener grandes cortes y resulta fcil hacer cortes seriados. Microtomo rotatorio: En este microtomo solo puede emplearse una longitud de cuchilla relativamente pequea, y la cuchilla ocupa una situacin peligrosa. Adems, su diseo y construccin son complicados, lo que significa un costo elevado. No es conveniente para cortar bloques grandes como el de deslizamiento; la mayor parte de los investigadores lo encuentran ms rpido en caso de cortes numerosos de bloques ordinarios. Microtomo de balanceo: Este tipo de microtomo es probablemente el ms simple de todos, el bloque de tejido se monta en el extremo de un brazo mvil de resorte y la cuchilla se mantiene rgida en posicin horizontal con el filo hacia arriba y ligeramente inclinado hacia el bloque. Fcilmente pueden obtenerse con l series de 60 a 90 cortes; stos, sin embargo, no son absolutamente plano, sino que muestran una ligera curvatura. Microtomo de congelacin: Posee una cremallera central sobre la cual se coloca el sujetador del bloque, el cual es perforado y unido por un tubo a un cilindro conteniendo bixido de carbono. Una simple vlvula permite la liberacin de chorros rpidos e intermitentes de bixido de carbono que congelan el bloque y el tejido. La cuchilla suele ir montada en un pivote por encima del bloque.

11

Microtomo para cortes ultradelgados: Para la microscopa electrnica, los cortes deben tener de 50 a 120 m; para ello existen microtomos especiales. Suelen recurrir a expansin trmica para hacer avanzar el bloque. MATERIAL: Microtomo de deslizamiento. Pincel Bao de flotacin Portaobjetos Algodn Termmetro REACTIVOS: Alcohol Xilol Parafina TCNICA: 1) Para el manejo del tejido debe fijarse: a. Si es procesado por perfusin, debe mantenerse el tejido en el fijador durante 24 hrs. b. Despus se enjuaga con agua y se pone a deshidratar en alcohol, pasando por diferentes concentraciones. c. Despus de la deshidratacin se realiza el aclaramiento con xilol durante 3 hrs. d. Se pone a derretir la parafina, entre 52 y 54 C. e. Pasando el aclaramiento se coloca el tejido en un cassette con marbete y se coloca en la parafina durante 4 hrs., realizando 2 baos, uno para quitar el exceso de xilol y otro para cubrir completamente el tejido. El molde debe rociarse con alcohol para desprender fcilmente, una vez endurecida la parafina. f. Cuando el tejido ya est encapsulado en la parafina se realizan unos cortes gruesos para quitar el exceso de la misma (desbastar). 2) El microtomo cuenta con dos palancas una que acerca el portamuestras hacia el cabezal, y la otra, la que mueve a la muestra de arriba hacia abajo para realizar los cortes. 3) El botn micromtrico con el cual se calibra el grosor de los cortes, el cabezal que porta la navaja para la realizacin de los cortes puede ser fijo o moverse de izquierda a derecha, hacia el frente y hacia atrs.

12

Realizacin de los cortes: 4) Una vez que el tejido est listo, se coloca de 5 a 10 minutos en refrigeracin para la realizacin de los cortes. 5) Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se coloca el portamuestras a la distancia deseada con ayuda de las palancas y se desliza la cuchilla haciendo as el primer corte. 6) Junto al microtomo se tiene preparado el bao de flotacin a una temperatura de 2 C debajo de la temperatura a la que derrite la parafina (Ver Fig. 2.2).

Figura 2.2 Bao de flotacin

7) Si el corte realizado sale completo, se toma por un extremo con la ayuda de un pincel ligeramente humedecido para colocarlo en el bao de flotacin. 8) Este bao tiene como fin extender la parafina para colocarla en el portaobjetos. 9) Teniendo ya el portaobjetos rotulado, se introduce en el bao por debajo de la muestra y se levanta hacia la muestra para que se coloque sobre este, una vez fro y seco se puede observar. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES : CUESTIONARIO: 1) Qu es el microtomo y para que sirve? 2) Qu precisin tiene el microtomo al realizar los cortes? 3) Qu importancia tiene usar el bao de flotacin? 4) Por qu es necesario utilizar el proceso de fijacin? 5) Cul es la importancia de utilizar el aclaramiento en una muestra? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA:

13

1. Lynch, M. 1992. Mtodos de laboratorio. Mxico. Segunda edicin. Editorial interamericana. Pgs. 1129-1145

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 03 PREPARACIONES TEMPORALES OBJETIVO: Aprender a realizar una preparacin temporal, til en la observacin de diversos tipos de muestras. FUNDAMENTO: Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Una preparacin temporal es aquella que es utilizada en el momento de la observacin, ya que requiere que el medio de montaje no se evapore tan rpidamente y que sea posible que el material biolgico se conserve por un tiempo (algunos das) en condiciones de ser observado; las frescas solo se usan durante la prctica y posteriormente se lavan. Y las permanentes son aquellas preparaciones que duran para siempre, por lo que se debe hacerse con un material especial como el blsamo de Canad, para que el cubreobjetos permanezca perfectamente adherido al portaobjetos durante aos (Ver Fig. 3.1).(2)

Fig. 3.1 Preparacin temporal

GENERALIDADES: En general una preparacin microscpica se define como el resultado de una serie de operaciones destinadas a colocar material de observacin en una capa de poco espesor, lo ms pequea y representativa posible. Pudiendo ser en seco, lquido o en vivo, o en partes sobre una superficie de vidrio transparente (portaobjetos) y cubierta algunas veces con otra de menor aumento y ms delgada (cubreobjetos). (Ver Fig. 3.2) (4)

14

Fig. 3.2 Material para montaje de muestras

Los portaobjetos deben ser de vidrio lo ms transparente posible, de un espesor aproximado de 2 mm y de unas medidas estndar de 16 x 26 mm. Los bordes pueden ser o no esmerilados. Algunos tienen una concavidad circular en su centro destinada a recibir gotas de lquido con elementos para su estudio. Los cubreobjetos son de muchos tamaos, los habituales son de 18 x 18 mm, 20 x 20 mm y 22 x 32 mm y diversas formas, los ms comunes son cuadrangulares. Su espesor es aproximadamente de 0.25 mm. A manera de sugerencia, tanto el portaobjetos como el cubreobjetos antes de ser utilizados debern limpiarse con alcohol para eliminar la grasa y el polvo.(3) MATERIAL: Microscopio compuesto. Portaobjetos. Cubreobjetos. Pipeta pasteur o gotero. Frasco gotero con agua. Aguja de diseccin. MATERIAL BIOLOGICO: Hongo de pan. TCNICA: 1. Colocar en un portaobjetos una gota de agua con el gotero. 2. Tomar una pequea muestra con la aguja de diseccin del hongo de pan y extindelo sobre la gota de agua que aplicaste en el portaobjetos. 3. Colocar el cubreobjetos sobre tu muestra, cuidando que no vaya a tener aire al momento de que sea colocado. 4. Proceder a observar con el objetivo seco dbil y seco fuerte, cuidando que al momento de enfocar no rompas el cubreobjetos. 5. Dibuja lo que observaste en tu preparacin.

15

OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Por qu son importantes las preparaciones temporales? 2) Qu propiedades tiene este medio de montaje? 3) Cules son las preparaciones que se pueden hacer en el laboratorio? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Alberts, B. 2006. "Introduccin a la biologa celular". Madrid. Segunda edicin. Editorial Mdica Panamericana. Pgs. 24-27 2. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 17-18 3. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 13-15 4. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 43-45

16

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 04 DIVERSIDAD CELULAR OBJETIVO: Establecer las semejanzas y diferencias entre las clulas vegetales y animales. FUNDAMENTO: La clula es la unidad bsica funcional y estructural ms pequea de los organismos vivos. Se compone de partes caractersticas, cuyo trabajo esta coordinado de tal manera que cada tipo de clula lleva a cabo una funcin estructural bioqumica nica. Las clulas realizan numerosas reacciones qumicas para dar origen al proceso vital que se lleva a cabo de manera compartimentalizada; es decir, estructuras especializadas dentro de la clula efectan reacciones qumicas aisladas, las cuales estn coordinadas unas con otras para mantener con vida tanto la clula como los tejidos, rganos, sistemas y todo el organismo.(4) Regulan el flujo de entrada y de salida de los materiales a fin de asegurar las condiciones ptimas para el proceso vital prevaleciente dentro de ellas. Asimismo, utilizan su informacin gentica para guiar la sntesis de la mayora de sus componentes y dirigir gran parte de sus actividades qumicas; entre stas, la generacin de ATP, por desdoblamiento de los nutrientes, la sntesis molecular, la transportacin de las molculas dentro y entre las clulas, la remocin de los desechos y el movimiento parcial o incluso de toda la clula. GENERALIDADES: Las unidades bsicas de todos los organismos tienen muchas caractersticas en comn, pero no todas ellas poseen todo el conjunto de componentes. (1) Caractersticas de las clulas animales, clulas vegetales y protistas. Las clulas animales se pueden distinguir fcilmente de las vegetales en virtud de marcadas diferencias. Los animales poseen ciertos sistemas organizados caractersticos, son capaces de moverse por s mismos y dependen completamente de sustancias preformadas para obtener energa y carbono; stas son nicamente algunas de sus caractersticas ms notorias.

17

Las plantas superiores contienen el pigmento verde llamado clorofila, lo que les permite efectuar la fotosntesis, son generalmente inmviles y tienen sistemas organizados de manera peculiar. Un nmero considerable de organismos unicelulares exhiben caracteres tanto de plantas como de animales, a estos como poseen esta peculiaridad los clasifican como protistas.(5)

Caractersticas exclusivas de la clula animal. Centrosoma, cilios y flagelos. Virtualmente todas las clulas animales y un escaso nmero de clulas vegetales muy primitivas o inferiores, tienen una estructura citoplasmtica, llamada centrosoma. En la clula en reposo se presenta usualmente cerca del ncleo a manera de una pequea regin mas clara con fibras radiadas a manera de una estrella y una o dos pequeas granulaciones que se tien profundamente en su parte central, a las que se les ha dado el nombre de centriolos. Las clulas de las plantas superiores no tienen centrosoma, aunque en su lugar presentan dos pequeas reas claras durante la divisin celular a las que se les llama casquetes polares, que aparentemente tienen la misma funcin que el centrosoma durante la divisin celular. Adems, el centrosoma controla la actividad y la formacin de los cilios y flagelos, estructuras citoplasmticas filamentosas y distendidas que se proyectan a partes de la superficie externa de la membrana celular en cierto tipo de clulas. Los cilios son relativamente cortos y se presentan en gran cantidad, mientras que los flagelos son considerablemente ms largos y en menor numero. Ciertos organismos unicelulares poseen un gran nmero de cilios o flagelos que se mueven rtmica y coordinadamente; pueden contarse por cientos y son los causantes de la movilidad de estas formas unicelulares. Ciertos epitelios que tapizan las superficies internas del organismo, tales como la trquea humana, poseen grandes cantidades de cilios. Estos movimientos coordinados originan corriente de fluidos y de aire hacia el exterior de la superficie celular, expulsando partculas extraas pequesimas que penetran a la trquea. Los flagelos tambin se encuentran en muchos organismos unicelulares y en la gran mayora de las clulas espermticas de animales y vegetales. Su accin, a manera de ltigo, favorece la movilidad de estas clulas (Ver Fig. 4.1). (2)

18

Fig. 4.1 Clula animal

Caracteres exclusivos de la clula vegetal. Pared celular. Esta, es una de las caractersticas ms sobresalientes de la clula vegetal. Consiste de una envoltura moderadamente rgida de material inerte, que rodea a cada uno de los protoplastos. Aunque es sintetizada y secretada por el citoplasma de la clula vegetal, estrictamente hablando no puede considerarse esta pared celular como un componente de la clula, sino como un deposito extracelular. En la mayora de las plantas verdes, est compuesta principalmente de un carbohidrato muy complejo llamado celulosa y segn el tipo de clula vegetal que se trate, adems de la celulosa, puede tener varias sustancias, incluyendo sales, lignina, sustancias parecidas a las grasas repelentes de agua tales como ceras y suberina. La pared celular vara considerablemente en grosor dependiendo del tipo de tejido vegetal y de las condiciones de crecimiento. En clulas vegetales maduras consiste, por lo regular, de tres capas y casi siempre es mucho ms gruesa que la membrana celular adyacente. A diferencia de la membrana celular, es permeable a la mayora de las molculas y no controla el paso de materiales hacia dentro y hacia fuera de la clula. En efecto, la pared celular es como una especie de armazn que le sirve a la clula vegetal para proteger, mantener y servir de apoyo a la clula y a la planta en general. Muchas clulas animales tambin depositan materiales extracelulares alrededor de la superficie externa de sus membranas celulares. Estos depsitos no contienen celulosa o cera, varan considerablemente en su composicin y se les llama sustancias intersticiales. A diferencia de esta pared celulsica, estas sustancias no tienen una organizacin definida y no dan el efecto de una estructura a manera de una pared. En la mayora de los tejidos vegetales, la sustancia intersticial acta como un cemento que mantiene unidas a las clulas; se extiende al hincharse la clula, ofreciendo poca o ninguna proteccin contra las rupturas del protoplasto. Cuando la clula pierde agua se adapta a la forma que toma al contraerse. Por el contrario, las membranas celulsicas o paredes celulares de las plantas superiores, bacterias y hongos, mantienen mas o menos su forma y tamao, a pesar de los cambios en el volumen del protoplasto debido a los cambios en el contenido de agua, evitando as la ruptura del protoplasto (Ver Fig. 4.2).(2)

19

Plastos. Son Fig. estructuras citoplasmticas unidas4.2 Clula vegetal que se encuentran en las clulas de las plantas superiores y en ciertos organismos unicelulares, pero nunca en las clulas de animales superiores. Aunque su tamao, forma y color pueden variar de manera considerable, segn el tejido de que se trate, del organismo y de las condiciones de desarrollo, a menudo se presentan en forma de cuerpecillos discoides o esfricos que se encuentran libremente en el citoplasma.(3) MATERIAL: Microscopio compuesto. Porta y cubreobjetos. Gotero con bulbo. Corcho de botella. Navaja de rasurar nueva. Pinzas. Hisopos estriles. Lancetas estriles. Torundas con alcohol. Tubos al vaco Vacutainer de tapa morada. Ligadura. Pipeta pasteur. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Centrfuga clnica. Frascos de boca ancha limpios y secos. MATERIAL BIOLGICO: Bulbo de cebolla. Sangre. Semen. Orina. Polen.

20

REACTIVOS: Solucin salina isotnica. Solucin de Locke. Azul de metileno al 1%. Colorante de Wright. Buffer de Fosfatos. Aceite de inmersin. TCNICA PARA LAS CLULAS DEL CORCHO: 1. Toma el corcho con la mano izquierda, sujeta firmemente y corta una rebanada muy fina colocando la navaja un poco oblicua a la superficie. 2. Cuando se haya obtenido el corte lo suficientemente delgado, se coloca en un portaobjetos y se le agrega una gota de agua y se cubre. 3. Debe evitarse las burbujas de aire.

4. Obsrvese con menor aumento sobre todo las orillas del corte donde habitualmente es ms delgado. 5. Dibuja una pequea porcin de este material e indica la forma y el tamao de las clulas. 6. Responde lo siguiente: a) Qu estructura se ve dentro de ella? b) Qu parte de la clula es la que evita que el agua penetre en las clulas?

TCNICA PARA LAS CLULAS DE CEBOLLA: 1. Corta un bulbo de cebolla en 4 partes, se observar que cada parte se separa por s sola en capas llamadas envolturas u hojas. 2. Toma una de estas escamas con la superficie cncava y rmpela. Entonces observars que se desprende con facilidad una capa muy delgada y transparente que es la epidermis. 3. Toma un fragmento y colcalo sobre un portaobjetos con una gota de agua de modo que la superficie que estaba en contacto con la escama quede hacia arriba. Usa un fragmento de epidermis de no ms de 1 cm 2 y cbrelo con un cubreobjetos. 4. Observa con menor aumento y contesta lo siguiente: a) Cmo se aprecia la morfologa de las clulas y sus paredes? 5. Retira la preparacin de la platina del microscopio y coloca una gota de azul de metileno de un lado de la preparacin, en el borde del cubreobjeto para que la solucin entre por capilaridad. Observa con un menor aumento. 6. Contesta lo siguiente: 21

a) Cul es el color y la forma del ncleo? Observa los ncleos con seco fuerte. b) Cul es la ubicacin de este organelo en la clula? 7. Alrededor del ncleo se encuentra una sustancia granular que se ha teido ligeramente que es el citoplasma, descrbelo. Compara las clulas de la cebolla con las del corcho. a) En qu difieren? b) En qu se asemejan? c) Consideras que las formas y tamaos celulares estn relacionados con las funciones de las mismas? TCNICA PARA LAS CLULAS DE POLEN: 1. Colocar unas partculas de polen sobre un portaobjetos. 2. Agregar una gota de agua y colocarle un cubreobjetos cuidando de no dejar burbujas de aire. 3. Observar la morfologa al microscopio con el objetivo de menor aumento. TCNICA PARA CLULAS ANIMALES: 1. Coloca una gota de solucin salina isotnica en un portaobjetos limpio, con un hisopo frota ligeramente la cara interna de la mejilla y el material que obtengas mzclalo con movimientos rotatorios junto con la solucin salina isotnica hasta obtener un material con aspecto lechoso homogneo. Agrega una gota de azul de metileno y cubre la preparacin con un cubreobjetos. 2. Con el objetivo seco dbil, localiza las clulas y compralas con las de las plantas. Vas a encontrar algunas clulas asociadas, otras dobladas o rotas. Busca una o dos que estn completas con el objetivo seco fuerte. El ncleo es claramente visible si se ajusta la luz convenientemente, tambin se podr observar el citoplasma. TCNICA PARA PUNCIN VENOSA: 1. Una vez seleccionado el sitio de puncin, con una torunda se frota perfectamente el lugar elegido, sin pasar la torunda por el mismo sitio. Con esto se eliminan suciedad y detritus celulares y se evita la introduccin de grmenes al puncionar. 2. Mientras el alcohol se seca, se aplica un torniquete con la ligadura, unos 7 centmetros por encima del sitio de puncin. No se debe dejar muy apretado pues provocara xtasis venosa que podra modificar los valores hemticos. Desde luego que el torniquete no debe ser muy apretado, pues podra ser molesto para el paciente. Se invita al paciente a apretar el puo, con lo que favorece la fijacin de la vena adems de que la compresin muscular aumenta el flujo venoso con la dilatacin de las venas.

22

3. Se fija la vena en posicin, sosteniendo el brazo del paciente con la mano mientras se estiran y comprimen los tejidos blandos situados debajo de donde se va a puncionar. Se toma el maneral del vacutainer y haciendo un ngulo de 15 con el brazo, se perfora la piel a lo largo de la cara lateral de la vena. Se hace avanzar la punta de la aguja debajo de la piel de 0.5 a 1 cm y luego se perfora la pared de la vena. La introduccin se hace con suavidad pero con suficiente rapidez para reducir las molestias. Una vez que est saliendo la sangre, se retira la ligadura para evitar hemlisis. 4. Cuando la aguja haya penetrado la vena, se introduce el tubo en el maneral de sujecin, el que se mantiene fijo con la otra mano, hasta que el tapn del tubo sea atravesado por la aguja situada dentro del maneral. Una vez que el tubo se llen, se extrae y se repite la operacin con tantos tubos como sea necesario. 5. Se invita al paciente a abrir su puo. La aguja se retira en sentido inverso a como se introdujo tambin de manera suave pero con un solo movimiento. De inmediato, se coloca una torunda impregnada de alcohol en el sitio de puncin, ejerciendo presin sobre la zona y mantenindola as por lo menos de 3 a 4 minutos para evitar la formacin de hematomas. 6. Una vez extrada la muestra, es indispensable mezclarla, invirtiendo la muestra para que se mezcle con el anticoagulante y de esta manera evitar una posible coagulacin de la misma. FROTIS DE SANGRE: 1. Coloca una gota de sangre en el extremo de un portaobjetos y con otro extiende hacia el otro extremo. 2. Seca el frotis al aire. 3. Una vez seco el frotis se coloca en un puente de tincin, para realizar la tincin de Wright de la siguiente manera: con un gotero, agregar colorante de Wright a todo el frotis y dejarlo reposar 5 minutos, una vez pasado el tiempo agregar sobre el mismo colorante con otro gotero buffer de fosfatos y dejarlo reposar durante 15 minutos, a intervalos de 5 minutos, soplar sobre el frotis con una pipeta pasteur hasta observar la presencia de capa verde metlica. 4. Una vez cumplido el tiempo, quitar el colorante al chorro de agua durante 5 30 segundos. 5. Despus del lavado, quitar el exceso de agua inclinando el frotis y tocando con un papel secante el borde inferior. Limpiar la parte posterior del portaobjetos. 6. Secar las preparaciones al aire.

23

7. Para montar la preparacin al microscopio, se deber agregar una gota de aceite de inmersin y observar a 100X. 8. Imgenes de las diferentes clulas sanguneas que pueden ser observadas en un frotis (Ver Fig. 4.3).

a) Neutrfilo segmentado

b) Basfilo

c) Eosinfilo

d) Monocito

e) Linfocito Figura 4.3 Tipos de leucocitos

TCNICA PARA LA OBTENCIN DEL SEMEN: 1. La muestra deber obtenerse por masturbacin y depositarla en un frasco de boca ancha el cual deber estar perfectamente limpio. Esta muestra preferentemente deber estar lista pocos minutos antes de la realizacin de la prctica, para observar la movilidad de los espermatozoides (Ver Fig. 4.4). 2. Una vez que se tiene la muestra, colocar una gota de semen en el centro de un portaobjetos, agregar una gota de azul de metileno al 1% y cubrirla con un cubreobjetos. 3. Observar la muestra a 10 y 40X, realizando dibujos de las estructuras observadas.

24

TCNICA PARA LA PREPARACIN DE MUESTRA DE ORINA: 1. Obtener una muestra de orina (aproximadamente 10 a 15 ml) en un frasco de boca ancha perfectamente limpio sin restos de detergente. 2. Colocar en un tubo de ensayo de 13 x 100 mm, aproximadamente 5 ml. de orina y centrifugarla durante 5 minutos a 2,500 rpm. 3. Una vez pasado el tiempo, saque el tubo de la centrfuga y por decantacin eliminar el sobrenadante, resuspenda el sedimento y agregue unas de azul de metileno, espera 5 minutos y agrega una gota de la solucin de orina con azul de metileno a un portaobjetos y cbrela con un cubreobjetos. 4. Observa al microscopio con el objetivo seco dbil y seco fuerte (Ver Fig. 4.5). 5. Realiza dibujos de las estructuras observadas en cada preparacin.

Figura 4.4 Partes del espermatozoide

Figura 4.5 Clulas del epitelio pavimentoso

NOTA: Resuelve cada una de las preguntas anteriores.

25

Elabora una tabla comparativa de las clulas observadas.

OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Qu diversidad celular se encuentra en el frotis de sangre? 2) En el frotis de semen Qu clulas identificas? Todos son normales? 3) Qu funcin tienen cada una de las clulas sanguneas? 4) Qu analoga estructural existe entre los espermatozoides y los protozoarios? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 42-47 2. Margulis, L. 2000. El origen de la clula. Barcelona; Mxico. Segunda edicin. Editorial Revert. Pgs. 23-29 3. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 176-184 4. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 56-58, 121-124, 128 5. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 101-108

26

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 05 CLULAS PROCARITICAS Y EUCARITICAS OBJETIVO: Establecer algunas diferencias morfolgicas entre clulas procariticas y eucariticas, as como entre clulas vegetales y animales mediante la observacin de las mismas. FUNDAMENTO: Desde que Robert Hooke observ las celdas de corcho, otros cientficos se dieron a la tarea de investigar cmo estaban formados los seres vivos. Fueron tres de ellos quienes conformaron lo que conocemos ahora como la Teora Celular: el botnico Matthew Schleiden quien propuso a la clula como la unidad estructural de las plantas, el zologo Theodor Schawn que hizo lo mismo con los animales, y el mdico y fisilogo Rudolph Virchow que conjunt las propuestas anteriores y propuso que la clula se origina de otra clula.(4) Existen dos tipos de clulas en la naturaleza: las procariticas como las bacterias, que estn conformadas por una membrana celular, citoplasma, material gentico y ribosomas (Ver Fig. 5.1). Y las eucariticas como las de los protistas, hongos, plantas y animales, que adems de las estructuras de las bacterias, tiene organelos membranosos, con material gentico encapsulado en un ncleo (Ver Fig.5.2). Todo esto se conoce gracias a la microscopa electrnica.(1)

27

Figura 5.1 Clula procarionte (Bacteria)

GENERALIDADES: Las clulas comparten muchas caractersticas estructurales, pero hay una clara diferencia entre la organizacin de las clulas procariticas y la de las eucariticas. En particular, las clulas de los procariotes (bacterias, algas verde-azules y algas herbiverdes) son pequeas y simples. Tienen una Figura 5.2 Tipos de clulas membrana citoplsmica, generalmente delimitada por una pared celular rgida; un nucleoide que consta de una sola molcula de ADN circular y que representa todos los genes del organismo (genoma); y un citoplasma que contiene ribosomas y una gran variedad de molculas que median el metabolismo pero carecen de membranas internas permanentes. Al carecer de estas membranas sus clulas no poseen un ncleo, no poseen mitocondrias, ni cloroplastos, ni retculo endoplsmico, ni aparato de golgi, ni lisosomas, ni peroxisomas, ni vacuolas. Si bien, algunas bacterias poseen flagelos, estos constan de un solo filamento, a manera de un solo microtbulo. No est presente, pues, el ordenamiento multifilar que se encuentra en los cilios y flagelos de otros organismos.(3) El trmino procaritico se utiliza a menudo para distinguir las clulas de las bacterias y de las algas, de las clulas provistas de ncleo o eucariticas, de todos los dems organismos. Todos los procariotes son organismos unicelulares. En contraste, las clulas de los cuatro reinos de los organismos eucariticos (protistas, hongos, animales y vegetales) son ms grandes y estn

28

caracterizadas por muchos compartimientos membranosos (Ver Fig. 5.3, 5.4). La caracterstica primaria de las clulas eucariticas es el ncleo con sus cromosomas. El citoplasma que rodea al ncleo, limitado a su vez por la membrana, incluye una variedad de organelos, teniendo cada clase su propia organizacin estructural y funcin o funciones particulares en la clula. Adems de los organelos membranosos, como el retculo endoplsmico, al aparato de Golgi, las mitocondrias, los lisosomas, los cloroplastos (en las clulas fotosintticas) y otros, tambin hay ribosomas, centriolos, microfilamentos, microtbulos y una multitud de protenas suspendidas en la porcin citoslica del citoplasma.

Figura 5.3 Clula animal

Figura 5.4 Clula vegetal Figura 5.5 Clulas eucariontes

Una membrana rodea al citoplasma y sta misma puede estar delimitada por una pared celular rgida o por cubiertas superficiales de otras clases. En muchas clulas la superficie celular incluye especializaciones caractersticas, como los cilios o flagelos, las microvellosidades y las uniones con otras clulas en los tejidos. (2) Los eucariontes pueden ser unicelulares o multicelulares; ser sexuales o asexuales, o bien variar considerablemente en su forma externa. Las

29

relaciones evolutivas entre los tipos de las clulas modernas no estn todava muy claras, pero los procariontes son, sin duda, ms antiguos y comparten un ancestro comn con los organismos eucariticos. Todas las clulas ofrecen similitud en la estructura de su membrana, en sus mecanismos para almacenamiento y transferencia de informacin y en su metabolismo; de modo que es posible que estos aspectos hayan evolucionado muy temprano y hayan sido retenidos desde entonces en todos los linajes descendientes. Los nuevos mtodos del anlisis molecular podrn aclarar estos hechos evolutivos fundamentales.(5) MATERIAL: Lupa. Microscopios. Porta y cubreobjetos. Hisopos estriles. Mechero Bunsen. Caja petri. Gotero. Aguja de diseccin. Navaja. Palillo de dientes. MATERIAL BIOLOGICO: Agua de estanque o de acuario (agua verde). Pan y frutas con mohos. Sarro dentario. REACTIVOS: Lugol. Fucsina bsica. Cristal violeta. Alcohol de 90. Azul de metileno. TCNICA PARA LA OBSERVACIN DE BACTERIAS: 1. Disolver en una gota de agua sobre un portaobjetos, una pequea porcin de sarro dentario y con sta se realiza un frotis o extensin. Enseguida fijarlo a la llama de un mechero bunsen, para esto pasar varias veces el portaobjetos sobre la flama cuidando que no hierva la preparacin. 2. Coloca dentro de una caja petri el portaobjetos, cubrindolo con la solucin de cristal violeta por un minuto. Lavar al chorro de agua cuidando que no se arrastre la muestra. 3. agua. Agrega una gota de lugol, dejar 1 minuto y lavar al chorro de

4. Decolorar con alcohol de 90. Esta operacin debe ser rpida para que no se elimine todo el colorante. 30

5. Cubrir con fucsina bsica por medio minuto. Escurrir el colorante y lavar al chorro de agua. 6. Dejar secar la preparacin al aire.

7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin. Algunas bacterias se vern teidas de color rosa y otras de violeta. 8. Hacer esquemas de las observaciones, sealando con su nombre las estructuras que se puedan distinguir. TCNICA PARA LA OBSERVACIN DE PROTOZOARIOS Y ALGAS: 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de agua verde de estanque o bien raspar las paredes de un acuario con un portaobjetos. 2. Colocarle un cubreobjetos para observar en el microscopio con los objetivos seco dbil y seco fuerte. 3. Realizar esquemas de los organismos observados y sealar los nombres de las estructuras que se puedan visualizar. TCNICA PARA LA OBSERVACIN DE MOHOS (HONGOS PLURICELULARES): 1. Colocar algunas hifas sobre un portaobjetos (desprender el moho del pan y verduras mediante una aguja de diseccin, con movimientos suaves para no destruirlo). 2. Cubrirlas con una solucin de azul de metileno por 2 minutos. 3. Escurrir el colorante con cuidado y colocar un cubreobjetos sobre las hifas. Observar a seco dbil. Realizar los esquemas correspondientes, sealando las estructuras visibles. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cules fueron las diferencias que observaste al microscopio entre las clulas eucariontes y procariontes? 2) Clasifica las clulas observadas en: Clulas Procariticas Clulas Eucariticas

3) Mencionar una diferencia estructural entre las clulas vegetales y animales observadas al microscopio.

31

FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Alberts, B. 2006. "Introduccin a la biologa celular". Madrid. Segunda edicin. Editorial Mdica Panamericana. Pgs. 53-57 2. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial Continental. Pgs. 41-46 3. Cooper, G. 2002. La clula. Segunda edicin. Editorial Marbn. Pgs. 23-25 4. Nelson J. 2002. Principios de Biologa. Enfoque humana. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Limusa, S.A. Pgs. 10-12 5. Madigan, M. 2003. Biologa de los Microorganismos. Madrid. Dcima edicin. Editorial Prentice-Hall. Pgs. 17-22

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 06 OBSERVACIN DE ORGANELOS CELULARES OBJETIVO: Identificar las estructuras que integran las clulas vegetales y animales como plastos, ncleo, etc., mediante la observacin de las preparaciones. FUNDAMENTO: Los organelos son estructuras especializadas que tienen formas caractersticas y realizan funciones especficas en el crecimiento, mantenimiento y reproduccin de las clulas (Ver Fig. 6.1). Muchas reacciones qumicas ocurren en una clula simultneamente, sin embargo hay poca interferencia entre los distintos tipos de reacciones porque ocurren en diferentes organelos.

32

Figura 6.1 Organelos celulares

Cada tipo de stos tiene un conjunto de enzimas caractersticas propias que desempean reacciones especficas, y cada uno se encuentra en un comportamiento funcional, donde ocurren procesos fisiolgicos particulares. No obstante, los organelos con frecuencia colaboran entre ellos para mantener la homeostasis.(4)

GENERALIDADES: La parte interior de la clula se llama citoplasma y este se divide en dos componentes: el citosol y los organelos. Citosol: Es la parte liquida en la que circundan los organelos y constituye aproximadamente el 55% del volumen total de la clula. Si bien vara en su composicin y consistencia de una parte a otra de la clula, contiene de 75 a 90 % de agua ms componentes disueltos y suspendidos. Entre ellos hay varios iones, glucosa, aminocidos, cidos grasos, protenas y lpidos, ATP y productos de desecho. Tambin estn presentes varias molculas orgnicas que se agregan en masas y son almacenadas. Dichas molculas pueden aparecer y desaparecer varias veces a lo largo de la vida de las clulas.(1) Los organelos a su vez se dividen en varios tipos y realizan funciones diversas. Centrosoma: Se ubica cerca del ncleo, consta de dos componentes, el rea pericentriolar y los centrolos. El rea pericentriolar constituye una regin del citosol compuesta por una densa red de pequeas fibras de protena. Esta zona es un centro de organizacin para el huso mittico,

33

que desempea un papel bsico en la divisin celular y en la formacin de microtbulos en las clulas indivisibles. Dentro del rea pericentriolar hay un par de estructuras cilndricas llamadas centrolos, cada una de las cuales est compuesta por nueve racimos o haces de tres microtbulos dispuestos en forma circular.(5) Cilios: Son numerosos filamentos cortos que se extienden desde la superficie celular. Cada uno contiene un centro de microtbulos envueltos por la membrana plasmtica. Cada cilio se halla fijo a un cuerpo basal justo debajo de la membrana plasmtica. Flagelos: Son similares en estructura a los cilios pero mucho ms largos. Con frecuencia mueven a una clula entera. Un flagelo genera movimiento hacia delante a lo largo de su eje mediante un culebreo rpido conforme a un patrn oscilante.(2) Ribosomas: Son sitios donde se sintetizan protenas. stos diminutos organelos constituyen haces de cadenas ARN ribosmico y muchas protenas tambin ribosmicas. Los ribosomas reciben este nombre porque tienen un alto contenido de cido ribonucleico.(5) Retculo endoplsmico: Es una red de membranas que forman sacos planos o tbulos denominados cisternas (cavidades). Se extiende de la membrana que envuelve al ncleo (cubierta nuclear), a la cual est conectado, por todo el citoplasma. El retculo endoplsmico es tan extenso que constituye ms de la mitad de las superficies membranosas dentro del citoplasma de la mayora de las clulas. Complejo de Golgi: La mayora de las protenas sintetizadas por los ribosomas que se unen al retculo endoplsmico rugoso finalmente son transportadas a otras regiones de la clula. El primer paso en la va de transporte es el complejo de Golgi, que est formado por 3 a 20 sacos membranosos aplanados con bordes predominantes. La mayor parte de las clulas solo tienen un complejo de Golgi, aunque algunas poseen muchos. Dicho complejo es ms extenso en las clulas que secretan protenas en el lquido extracelular. La entrada, las cavidades intermedias y la salida del complejo de Golgi contienen enzimas diferentes que les permiten a cada una modificar, ordenar y empacar las protenas para que puedan ser transportadas a su destino.(6) Lisosomas: Son membranas envueltas en vesculas que se forman en el complejo de Golgi. Dentro de ellas hay hasta 40 clases de poderosas enzimas digestivas o hidrolticas que tienen la capacidad de descomponer una amplia variedad de molculas. Las enzimas lisosmicas trabajan mejor en pH cido y la nica membrana lisosmica incluye bombas de transporte activo que mueve iones hidrogeno (H+). La membrana lisosmica tambin permite que los productos finales de la digestin, como los azcares y aminocidos sean transportados dentro del citosol. Un lisosoma puede engullir otro

34

organelo, digerirlo y regresar sus componentes al citosol para que vuelvan a ser usados. Mitocondria: Constituye la central energtica de la clula. Una clula puede tener unos pocos cientos o miles de mitocondrias. Las clulas con actividad fisiolgica tienen un gran nmero de mitocondrias porque usan ATP en grandes cantidades. Una mitocondria est limitada por dos membranas, cada una de las cuales es similar en estructura a la membrana plasmtica. Las mitocondrias se autorreplican, un proceso que ocurre cuando se incrementa la demanda de energa o antes de la divisin celular. (3) MATERIAL: Aguja de diseccin. Vasos de precipitado. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Cubreobjetos y portaobjetos. Microscopio compuesto. Navajas. Algodn. Frasco de boca ancha. MATERIAL BIOLGICO: Elodea.(Elodea canadensis, planta acutica) Geranio.(Pelargonium grandiflorum) Jitomate. Cultivo de paramecios. Nopal. Sanda. Insecto. REACTIVOS: Azul de metileno. Alcohol absoluto. ter. Solucin de yodo. Solucin de lugol. Cristal violeta. TCNICA PARA CLULAS VEGETALES: 1. Coloca entre el cubreobjetos una hoja de Elodea con una gota de agua, selecciona una clula y cuenta el nmero de cloroplastos. Haz lo mismo en diez clulas y obtn el promedio. Observa su forma y localizacin. 2. Haz la misma operacin en clulas de corte de nopal.

35

3. Preparar con 48 horas de anticipacin una planta de geranio expuesta a la luz y otra a la oscuridad. 4. Haz un corte transversal de una hoja de la planta de geranio expuesta a la luz y otra expuesta a la oscuridad. 5. Observa y compara el contenido de cloroplastos en cada una. 6. Haz un corte delgado de pulpa de jitomate y colcalo entre porta y cubreobjetos. Obsrvalo al microscopio y anota su forma, color y tamao de los cromoplastos. Puede observarse lo mismo macerando en agua el ptalo de una flor colorida. 7. Observa a seco dbil y seco fuerte una preparacin de un corte delgado de la parte blanca de la sanda para identificar la presencia de leucoplastos. 8. Esquematiza la posicin que ocupan las vacuolas y el nmero de ellas. Se recomienda teir con cristal violeta. 9. De las preparaciones anteriores esquematiza los ncleos y contesta lo siguiente: a) Cul es la localizacin de los ncleos? b) Llena el citoplasma toda la clula? c) Con respecto al geranio Qu podras concluir? TCNICA PARA CLULAS ANIMALES: 1. Coloca una gota del cultivo de paramecios en un portaobjetos y encima un cubreobjetos. 2. Localiza un paramecio de buen tamao y trata de apreciar las vacuolas. 3. Coloca en un frasco un insecto con un algodn impregnado con un poco de ter y tapa el frasco. Cuando ya no tenga ningn movimiento, extrpale uno de los msculos de la pata; desmencela con una navaja y deseque con calor suave. Coloca algunas fibras en un portaobjetos con una gota de suero fisiolgico y examina a seco fuerte. 4. Observa la forma, el tamao y el ncleo de las clulas y contesta lo siguiente: a) Son semejantes las estructuras observadas en las clulas vegetales a las del insecto? NOTA: Para realizar un cultivo de paramecios se puede conseguir agua de florero de panten o bien colocar un poco de paja en un frasco con agua por lo menos con una semana de anterioridad y verificar al cabo de este tiempo la presencia de paramecios. OBSERVACIONES CON DIBUJOS:

36

CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Realiza un cuadro sinptico describiendo cada organelo y su funcin dentro de la clula. 2) Elabora una tabla comparativa de organelos entre la clula animal y la vegetal. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 71-82 2. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 162-175 3. Weisz, P. 2000. La Ciencia de la Biologa. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Omega, S.A. Pgs.69-75 4. Ramrez, I. 2000. Biologa celular. Mxico D.F. Primera edicin. Educacin superior tecnolgica. Editorial dgeta. Pgs. 10-17 5. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 52-56 6. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 64-73

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 07 PERMEABILIDAD CELULAR OBJETIVO: Observar y comparar el efecto de diversas sustancias qumicas a travs de la difusin en una membrana celular por medio de la hemlisis. FUNDAMENTO: Existen varios mtodos para medir la presin osmtica celular; la mayor parte son fsicos. Algunos de stos mtodos son utilizando tanto a la zanahoria 37

como al celofn, por lo que es conveniente comparar los anteriores modelos utilizando clulas vivas, como en este caso sern glbulos rojos.(1) GENERALIDADES: El movimiento de agua de adentro hacia afuera de las clulas est infludo por la semipermeabilidad de la membrana celular, o sea, su capacidad de permitir el paso de ciertas molculas o bien impedrselo (Ver Fig. 7.1).(3)

Hipotnica

Isotnica
Figura 7.1 Permeabilidad de la membrana

Hipertnica

El trmino smosis se deriva de la palabra griega que significa empujar. La tendencia de empujar sus molculas desde la porcin ms concentrada hacia la menos concentrada, puede ser el resultado de una fuerza que llamamos presin osmtica. Puesto que la presin osmtica depende de la concentracin de los materiales en suspensin, mientras ms grande es la concentracin mayor es la presin osmtica y, el objetivo de esta es igualar la concentracin de las molculas de agua en ambos lados (Ver Fig. 7.2).(2)

38

Figura 7.2 Mecanismos de transporte

En los lquidos de cualquier clula viva se encuentran sales, azcares y otras sustancias en solucin; el liquido tiene, pues, cierta presin osmtica. Cuando la clula se sumerge en un lquido con la misma presin osmtica, no hay movimiento neto de molculas de agua dentro ni fuera de la clula; esto es que la clula ni se hincha ni se encoge, por lo que se dice que se encuentra en un medio isotnico o isosmtico respecto a la clula. Normalmente el plasma sanguneo y todos los lquidos del organismo son isotnicos pues contienen la misma concentracin de sustancias disueltas que en las clulas.(1) Si la concentracin de las sustancias disueltas en el lquido circundante es mayor que la existente dentro de la clula el agua tiende a salir de la clula, por lo que esta se contrae. Este lquido es hipertnico respecto a la clula, es decir, que tiene una concentracin mayor de solutos. Si el lquido tiene menos sustancias disueltas que la clula, es hipotnico, es decir que tiene menor concentracin de solutos. Cuando una clula se coloca en una solucin no isotnica, puede ajustarse al nuevo medio por modificacin de su contenido de agua, para lograr finalmente la misma concentracin que el medio; a esto se le conoce como regulacin del volumen intracelular. Muchas clulas pueden impeler agua o ciertos solutos hacia uno u otro lado de la membrana plasmtica, de manera que en esta forma mantienen una presin osmtica distinta de la del medio ambiente.(4) MATERIAL: 5 tubos de ensayo 13 x100 mm. 1 gradilla. 2 pipetas graduadas de 5 ml. 1 cronmetro. Equipo para venopuncin. MATERIAL BIOLOGICO: Sangre. REACTIVOS: Glicerol 0.5 M. Glucosa 0.5 M. Solucin de urea 0.5 M. Solucin de etilenglicol 0.5 M. Solucin salina isotnica. TCNICA PARA DETERMINAR EL PESO MOLECULAR: 1. Preparar una serie de 4 tubos marcados de la siguiente manera, utilizando la sangre que se extrajo por venopuncin con previas indicaciones del Maestro. Tubo No. 1 2 3 4 2 ml. de sol. 0.5 M Urea Etilenglicol Glicerol Glucosa Peso Molecular Suspensin de eritrocitos 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas Tiempo Hemlisis de

39

2. Es importante utilizar una pipeta limpia y diferente para cada sustancia. 3. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos y observar tanto macroscpica como microscpicamente si se presenta la lisis. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Por qu se dice que la membrana tiene permeabilidad selectiva? 2) Por qu se dice que la bicapa de la membrana constituye una barrera natural? 3) Cules con los factores que afectan la velocidad de difusin a travs de la membrana celular? 4) Cmo esta constituida la membrana celular de tal manera que permite la permeabilidad? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Madigan, M. 2003. Biologa de los Microorganismos. Madrid. Decima edicin. Editorial Prentice-Hall. Pgs. 63-68 2. Margulis, L. 2000. El origen de la clula. Barcelona; Mxico. Segunda edicin. Editorial Revert. Pgs. 55-61 3. Oram, R. 2002. Biologa. Sistemas vivientes. Mxico D.F. Primera edicin. Compaa editorial continental. Pgs. 89-91 4. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 34-39

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 08 FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS OBJETIVO: Aprender a realizar la determinacin de la fragilidad osmtica de los eritrocitos para demostrar el fenmeno de osmosis. FUNDAMENTO: Existen varios mtodos para medir la presin osmtica celular; la mayor parte son fsicos. Algunos de stos mtodos son utilizando tanto a la zanahoria como al celofn, por lo que es conveniente comparar los anteriores modelos utilizando clulas vivas, como en este caso sern glbulos rojos. La forma de disco bicncavo del eritrocito normal, implica un exceso de extensin superficial 40

con relacin a su volumen, lo que le proporciona una gran capacidad de deformabilidad. Como la membrana eritrocitaria es semipermeable, cuando los eritrocitos son colocados en una solucin hipotnica, el agua entra osmticamente haciendo que aumente el volumen y adquiere la forma esfrica. Con ello, la superficie disminuye respecto a su volumen dando a la clula cierto grado de rigidez que interfiere con el paso de la misma a travs de pequeas aberturas, por lo que fcilmente se rompe. Otro fenmeno adicional es la salida de hemoglobina, que es permitida por el estiramiento de la membrana eritrocitaria. En esta prctica se harn una serie de diluciones de NaCl, de concentracin progresiva, en las que los eritrocitos problema se sometern a diferentes concentraciones y se valorar la concentracin de NaCl que produce la hemlisis en comparacin con una sangre normal. (1) GENERALIDADES: La prueba de fragilidad osmtica es una medida de la resistencia del eritrocito, a la hemlisis por estrs osmtico, la cual depende principalmente del volumen de la clula, del rea de su superficie y de la funcin de su membrana (Ver Fig. 8.1). Los eritrocitos se incuban en solucin hipotnica de NaCl, los eritrocitos absorben agua en un esfuerzo para conservar o para lograr el equilibrio osmtico, y las clulas se hinchan hasta que se forma un esferocito. La captacin adicional del agua produce una membrana porosa que permite la liberacin de hemoglobina (hemlisis). Las clulas normales comienzan a hemolizar a concentraciones de NaCl cercanas a 0.50% y la hemlisis es completa a una concentracin aproximadamente de 0.30 % de NaCl. Debido a la disminucin en la proporcin de superficie a volumen, los esferocitos son incapaces de expandirse tanto como las clulas normales de forma discoide. Se necesita absorber muy poco liquido antes que las clulas se hemolicen. Los esferocitos tambin tienen un aumento en la permeabilidad de la membrana, la cual contribuye al aumento de su fragilidad. (4)

41

Figura 8.1 Membrana plasmtica

MATERIAL: Centrfuga. Gradilla. 16 tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Equipo de venopuncin. Papel parafilm. Pipetas graduadas de 5 ml. Pipeta graduada de 0.2 ml. MATERIAL BIOLGICO: Sangre obtenida con EDTA. REACTIVOS: Solucin salina al 1% tamponada, pH 7.4 TECNICA: 1. Se obtienen 5 ml de sangre venosa y se mezclan perfectamente. 2. Se colocan 16 tubos de ensayo en una gradilla y se numeran de izquierda a derecha. 3. Montar la prueba de la siguiente manera: # de tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ml de sol. salina al 1% tamponada 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ml de agua destilada 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 Concentracin de la solucin (%) 0.76 0.72 0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.24 0.20 0.16

4. Mezclar del contenido de los tubos. 5. Agregar a cada tubo 0.2 ml de sangre. Invertir cuidadosamente cada tubo con papel parafilm, para asegurar la mezcla. 6. Las gradillas que contienen los tubos se dejan reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 7. Transcurrido el tiempo indicado se mezcla cuidadosamente su contenido y se centrifugan los tubos a 2000 rpm durante 5 minutos.

42

8. Examinar los tubos observando macroscpicamente en que punto comienza la hemlisis y en que punto es completa. El menor indicio de color rojo en el lquido sobrenadante indica el inicio de la hemlisis de los glbulos menos resistentes; la hemlisis completa queda indicada por una solucin rojo claro y ausencia de eritrocitos residuales en el fondo del tubo o enturbiamiento al agitar el tubo ligeramente. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Qu es la fragilidad osmtica? 2) Qu es osmolaridad? 3) Qu importancia clnica tiene la fragilidad osmtica? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Balcells, A. 1998. La ciencia y el laboratorio. Medicina. Barcelona, Espaa. 18 Edicin. Editorial Masson-Salvat. Pgs. 87-93 2. Mckenzie, S. 2000. Hepatologa clnica Editorial El Manual Moderno. Segunda edicin. Mxico D.F. Pgs. 104-112 3. Lynch, M. 1992. Mtodos de laboratorio. Mxico. Segunda edicin. Editorial interamericana. Pgs. 358-365 4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 68-70, 622-626

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 09 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE DIFUSIN OBJETIVO: Aprender a establecer el efecto de la concentracin y la temperatura sobre la velocidad de difusin de un colorante orgnico. FUNDAMENTO: El estudio de la difusin como proceso biolgico que se lleva acabo a nivel de la membrana celular, puede ser estudiado utilizando un modelo fsico, cuyo manejo sea sencillo con el propsito de conocer los factores que afectan a dicho fenmeno.(1) 43

Es necesario recordar que la difusin simple, que es la que se estudiar en esta prctica, slo es vlida para explicar la transferencia de ciertas sustancias tales como el oxgeno, el bixido de carbono y algunas molculas sencillas, especialmente aquellas que no son ionizables. Para la mayor parte de las sustancias que entran en la clula o salen de ella, existen otros tipos de procesos de intercambio, mismos que se analizarn posteriormente.(3) GENERALIDADES: Todas las molculas de lquidos y gases tienden caractersticamente a moverse o difundirse en todas direcciones hasta que se encuentran distribudas regularmente en todo el espacio disponible. Se define la difusin como el movimiento de molculas de una regin de alta concentracin, producido por la energa cintica de las molculas. La velocidad de difusin es una funcin del tamao de la molcula y temperatura (Ver Fig. 9.1). Las molculas, formadoras de toda suerte de sustancias, siempre se encuentran en movimiento. La principal diferencia entre los tres estados de la materia (slido, lquido y gas) es simplemente la libertad de movimiento de las molculas en cada caso.(2)

Figura 9.1 Velocidad de difusin

La velocidad de difusin es el proceso por medio del cual cada molcula individual se mueve en lnea recta hasta que choca con algo y luego rebota y sigue otra direccin. Las molculas siguen movindose aunque se hayan distribuido uniformemente por un espacio dado; sin embargo, con la misma rapidez con que algunas molculas se mueven de un lado a otro, es as como se mantiene un equilibrio. Cuando el medio en el que se difundir una sustancia es ms largo, le velocidad con la cual se distribuirn las partculas ser ms lento, esto puede modificarse acortando el medio o manipulando la temperatura. Algunas sustancias pasan al interior o al exterior de las clulas y se mueven dentro de stas mediante la difusin simple, proceso fsico basado en el movimiento al azar. A temperaturas mayores al cero absoluto, todos los tomos y molculas tienen energa cintica o de movimiento. Aunque el movimiento de las partculas individuales es indirecto e impredecible, es posible

44

hacer predicciones acerca del comportamiento de grupos de partculas. Si stas no estn distribuidas de manera uniforme, entonces existen cuando menos dos regiones, una con alta concentracin de partculas y otra con baja. Tal diferencia de concentracin de una sustancia de un lugar a otro es un gradiente de concentracin.(5) La membrana celular es como la va de acceso de la clula. Todos los materiales que entran a la clula o salen de ella, deben de hacerlo a travs de la membrana celular, la clula no puede funcionar apropiadamente y permanecer viva a menos que su membrana regule este paso de materiales.(1) Las membranas celulares son selectivas y la entrada o salida depende del tamao de las molculas, espacios intermoleculares, la carga elctrica y la concentracin.(2) Existen dos mecanismos de transporte de sustancias a la clula. o Transporte pasivo. En el que la clula realiza escaso trabajo ya que ste fenmeno depende ms bien del grado de concentracin de sustancia. se puede dividir en tres tipos: o Difusin: Paso de molculas de mayor a menor concentracin debido a la energa cintica de las mismas. o Dilisis: Paso de molculas del solvente a menor concentracin a travs de la membrana. o smosis: Paso de molculas de solvente o de agua de una regin de mayor concentracin a otra de menor concentracin a travs de la membrana. o Transporte activo: Se lleva a cabo en contra del gradiente de concentracin por lo que la clula requiere de mayor gasto energtico (ATP). Esto indica que la energa generada por algunas de las reacciones metablicas que ocurren en la clula es utilizada para este tipo de transporte.(4) MATERIAL: Parrilla elctrica. Un termmetro. 5 vasos de precipitado de 250 ml. Etiquetas. Cronmetro. 1 gotero. Hojas de papel milimtrico. Hielo. REACTIVOS: Solucin de azul de metileno al 10%. Agua destilada. 45

TCNICA PARA EL EFECTO DE LA VARIACIN DE LA CONCENTRACIN DEL COLORANTE SOBRE LA DIFUSIN: 1. Coloca volmenes iguales de agua destilada en los 5 vasos de precipitado. Verifica que la temperatura sea igual en todos. (Observar esquema en el catalogo de imgenes) 2. Numera los vasos de precipitado del 1 al 5; en cada uno coloca un nmero de gotas del colorante igual a su propio nmero (una gota en el vaso 1, 2 gotas en el vaso 2, etc.). 3. Mide el intervalo el cual llamaremos tiempo de difusin que existe entre el tiempo cero (tiempo en que se coloca el colorante) y el tiempo final (momento en que la distribucin del colorante es uniforme). 4. Registra grficamente los resultados en papel milimtrico. En el eje de las X concentracin y en el eje de las Y tiempo de difusin en minutos. 5. Contesta lo siguiente: a) Qu efecto tiene la concentracin sobre la velocidad de difusin? b) A qu obedecen los resultados obtenidos?

TCNICA PARA EL EFECTO DE LA VARIACIN DE TEMPERATURA SOBRE LA DIFUSIN: 1. Utilizando los mismos recipientes del experimento anterior (lavados y secos) y con la misma cantidad de agua destilada, mide el tiempo de difusin del colorante en las siguientes condiciones: se colocar una gota de azul de metileno en varios recipientes cuya agua estar a diferentes temperaturas (5, 15 ,25 ,35 y 45 C). 2. Representa grficamente los resultados en papel milimtrico. 3. Contesta lo siguiente: a) Cules son las variables de este experimento y cmo se deben situar en los ejes coordenados? b) Qu efectos tiene la temperatura sobre la velocidad de difusin? c) A que obedecen los resultados obtenidos? 4. Realiza los dibujos correspondientes para cada una de las actividades anteriores. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO:

46

1) Elabora un cuadro comparativo de los tipos de transporte de membrana. 2) Qu es la difusin? 3) Qu es la velocidad de difusin y que factores depende? Describe cada uno. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Baker, J. 2002. Biologa e investigacin cientfica. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Fondo educativo interamericano. Pgs. 29-32 2. Maillet, M. 2002. Biologa celular: manual. Barcelona. Segunda edicin. Editorial Masson. Pgs. 47-50 3. Ondarza, R. 2000.Biologa moderna: la clula, bioqumica, gentica y biologa molecular, biologa general. Mxico D.F. Dcima edicin. Editorial Trillas. Pgs. 41-42 4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 62-73 5. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 36-38

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 10 PERMEABILIDAD DE MEMBRANA OBJETIVO: Comprobar la selectividad de la membrana celular por medio de reacciones qumicas en un modelo artificial. FUNDAMENTO:

47

La membrana citoplasmtica regula la entrada y salida de materiales, permitiendo la entrada de unos y restringiendo el paso de otros. Esta propiedad se llama permeabilidad selectiva. La permeabilidad de la membrana depende de varios factores relacionados con las propiedades fsico-qumicas de la sustancia: Solubilidad en los lpidos: Las sustancias que se disuelven en los lpidos (molculas hidrfobas, no polares) penetran con facilidad en la membrana dado que esta est compuesta en la mayor parte por fosfolpidos. Tamao: La mayor parte de las molculas de gran tamao no pasan a travs de la membrana. Solo un pequeo nmero de molculas no polares de tamao pequeo pueden atravesar la capa de fosfolpidos. Carga: Las molculas cargadas y los iones no pueden pasar, en condiciones normales, a travs de la membrana. Sin embargo, algunas sustancias cargadas pueden pasar por los canales proteicos o con la ayuda de una protena transportadora. Gracias a sta seleccin es posible mantener dentro de la clula molculas de alto peso molecular como protenas y cidos nucleicos, y de bajo peso molecular como gases, sales y algunos iones. (3) GENERALIDADES: El transporte de materia puede realizarse gracias a la presencia de ciertas sustancias que conforman a las membranas: unas se encargan de formar una compleja estructura, otras de facilitar el paso de sustancias de una manera selectiva y controlada, y algunas ms tienen como funcin relacionar a la clula con el medio circundante. Entre los compuestos bsicos que conforman a las membranas podemos reconocer los lpidos, las protenas y los carbohidratos. Los lpidos conforman la estructura o matriz de la membrana y estn representados bsicamente por los fosfolpidos, es decir, compuestos que presentan una cabeza hidroflica constituida por grupos fosfato, y una cola hidrofbica formada por cadenas de carbonos de naturaleza lipdica. Tanto la cabeza como la cola pueden tener diferente composicin y complejidad, de acuerdo con el tipo de membrana de que se trate.(1) Por la presencia de dos zonas (una hidroflica y otra hidrofbica) los fosfolpidos en presencia de agua forman una bicapa. El movimiento continuo que presentan las colas de las molculas da una enorme flexibilidad a esta zona, por lo que se considera que en la membrana hay un flujo bidimensional continuo, ya que las molculas tienen gran movimiento lateral a lo largo y ancho de cada monocapa. Por el contrario, el movimiento de molculas entre dos monocapas opuestas es extremadamente lento.(4) Que una membrana permita o no el paso de una sustancia a travs de ella depende del tamao y la carga de la sustancia y de la composicin de la membrana. Se dice que la membrana es permeable a una sustancia dada si 48

permite que esta la cruce, e impermeable en caso contrario. Una membrana con una permeabilidad selectiva (semipermeable) permite el paso solo de algunas sustancias. En general, las membranas biolgicas son ms permeables a las molculas pequeas y a sustancias liposolubles capaces de cruzar el interior hidrfobo de la bicapa (Ver Fig. 10.1).(2)

Fig. 10.1 Estructura de la membrana plasmtica

Aunque son polares (no liposolubles), las molculas de agua pueden cruzar con rapidez las bicapas lipidicas fludas que constituyen las membranas porque son lo suficientemente pequeas para pasar por los huecos que se crean cuando una cadena de cido graso se desplaza en forma momentnea. Tambin pueden atravesar con libertad algunos gases como el oxgeno, dixido de carbono y nitrgeno; molculas polares pequeas como el glicerol, y sustancias no polares de mayor tamao (hidrfobas), entre stas los hidrocarburos. Algunas molculas polares un poco ms grandes, como la glucosa, as como los iones con carga de cualquier tamao, cruzan con mayor lentitud la bicapa.(4) Si bien la bicapa es relativamente impermeable a los iones, las clulas necesitan desplazar iones y molculas polares grandes y pequeas, como aminocidos y azucares, a travs de las membranas. La permeabilidad de estas ltimas a sustancias de esos tipos se debe sobre todo a actividades de protenas de membrana especializadas. Las membranas biolgicas que rodean a clulas, ncleos, vacuolas, mitocondrias, cloroplastos y otros organelos subcelulares son semipermeables a diferentes tipos de molculas. En respuesta a las condiciones ambientales o a las necesidades celulares cambiantes, una membrana plasmtica puede constituirse en barrera para una sustancia dada en un momento y promover de modo activo su paso en otro instante. Al regular el trnsito qumico de esta manera, la clula ejerce algn control sobre su propia composicin inica y molecular interna, que puede ser diferente de la que corresponde al medio extracelular.(5) MATERIAL: Mechero Probeta Vaso de precipitado de 500ml Embudo Pelcula de gel 49

REACTIVOS: Lugol. Reactivo de Benedict Solucin de albmina. cido ntrico concentrado. Agua destilada. Hidrxido de amonio concentrado. Reactivo de Biuret y de Fehling. Solucin de almidn al 1%. Solucin de glucosa al 30%. Solucin de nitrato de plata al 1%. Solucin de cloruro de sodio al 5%. TCNICA: 1. Preparar la pelcula de gel utilizando gelatina libre de azcares, bacteriolgica bioxon 2g en 50ml de agua destilada. Colocarla en un molde circular para obtener la forma de ste, procurando que la capa sea delgada (mx. 5 mm) puede ser una tapa, cristalizador o caja petri colocando entre este y el gel un pedazo de bolsa de plstico para que no pegue el gel en el recipiente. 2. Una vez que se tenga la pelcula de gel, colocarla en el embudo y agregarle 5 ml de las soluciones de almidn, glucosa, NaCl y albmina. (Observar esquema en el catalogo de imgenes) 3. Colocar el embudo con la pelcula de gel en un vaso con agua destilada hasta tener contacto con la pelcula, al agua se le habrn practicado previamente las pruebas para almidn, glucosa, protenas y cloruros, para asegurarse que el agua no contenga ninguna de stas sustancias. 4. Se deja reposar el embudo con el vaso, en posicin vertical durante 24 hrs. 5. Los procedimientos para realizar las pruebas de identificacin de almidn, glucosa y protenas se describe a continuacin: PRUEBA DEL LUGOL PARA IDENTIFICAR ALMIDN: a) Colocar una pequea cantidad de la muestra en un tubo de ensayo. b) Agregar 2 a 3 gotas de lugol. c) Observar la reaccin. Si la muestra contiene almidn con lugol adquirir una coloracin azul oscuro (reaccin positiva). PRUEBA DE FEHLING PARA IDENTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES: a) Colocar una pequea cantidad de la muestra en un tubo de ensayo.

50

b) Agregar 0.5 ml de solucin de Fehling A y 0.5 ml de solucin de Fehling B. c) Calentar a ebullicin por 2 minutos (en bao mara). Observar la reaccin. d) Si en la reaccin existen azcares reductores con el reactivo de Fehling se formar un precipitado caf-rojizo (reaccin positiva) o por lo menos la solucin debe tomar sta coloracin. PRUEBA DE BIURET PARA IDENTIFICACIN DE PROTENAS: Es una prueba general para protenas y polipptidos de cadena no menor de tres unidades de aminocidos. a) Colocar una pequea porcin de la muestra en un tubo de ensayo y agregar 3 a 5 gotas de reactivo de Biuret. b) Observar la reaccin. Si en la muestra existen protenas se observar que el reactivo agregado adquirir una coloracin violeta (reaccin positiva). REACCIN XANTOPROTICA: Esta reaccin es positiva tanto en protenas en solucin como en estado slido y es mucho ms sensible cuando se encuentran perfectamente secas. a) A una pequea porcin de muestra agregar 1 ml de cido ntrico concentrado. b) Calentar y enfriar. c) Dejar resbalar por las paredes del tubo 1 ml de hidrxido de amonio concentrado sin agitar. d) La formacin de un anillo color naranja en la superficie indica la presencia de protenas en la muestra (reaccin positiva). PRUEBA PARA IDENTIFICAR CLORUROS: a) Colocar 1 ml de muestra en un tubo de ensayo. b) Agregar 5 gotas de solucin de nitrato de plata. c) Agitar y observar. d) La presencia de un precipitado blanco indica la presencia de cloruros. NOTA: Si el resultado de las pruebas anteriores es positivo indica que la sustancia se encuentra en la muestra que se est analizando, o de que no hay si es negativo. En el cuadro de reacciones de identificacin se indican las

51

caractersticas de los resultados de las pruebas para cuando son positivas y/o negativas. 5. Tomar cuatro muestras del agua destilada donde estuvo sumergida la pelcula de gel en tubos de ensayo numerados y efectuar las reacciones para las sustancias de la mezcla, anotando en cada caso, si la reaccin fue positiva y/o negativa de acuerdo con la informacin del cuadro que se presenta a continuacin: REACCIONES DE IDENTIFICACIN SUSTANCIA REACTIVOS REACCIONES POSITIVAS Glucosa Fehling Coloracin o precipitado cafrojizo Almidn Lugol Solucin color azul oscuro Albmina Xantoprotica Precipitado amarillo huevo Biuret Solucin violcea Cloruro sodio de Nitrato de plata Precipitado blanco REACCIONES NEGATIVAS Solucin del color del reactivo. Solucin del color del reactivo. Solucin del color de la albmina Solucin del color del reactivo. Solucin transparente incolora.

Informe de resultados En el siguiente cuadro anotar los resultados de las pruebas realizadas al agua donde se sumergi la pelcula de gel. PRUEBA Fehling Lugol Biuret Nitrato de plata Xantoprotica OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) De las sustancias utilizadas incluyendo el agua, decir cules son de alto peso molecular y de bajo peso molecular. Alto peso molecular Bajo peso molecular 2) Indicar qu sustancias se encontraban en ambos lados de la membrana de gel en el siguiente esquema: ANTES (POSITIVA Y/O DESPUS (POSITIVA NEGATIVA) Y/O NEGATIVA)

52

Interior

Exterior

3) Qu sustancias atravesaron la membrana de gel de afuera hacia adentro, as como de dentro hacia fuera? 4) Porqu dichas sustancias atravesaron la membrana? 5) Qu tipo de transporte se efectu a travs de la membrana durante el experimento? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 73-77 2. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 53-55 3. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 61-74 4. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 37-39 5. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 40-43

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 11 OSMOSIS EN PLANTAS OBJETIVO: Demostrar el fenmeno de smosis mediante un modelo fsico que simule este mecanismo en las clulas vegetales. FUNDAMENTO: 53

El fenmeno de smosis adems de mantener la consistencia de la planta, interviene en el transporte pasivo de materiales a travs de los tejidos vegetales. Las paredes celulares son membranas semipermeables que permiten el paso de agua pero restringen el paso de otro tipo de sustancias moleculares grandes. Las clulas de las plantas suelen ser hipertnicas con respecto a su medio circundante y por lo tanto, el agua tiende a difundirse hacia ellas. Este ingreso de agua en la clula vegetal, genera una presin dentro de ella contra la pared celular. La presin hace que la pared celular se expanda y que la clula se agrande. El alargamiento que ocurre, a medida que la clula de la planta madura, es consecuencia directa del movimiento osmtico de agua hacia la clula.(3) GENERALIDADES: El crecimiento de las clulas y el normal funcionamiento de los procesos fisiolgicos dependen de su turgencia (tensin de la membrana plasmtica debida a la presin interior), y sta depende de la capacidad de las clulas y tejidos de absorber agua del ambiente (Ver Fig. 11.1). Llamamos potencial hdrico de las clulas a su capacidad de absorber agua. En las clulas vegetales el potencial hdrico viene determinado por la interaccin entre los solutos (que lo bajan) y la presin ejercida por la pared celular (que lo sube).(4)

Figura 11.1 Movimiento molecular a travs de la membrana

Cuando una membrana separa una solucin o un coloide de un medio de distinta clase, sucede a menudo que algunas partculas presentes en cada uno de los lados de la membrana no pueden atravesarla. La permeabilidad selectiva o semipermeabilidad de las membranas celulares da por resultado un tipo especial de difusin llamado smosis, que implica el movimiento de molculas del solvente a travs de una membrana semipermeable de una zona de potencial hdrico alto a una zona de potencial hdrico bajo. En el caso de movimiento de agua al interior de una clula vegetal, la smosis implica una combinacin de difusin a travs de la bicapa de la membrana y flujo de masas a travs de los poros de la membrana. Esos poros estn formados por aquaporinas, protenas integrales que forman

54

canales selectivos al agua a travs de la membrana. La smosis es un proceso pasivo, por lo tanto no utiliza energa metablica.(5) La smosis es un fenmeno que debe cumplir ciertos requisitos: Movimiento neto de agua, esto es, que molculas de agua masivamente se desplacen de un compartimiento a otro, provocando un flujo de agua.

Atravesar una membrana, el movimiento de las molculas de agua se debe producir a travs de una membrana que limita (por lo menos) dos espacios o compartimentos, con soluciones acuosas de diferente concentracin. Esto es que en un compartimiento hay ms solutos que en el otro en relacin al agua. La caracterstica principal de la membrana es que permite el paso del las molculas de agua, pero no de otras sustancias osmticamente activas (solutos). Este tipo de membranas se denominan membranas selectivamente permeables. La permeabilidad selectiva est determinada por diferentes factores (carga elctrica, polaridad, presencia de canales, etc.). El gradiente transmembrana, implica una diferencia en la concentracin de la solucin acuosa a ambos lados de la membrana (compartimentos), y esto es lo que produce el movimiento de agua desde la zona de menor concentracin de solutos (y alta concentracin de agua) a la de mayor concentracin de solutos (y baja concentracin de agua). Consecuencia de la tendencia intermolecular (afinidad) del agua y de sustancias osmticamente activas a agruparse entre s uniformemente. La smosis cesa cuando las concentraciones de ambos espacios se igualan (se vuelven isotnicos) y el gradiente transmembrana es nulo, ello implica que se detiene el flujo neto de agua. (2)

El movimiento molecular y la tendencia agregativa de las molculas de agua y soluto ocurren siempre. La condicin aqu es la permeabilidad selectiva, pues como la membrana slo permite el paso del agua, es el agua la que tiene libertad de desplazamiento, ya que los solutos quedan retenidos en su compartimiento.(1) MATERIAL: Navaja de un solo filo o de doble filo u horadador. Frasco de boca ancha. Tapn de hule con orificio. Tubo de vidrio de 15 centmetros aprox. Palillos para dientes. Vasos de precipitado. Papel absorbente. Balanza granataria. MATERIAL BIOLGICO: Papa grande. 55

 Miel de abeja. REACTIVOS: Solucin de almidn al 1%. Solucin de glucosa al 30%. TCNICA: 1. Realizar un corte en uno de los extremos de la papa del tamao del tapn de hule que se va a utilizar. 2. Quitar la pulpa dejando una capa delgada sin romper las orillas (5 mm aproximadamente). 3. En el lado contrario pelar y dejar la superficie lisa. Esta parte ser la que entre en contacto con el agua. 4. Llenar la papa con miel de abeja y coloca el tapn con el tubo de vidrio, haz un poco de presin hasta que la mezcla suba ligeramente por el tubo. 5. Ahora coloca la papa dentro del frasco embonndola sin romper, si no puede sostenerse as, colocarle transversalmente los palillos para dientes por debajo del tapn de hule para sostenerla dentro del frasco. Llena el frasco con agua y coloca la papa en el frasco de manera que la parte superior quede afuera del agua. 6. Marcar el tubo de vidrio donde se encuentre el nivel de la miel al comienzo del experimento. Djalo en reposo durante 48 horas aproximadamente y al cabo de este tiempo marca el nivel final alcanzado por la miel. 7. Con el extremo que se le cort a la papa en el paso 1, realizar cortes en forma de tiras y mantener cubiertos con una toalla de papel hmedo. 8. Los cortes deben ser uniformes y deben pesarse. 9. Colocar por partes iguales en los vasos con las soluciones de almidn y glucosa. Anotar la hora en la cual se comenz e incubar durante 2 horas. 10. Retirar las rodajas y quitar el exceso de agua con una toalla absorbente, anotar los cambios en textura y peso, realizando una tabla. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1. Por qu subi la miel a travs del tubo? 56

2. 3. 4. 5.

Qu es la presin osmtica? Qu es un osmmetro? Dibuja uno. Qu cambios fsicos se observaron en las rodajas de papa? Qu variacin hubo con respecto al peso?

FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Jimnez, L. 2003. Biologa celular y molecular. Mxico D.F. Pearson Educacin. Segunda edicin. Editorial Prentice Hall. Pgs. 82-86 2. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 110-112 3. Oram, R. 2002. Biologa. Sistemas vivientes. Mxico D.F. Primera edicin. Compaa editorial continental. Pgs. 94-95 4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 68-70 5. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pg. 38

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 12 PLASMOLISIS EN PLANTAS OBJETIVO: Observar el fenmeno de plasmlisis en clulas vegetales y comparar la morfologa de una clula turgente normal con la de una clula plasmolizada. FUNDAMENTO:

57

Dentro de su pared de celulosa, la clula vegetal posee una o varias vacuolas grandes de savia celular. Esta savia es una solucin de distintas sales, azcares, y otras sustancias orgnicas en agua. Las membranas plasmticas y vacuolas que separan la savia celular del lquido fuera de la clula, son de permeabilidad diferencial, pues el agua las atraviesa mucho ms fcilmente que las sales. Los iones inorgnicos y molculas orgnicas atraviesan estas membranas con mucha menor facilidad. Cuando la concentracin de sales es mayor en la savia celular que en el lquido externo, lo que suele ser normal, el agua tiende a entrar, pues pasa por difusin de una regin de alta concentracin a otra de concentracin baja. Esta adicin de agua distiende la vacuola y presiona el citoplasma contra la pared externa de celulosa. La pared de celulosa por ser ligeramente elstica resulta distendida por la presin interna. Cuando ha entrado en la clula cierta cantidad de agua se alcanza un equilibrio, en el cual la presin ejercida por la pared celular distendida es igual a la presin ejercida por la savia celular. Por lo que la cantidad de molculas de agua que entran a la vacuola es igual a las que salen y as, el volumen total de la savia celular es constante.(1) GENERALIDADES: Si una clula provista de pared es sumergida en una solucin hipertnica, pierde agua, la cual pasa a su entorno. Su contenido se contrae, y la membrana plasmtica se separa de la pared celular, proceso denominado plasmlisis (Ver Fig. 12.1). La pared celular relativamente rgida de clulas vegetales, algas, bacterias y hongos les permite soportar sin estallar un ambiente externo muy diludo, con concentraciones muy bajas de solutos. Debido a las sustancias disueltas en el citoplasma, las clulas son hipertnicas respecto a su entorno.(3)

Figura 12.1 Fenmeno de plasmolisis

58

El agua pasa a las clulas por smosis, con lo que llena las vacuolas centrales y distiende las clulas. Estas se hinchan, con lo que se acumula la llamada presin de turgencia, contra la pared celular rgida de celulosa. Esta ltima puede estirarse muy poco, de modo que se alcanza un estado de equilibrio dinmico en que la resistencia de la pared celular al estiramiento impide cualquier incremento adicional en el tamao celular y no ocurre movimiento neto de molculas de agua hacia el interior de las clulas.(2) La presin de turgencia en las clulas es un factor de sostn importante para el cuerpo de plantas no leosas. La presin de turgencia es aquella que es ejercida por el contenido de la clula contra la pared celular. Ahora si el lquido fuera de la clula es de ms concentracin de sales que la savia celular, como al colocar la hoja de lechuga en solucin salina concentrada (hipertnica), sale de la clula el agua de la savia. Finalmente, el contenido celular ya no ejerce presin contra la pared celular. La presin de turgencia es nula y la clula vegetal se ha marchitado. Cuando el volumen de la savia celular disminuye por prdida de agua, la clula ya no es comprimida contra la pared de celulosa, se retrae alejndose de dicha pared, a esto es, lo que se conoce como fenmeno de plasmlisis (Ver Fig. 12.2).(3)

a) Antes Figura 12.2 Plasmolisis 40x

b) Despus

MATERIAL: Microscopio compuesto. Vaso de precipitado de 500 ml. Cajas petri. Gotero. Navaja de un solo filo o de doble filo. Pinzas de diseccin. MATERIAL BIOLGICO: Hojas de lechuga recin cortadas. REACTIVOS: Solucin saturada de sal. TCNICA: 1. Cortar un fragmento de tejido vegetal, en este caso la hoja de lechuga que trajiste y obsrvalo al microscopio haciendo una preparacin fresca. Es conveniente de que realices un esquema de las clulas que ests 59

observando, para que puedas hacer la comparacin con las clulas plasmolizadas. 2. En un vaso de precipitado de 500 ml prepara una solucin salina saturada agregando en un poco de agua sal hasta que se forme un precipitado que ya no pueda disolverse. 3. Con un gotero tomar un poco de sta solucin y colcala en la caja petri. Corta nuevamente un pedazo de lechuga y colcalo en la solucin, la cual es hipertnica con respecto a la clula. Djala unos minutos reposando y scala. 4. Observa al microscopio y describe la morfologa de las clulas en comparacin con las que observaste en el paso 1. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Qu es turgencia? 2) Las clulas animales tambin son turgentes? Por qu? 3) A qu se debe que las molculas como las sales atraviesan la membrana celular con menor facilidad? 4) Es lo mismo turgencia y plasmolisis? Explique. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 49-52 2. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pg. 70 3. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 201-202

60

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 13 OBSERVACIN DE PLASTOS Y ESTOMAS OBJETIVO: Observar los diferentes plstidos que integran a las clulas vegetales, as como tambin identificar los estomas presentes en las clulas de origen vegetal. FUNDAMENTO: Las superficies de hojas y otros vegetales expuestas estn cubiertas con una capa impermeable que ayuda a impedir la prdida excesiva de vapor de agua. De este modo, la entrada y salida de gases se limita a poros diminutos, denominados estomas, que suelen contraerse en las caras inferiores de las hojas.

61

Tales aberturas conducen al interior de la hoja, constitudo por una capa de clulas que contienen cloroplastos llamada mesfilo, con muchos espacios areos y muy alta concentracin de vapor de agua.(2) GENERALIDADES: Las clulas epidrmicas estn bien adaptadas para proteger las clulas subyacentes y disminuir las perdidas de agua, pero sin impedir del paso de la luz. Sobre toda la superficie epidrmica hay repartidos poros pequeos llamados estomas, cada uno rodeado por dos clulas de proteccin (Ver Fig. 13.1). Estas clulas, al cambiar su forma, pueden modificar el tamao de la abertura y regular as la salida de agua y el intercambio de gases. A diferencia de otras clulas epidrmicas, las clulas de proteccin contienen cloroplastos. Hay de 50 a 500 estomas por mm2 de hoja; son mucho ms numerosos en la superficie inferior, en las hojas de casi todas las especies.(1)

Figura 13.1 Estomas

Las clulas de proteccin en forma de haba poseen paredes ms gruesas hacia el lado del estoma que hacia los otros. En general, los estomas se abren en presencia de luz y se cierran en la oscuridad, la abertura y cierre son regulados por cambios de la presin de turgencia en el interior de las clulas de proteccin. El aumento de la presin de turgencia cambia las paredes externas, y curva las internas, separando unas de otras y creando la abertura del estoma entre ellas. Cuando disminuye la presin de turgencia en las clulas de proteccin, las paredes internas, elsticas, recuperan su forma original y la estoma se cierra (Ver Fig 13.2).(2)

Figura 13.2 Movimiento del estoma

El mecanismo que aumenta la presin de turgencia es complejo, e implica en parte la produccin de glucosa y otras sustancias osmticamente activas por fotosntesis en las propias clulas de proteccin. Los plastos son

62

estructuras citoplasmticas unidas que se encuentran en las clulas de las plantas superiores y en ciertos organismos unicelulares, pero nunca en las clulas de animales superiores. Aunque su tamao, forma y color pueden variar de manera considerable, segn el tejido de que se trate, del organismo y de las condiciones de desarrollo, a menudo se presentan en forma de cuerpecillos discoides o esfricos que se encuentran libremente en el citoplasma. Los plastos estn agrupados generalmente en dos clases: los incoloros o leucoplastos y los pigmentados o cromoplastos. Los primeros se encuentran a menudo en las plantas que no estn expuestas a la luz e intervienen en la formacin y almacenamiento de grnulos de almidn y gotas de grasa.(3) Los cloroplastos de las clulas vegetales son estructuras aplanadas cuya longitud promedio alcanza 7 m y 3-4 m de ancho. Cada cloroplasto est rodeado por una membrana lisa. Dentro de la membrana exterior se hala una segunda membrana interior y una matriz lquida denominada estroma. La membrana interior se pliega de acuerdo con un patrn intrincado. Prolongaciones de la membrana interior se pliegan y unen en pares denominados lamelas. Peridicamente, las lamelas se dilatan y forman vesculas aplanadas membranosas denominadas tilacoides. Estas se amontonan a manera de apilamientos de monedas. Tales apilamientos o conglomerados de tilacoides reciben el nombre de grana. Las membranas, al igual que otras membranas de la clula, son capas biestratificadas de lpidos que contienen cantidades sustanciales de protenas intrnsecas. Entre tales protenas se encuentra una gran variedad de enzimas, tanto enzimas citocrmicas como enzimas sintetizadoras de ATP. Las membranas de los cloroplastos contienen tambin la clorofila y algunos carotenoides (Ver Fig. 13.3).

63

Figura 13.3 Cloroplasto

La clorofila es una molcula anfiptica, siendo su cadena hidrocarbonada fitol fuertemente hidrofbica, mientras parte del anillo porfirnico es hidroflico. Posiblemente la cadena fitlica y parte del anillo porfirnico estn embebidos en el lpido biestratificado y el resto del anillo porfirnico se proyecta hacia arriba. Los carotenoides son molculas fuertemente hidrofbicas y se supone que se encuentran totalmente sumergidas en el lpido biestratificado.(2) El estroma del cloroplasto es rico en enzimas, contiene tambin ADN y muchos ribosomas. Estos ribosomas son ms pequeos que los del citoplasma de la clula vegetal. La presencia de ADN permite explicar la peculiar anatoma de los cloroplastos. Los cloroplastos se originan ya sea por divisin de un cloroplasto en dos o por medio del desarrollo de una estructura incolora diminuta denominada proplstido. Para la conversin de los proplstidos en cloroplastos se requiere la presencia de luz. De ah el color plido de las plntulas que crecen en la oscuridad. Los proplstidos tiene la capacidad de autoreplicarse.

64

En efecto, esta es la nica manera de que pueden formarse nuevos proplstidos. Los ncleos de las clulas vegetales no intervienen en la produccin de nuevos proplstidos. Por tanto, es importante que cuando las clulas vegetales sufran mitosis, cada clula hija reciba proplstidos en su citoplasma, de las mima manera que cada clula hija recibe el contenido cromosmico del ncleo.(1) MATERIAL: Portaobjetos. Cubreobjetos. Frasco gotero con agua. Microscopio compuesto. Navaja de un solo filo o de doble filo. MATERIAL BIOLGICO: Epidermis de limn y/o nopal. Ptalos de flores (colores y blancos). Hojas recin cortadas. Manzana. REACTIVOS: Lugol de gram. TCNICA: 1. Realizar un corte en la epidermis del limn y/o nopal procurando que sea lo ms delgado posible y hacer lo mismo con el resto de las muestras. 2. Colocar el corte sobre un portaobjetos y agrgale una gota de lugol procediendo posteriormente a colocarle el cubreobjetos. 3. Observar al microscopio la preparacin y realiza dibujos de lo que observes. Identificar si se trata de cloroplastos, leucoplastos o cromoplastos. 4. Utilizando la navaja, corta una porcin muy delgada de la superficie inferior de la hoja recin cortada, al igual que de la hoja de lechuga fresca. 5. Colocar la porcin de las hojas en portaobjetos limpios y aadirles una gota de agua a cada portaobjetos y colocarles un cubreobjetos respectivamente. 6. Observar al microscopio utilizando diferentes aumentos. 7. Realizar dibujos de lo observado. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: Figura 13.2 Cloroplastos

65

CUESTIONARIO: 1) Qu color toman los cloroplastos con el lugol y porqu? 2) Cmo regulan las clulas protectoras las aberturas y los cierres de los estomas? 3) Existe alguna relacin entre la apertura y cierre de los estomas con la fotosntesis? 4) Realiza un dibujo de un estoma poniendo en evidencia la circulacin de agua y dixido de carbono. 5) Qu es un ostiolo? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 67-68, 364, 372-373 2. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pg. 54 3. Young, G. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 74-75

66

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 14 FOTOSNTESIS OBJETIVO: Observar el fenmeno de fotosntesis a travs del montaje de un dispositivo artificial. FUNDAMENTO: La fotosntesis es el proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energa que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jvenes de pigmentos capaces de captar la energa qumica. Esta transforman en sus hojas a las sales minerales y el agua por intervencin del bixido de carbono (CO2) en sustancias orgnicas sencillas que despus pasan a formar la glucosa y finalmente el almidn desprendiendo oxgeno (O2) El aporte de energa en los tejidos vivos procede de la conversin de glucosa en bixido de carbono y agua para formar ATP (Ver Fig. 14.1).(2)

Figura 14.1 Fotosntesis

GENERALIDADES: Los pigmentos que pueden ser encontrados en las hojas, los cuales captan la energa qumica son:

La clorofila, que se encuentra en los cloroplastos de cada clula. Este pigmento es indispensable para que se lleve a cabo la fotosntesis. Los carotenos, es un pigmento amarillo anaranjado que se encuentra en ciertas clulas vegetales y da su color a la zanahoria. Las xantfilas, son unas sustancias cristalinas de color amarillo oscuro, que se encuentra juntamente con la clorofila en los cloroplastos de las plantas.(4)

67

En la fotosntesis se reconocen dos fases sucesivas: una dependiente de la luz o reacciones luminosas (fase luminosa) y otra que no depende de ella, reacciones oscuras (fase oscura) (Ver Fig. 14.2).

Figura 14.2 Mecanismo de la fotosntesis

En la fase luminosa, la luz que incide (fotones) es absorbida por la clorofila a la que excita, provocando que sta libere electrones cargndose as positivamente. Por cada fotn de luz se libera un electrn. Simultneamente los fotones provocan la ruptura de la molcula del agua (fotlisis) en dos subproductos: oxgeno, que se libera al medio y los protones (H+). Los electrones liberados por la clorofila activada son captados por los protones a travs de unos transportadores, de manera que se forma el hidrgeno molecular (H2) que se utiliza para que la molcula de NADP (Nicotidamina adenina dinucletido) se reduzca a NADP2. Los protones que se acumulen en el estroma pueden comportarse como enzimas activas catalizando la formacin de molculas de ATP a partir de ADP y P. En resumen: en la fase luminosa de la fotosntesis el impacto de los fotones de luz sobre la clorofila y la fotolisis del agua son el origen de un estado de desequilibrio molecular (fenmeno qumico) que se reequilibra constantemente gracias al flujo de protones a travs de la membrana de los tilacoides (fenmeno fsico). La fase oscura es indiferente a la presencia de luz y sus reacciones tienen lugar en el estroma de los cloroplastos. En ella se utiliza la energa qumica almacenada en el ATP y el poder reductor del NADPH 2, sintetizados en la fase luminosa, para la fijacin del O2 atmosfrico. ste es incorporado a una molcula de 5 tomos de carbono: la ribulosa 1-5 difosfato que abunda en el estroma. El resultado, tras una molcula inestable de 6 tomos de carbono, es el cido 3-fosfoglicrico.(3)

MATERIAL: 1 Popote. 2 matraces de 125 ml con su respectivo tapn de hule no horadado.

68

MATERIAL BIOLOGICO: Elodea (Elodea canadensis; planta acutica). REACTIVOS: Agua mineral de cualquier marca. Azul de bromotimol. TCNICA: 1. Colocar una gota de azul de bromotimol en un matraz de 125 ml (matraz 1). 2. Diluir con agua carbonatada el azul de bromotimol y observar la coloracin. Anotando en el cuadro de resultados (Nota: Tapar el matraz hermticamente con el tapn de hule para evitar fugas de dixido de carbono).(Observar esquema en el catalogo de imgenes) 3. Colocar en otro matraz (matraz 2), una gota de azul de bromotimol y diluir con agua (Nota: el pH del agua con que se trabaja debe tomarse en cuenta ya que modificar los resultados, en este caso debe ser neutra o ligeramente alcalina). 4. Soplar con un popote dentro del agua hasta cambio de coloracin. Tapar el matraz. Anotar observaciones. 5. Colocar dentro de ambos matraces una ramita de Elodea, taparlos nuevamente y esperar de 30 a 60 minutos. 6. Realizar observaciones con dibujos.

Llenar el siguiente cuadro con los resultados obtenidos: Matraz 1 Agua carbonatada Azul de bromotimol Planta acutica OBSERVACIONES CON DIBUJOS CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Qu indica el color de la solucin del matraz 1 del experimento? 2) Anotar la reaccin qumica que se lleva a cabo en el matraz 2 debido a la cual se da el cambio de coloracin. Debajo de la reaccin anotar el nombre de cada una de las sustancias. 3) Qu compuesto est presente en la solucin del matraz 2 el cual es responsable del cambio de coloracin? 4) Qu sucede en las soluciones de ambos matraces con la presencia de la planta acutica? Matraz 2 Con aire exhalado

69

FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial Continental. Pgs. 97-102 2. Cooper, G. 2002. La clula. Segunda edicin. Editorial Marbn. Pgs. 131-136 3. Nason, A. 1990. El mundo biolgico. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Limusa. Pgs. 185-187, 371-377 4. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 79-86

70

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 15 ELABORACIN DE ALMIDN EN LAS PLANTAS VERDES OBJETIVO: Verificar si la energa que la hoja de geranio recibe se distribuye uniformemente y permite que haya fotosntesis en toda la hoja cuando solo una parte de ella es iluminada por la luz solar. FUNDAMENTO: Las hojas contienen pigmentos que estn asociados con la produccin de almidn, sustancia de reserva insoluble producto de la fotosntesis. Para su elaboracin se necesita energa, y la fuente de sta es el sol. El almidn es la sustancia con la que las plantas almacenan su alimento en races, tubrculos, frutas y semillas. Pero, no slo es una importante reserva para las plantas, tambin para los seres humanos tiene una alta importancia energtica, proporciona gran parte de la energa que consumimos los humanos por va de los alimentos. El almidn se diferencia de los dems hidratos de carbono presentes en la naturaleza en que se presenta como un conjunto de grnulos o partculas. Estos grnulos son relativamente densos e insolubles en agua fra, aunque pueden dar lugar a suspensiones cuando se dispersan en el agua. Suspensiones que pueden variar en sus propiedades en funcin de su origen. (3) GENERALIDADES: Los azcares, almidones y celulosa son carbohidratos. Los azcares y los almidones sirven como fuentes de energa para las clulas, en tanto que la celulosa es el componente estructural principal de las paredes que rodean a las clulas vegetales. Los carbohidratos se componen de tomos de carbono, hidrogeno y oxgeno en proporcin aproximada de un tomo de carbono por dos de hidrogeno y uno de oxgeno. El almidn, que es la forma habitual de carbohidrato empleado para almacenamiento de energa en las plantas, es un polmero consistente en subunidades de -glucosa. Los monmeros estn unidos por enlaces 1-4 , lo cual significa que el carbono 1 de una glucosa est unido al carbono 4 de la siguiente glucosa en la cadena. El almidn tiene dos formas, amilasa y amilopectina. La primera, ms sencilla, no est ramificada, en tanto que la amilopectina, que es ms frecuente, suele consistir en alrededor de 1000 unidades en una cadena ramificada (Ver Fig. 15.1).(4)

71

Figura 15.1 Estructura del almidn

Los vegetales almacenan almidn principalmente en la forma de grnulos dentro de organelos especializados llamados amiloplastos. Cuando se requiere energa para realizar trabajo celular, la planta hidroliza el almidn, con lo que se libera las subunidades de glucosa. Seres humanos y otros animales que comen alimentos vegetales cuentan con enzimas para realizar dicha hidrlisis.(1) Tambin existe un almidn vegetal o glucgeno como se le llama, que es la forma en la que la glucosa se almacena en los tejidos animales. Su estructura es similar a la del almidn, aunque est ms ramificado y es ms hidrosoluble. El glucgeno se almacena sobre todo en las clulas del hgado y msculos. (2) MATERIAL: Tubos de ensayo 13 x 100 mm. 1 vaso de precipitado. Parrilla. Aluminio. Papel peridico. Tijeras. Clips. Caja de petri. Pinzas. Recipiente para bao mara. Papel absorbente. MATERIAL BIOLGICO: Planta de geranio (Pelargonium grandiflorum) (capote). REACTIVOS: Alcohol etlico al 95%. Lugol. TCNICA: 1. Realiza pequeos recortes con el aluminio y colcalos sobre las hojas del geranio, sujetndolos con los clips. Cubre la planta con el papel peridico y gurdala al abrigo de la luz un par de das.

72

2. Transcurrido este tiempo, saca la planta, qutale el papel peridico y exponla a la luz solar durante un par de horas. 3. Quita los pedazos de aluminio y corta las hojas.

4. Extraer la clorofila hirvindolas a bao mara en el alcohol etlico hasta total decoloracin 5. Escurre las hojas y sumrgelas en el lugol durante medio minuto.

6. Transcurrido el tiempo, retira las hojas y colcalas sobre papel absorbente, procurando extenderlas perfectamente, coloca otro papel encima de ellas, adems algo pesado para evitar que se deformen. 7. Una vez seca la hoja, observa los pequeos puntos negros distribuidos en la superficie de la hoja. Basndose en las evidencias obtenidas en este experimento, establece un enunciado sobre el efecto de la luz en el proceso de fotosntesis. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cul es la estructura qumica del almidn? 2) Cul es la funcin del almidn en las plantas? 3) Qu funcin tiene el lugol en esta practica? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Campbell, N. 2005. Biology. Mxico D.F. Sptima edicin. Editorial Pearson-Benjamin Cummings. Pgs. 103-104 2. Lodish, H. 2005. Biologa celular y molecular. Mxico D.F. Quinta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 77-79 3. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 92-93 4. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 89-91 5. El rincn de la ciencia. Abril 2003. M.A. Gmez. http://centros5.pntic.mec.es/ies.victoria.kent/Rincon-C/Curiosid/Rc-58.htm

73

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 16 PRESENCIA DE GLUCOSA EN LAS HOJAS DE LAS PLANTAS VERDES OBJETIVO: Demostrar la presencia de glucosa en las hojas de las plantas verdes utilizando el reactivo de Fehling para identificacin de azcares reductores. FUNDAMENTO: Cada hoja es un rgano de nutricin especializado, cuyo papel es la fotosntesis. A la luz solar una planta puede producir 20 veces ms alimento del que gasta por unidad de tiempo. En otros momentos, durante la noche o el invierno consumen ms alimento del que producen. Cada planta acumula reservas de alimentos para resistir los periodos en los cuales no hay fotosntesis (Ver Fig. 16.1). (3)

Figura 16.1 Mecanismo de fotosntesis

Existen varias sustancias que se utilizan para demostrar la presencia de azcares, una de ellas es la solucin de Fehling, que al combinarse con ellos cambia de color, variando desde un tono amarillento hasta un color rojo ladrillo, lo cual depende de la cantidad de azcares presentes. GENERALIDADES: La glucosa, el monosacrido ms abundante, es utilizado por la mayor parte de los organismos como fuente de energa. Durante la respiracin celular, las clulas oxidan molculas de glucosa y convierten la energa almacenada a una forma fcil de utilizar en sus actividades. La glucosa tambin es componente de la sntesis de otros tipos de compuestos, como aminocidos y cidos grasos; su importancia en el metabolismo es tal que su concentracin se mantiene cuidadosamente en valores homeostticos en la sangre de seres humanos y otros animales complejos.(1) La glucosa y la fructuosa son ismeros estructurales, o sea que poseen frmula molecular idntica, pero sus tomos estn dispuestos de manera

74

distinta, la glucosa tiene depsitos en hojas, tallos o races. Las hojas son depsitos momentneos de los alimentos, poco adecuados para los periodos prolongados, pues se pierden rpidamente.(5) Gran parte de la glucosa producida en un da es convertida en almidn y almacenada en las hojas. El almidn es hidrolizado subsecuentemente de nuevo a glucosa, la cual es translocada en el floema al tallo y races. El movimiento de sustancias alimenticias en el floema depende de la actividad metablica de las clulas del floema. Una variedad de pruebas que penetran en forma de solutos que se mueven en soluciones, que a su vez se movilizan debido a diferencias en el potencial hdrico, causado por gradientes de concentracin de azcar y otros productos de fotosntesis y agua. Esto aumenta la presin dentro de las clulas del floema y tiende a empujar lquido de una clula a la adyacente, a esta hiptesis se le conoce como de presin de flujo.(2) MATERIAL: Mortero. Bao mara Pinzas para tubo de ensayo. Mechero Tubos de ensayo de 15 x 125 mm. Embudo mediano. Vaso de precipitado de 500 ml. Vaso de precipitado de 250 ml. Agitador de vidrio. Gasa. Pipeta de 5 ml. MATERIAL BIOLGICO: 6 7 hojas verdes de espinacas. REACTIVOS: Solucin de Fehling A Solucin de Fehling B. TCNICA: 1. Triturar perfectamente las hojas de espinacas en el mortero, posteriormente del triturado, colocarlas en un vaso de precipitado de 500 ml. 2. Agregar agua corriente suficiente para cubrir el triturado y agitar hasta que obtengas una mezcla uniforme, cuidando que la mezcla no te quede muy diluida, deber quedar semilquida. 3. Filtrar la mezcla en el segundo vaso de precipitado, esta filtracin la debers de hacer con la gasa para que sea un poco ms rpido y no tenga restos de las hojas que trituraste.

75

4. Listo ya el filtrado, toma de 3 a 4 ml, del mismo agregndolo al tubo de ensayo que debers tener listo. A este filtrado le debers agregar 2 ml de solucin de Fehling (1 ml de solucin de Fehling A y 1ml de solucin de Fehling B). Agitar vigorosamente durante aproximadamente un minuto. Esto es con el fin de mezclar perfectamente tu muestra. 5. Proceder a calentar el tubo hasta ebullicin, cuidando de que no te vaya a saltar la muestra, y sufras algn tipo de quemadura. Mantn la muestra durante algunos minutos hasta que observes que el cambio de color se estabiliza. 6. Observa qu coloracin toma tu muestra y con la tabla de comparacin, establece si hay presencia de glucosa (porcentaje) a partir de las hojas que trituraste. 7. Realiza dibujos de lo que observaste en los tubos de ensayo con su cambio de coloracin antes y despus. TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS (GLUCOSA) EN LAS HOJAS DE LAS PLANTAS VERDES SEGN BIURET, BENEDICT Y FEHLING. INTENSIDAD DE COLOR Color verde, precipitado verde o amarillo. 50 ++ Color amarillo a verde, precipitado amarillo. 75 +++ Color amarillo anaranjado, precipitado amarillo a naranja. 100 ++++ Color amarillo rojizo, precipitado rojo ladrillo o rojo Negativa: Color azul claro (Puede formarse un precipitado amarillo). Trazas: Color verde azulado. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Para qu utilizan la glucosa los seres vivos? 2) Cmo est integrada la solucin de Fehling y cul es su utilidad? 3) Cul es la funcin del tejido vascular en una planta? 4) Cmo est integrado el tejido vascular en las plantas? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial Continental. Pgs. 87-91 % DE GLUCOSA 25 POSITIVIDAD +

76

2. Ondarza R. 2000.Biologa moderna: la clula, bioqumica, gentica y biologa molecular, biologa general. Mxico D.F. Dcima edicin. Editorial Trillas. Pgs. 92-94 3. Oram, R. 2002. Biologa. Sistemas vivientes. Mxico D.F. Primera edicin. Compaa editorial continental. Pgs. 103-104 4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 892-893 5. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 92-95 6. Heidcamp, W. H. Cell Biology Laboratory Manual. http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html

77

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 17 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL DE ORGANELOS CELULARES OBJETIVO: Realizar un fraccionamiento celular e identificar en ste los organelos de clulas animales. FUNDAMENTO: Las clulas eucariontes tienen organelos celulares delimitados por una sola membrana. Todos ellos pueden ser separados utilizando mtodos de centrifugacin diferencial y por gradientes de densidad. Dado que la mayora de los organelos tienen diferente peso molecular, viscosidad o densidad. Existen diversos tipos de purificacin de organelos, uno de ellos es la ultracentrifugacin, que consiste en separar las clulas u organelos presentes en una mezcla celular sometindola a una fuerza centrifuga. Mediante una ultracentrfuga se alcanzan velocidades de ms de 100 000 rpm, para generar una fuerza centrifuga de 500 000 G; con lo cual se logra separar a la mezcla en dos porciones.(2) GENERALIDADES: Las membranas tienen propiedades nicas que permiten a los organelos membranosos realizar una amplia variedad de funciones. Las membranas celulares nunca tiene extremos libres; as, un organelo membranoso siempre contiene cuando menos un espacio interno cerrado o compartimiento. Estos compartimientos rodeados por membrana permiten que determinadas actividades celulares se localicen dentro de regiones cerradas especficas de la clula. Los reactivos que se concentran en solo una pequea parte del volumen celular total tienen mucha mayor probabilidad de entrar en contacto, y la velocidad de reaccin puede aumentar en grado notable. Los compartimientos rodeados por membrana tambin mantienen determinados compuestos reactivos alejados de otras partes de la clula que podran verse afectadas adversamente por ellos.(1) Los procedimientos de fraccionamiento celular son mtodos de purificacin de organelos. En general, se fraccionan las clulas con la mayor suavidad posible y la mezcla, llamada extracto celular, se somete a fuerza centrfuga para hacerla girar en un dispositivo llamado centrfuga (Ver Fig. 17.1). Tal fuerza separa el extracto en dos fracciones: un comprimido y un sobrenadante. El comprimido, que contiene los materiales ms pesados densamente compactados, se forma en el fondo del tubo. El sobrenadante, o sea el lquido que queda encima del comprimido, contiene las partculas ms ligeras, molculas disueltas, e iones.

78

Figura 17.1 Ultracentrifugacin

Es posible volver a centrifugar el sobrenadante a una mayor velocidad para obtener un comprimido que contenga los siguientes componentes celulares ms pesados, por ejemplo mitocondrias y cloroplastos. En la centrifugacin diferencial, el sobrenadante se hace girar a velocidades cada vez mayores, lo cual permite separar diversos componentes celulares con base en sus diferentes tamaos y densidades. Los componentes celulares de los comprimidos pueden ser puestos de nuevo en suspensin y purificarse an ms por centrifugacin en gradiente de densidad. En este procedimiento, el comprimido resuspendido se coloca en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad, por lo comn constituido por una solucin de sacarosa y agua. La concentracin de sacarosa es mxima en el fondo del tubo y disminuye en forma gradual, hasta hacerse mnima en la parte superior. Como la densidad de los organelos difiere, cada uno de stos emigrar durante la centrifugacin y formar una banda en la posicin del gradiente en que su densidad iguale la propia de la solucin de sacarosa. Los organelos purificados pueden ser objeto de examen para determinar qu tipo de protenas y otras molculas contienen, as como la naturaleza de las reacciones qumicas que ocurren en ellos.(4) MATERIAL: Centrifuga. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Pipetas graduadas. Vasos de precipitado. Mortero con pistilo. Pipeta pasteur. Microscopio Licuadora 79

Portaobjetos Cubreobjetos

MATERIAL BIOLGICO: Hgado de pollo fresco. REACTIVOS: Buffer de separacin (buffer de fosfatos 10mM y de cloruro de sodio 0.15 M, KCl 3.3 mM y MgCl 2.6 mM a pH 7.4) Gradiente de sacarosa 25 M Verde janus Azul de bromotimol TCNICA: Tcnica para centrifugacin celular. Fraccionamiento celular. 1. El hgado se enjuaga con agua de la llave y se coloca en un vaso de precipitado, que contenga 20 ml del medio de extraccin, se desmenuza con las tijeras remplazando de 2 a 3 veces el medio. 2. Se vierte el contenido del vaso en una licuadora y se lica. Pasar a los tubos y centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y guardarlo. 3. A la fraccin obtenida, se le agrega buffer en proporcin 1:4 (colocar 4 veces el volumen de la fraccin obtenida de buffer) y se guarda para hacer las observaciones de los organelos. Observacin de mitocondrias: el sobrenadante que se obtuvo de la centrifugacin anterior, pngalo a centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos. Quite el sobrenadante y no lo tire, el sedimento contiene las mitocondrias, resuspenda con buffer en proporcin 1:4. tome 0.1 ml y se tie con 1 ml de verde janus por 10 minutos y se observa al microscopio buscando en seco fuerte la estructura (bastoncillos de color verde) y despus observando con el objetivo de inmersin. Observacin de uricosomas: El sobrenadante de la centrifugacin anterior se vuelve a centrifugar aproximadamente 20 minutos a 7000 rpm. El sedimento presuntamente contiene las uricosomas, el cual debe resuspenderse suavemente con buffer con la proporcin 1:4. colocar el un portaobjetos con una gota de azul de bromotimol y observar al microscopio buscando en seco fuerte la estructura (bastoncillos de color azul) y despus observando con el objetivo de inmersin. Observacin de lisosomas: Se centrifuga el sobrenadante anterior a 7000 rpm durante 30 minutos, el sobrenadante de la centrifugacin ser posible fuente de lisosomas. Colocar en un portaobjetos con una gota de azul de bromotimol y observar al microscopio

80

buscando en seco fuerte la estructura (bastoncillos de color azul) y despus observando con el objetivo de inmersin. Observacin de retculo endoplsmico: ste sistema microsomal, aparece en cualquiera de los sobrenadantes obtenidos anteriormente. Se coloca con una gota de azul de bromotimol y se observa al microscopio buscando en seco fuerte la estructura (fragmentos de color azul) y despus observando con el objetivo de inmersin. NOTA: >Guardar en refrigeracin para la siguiente sesin de laboratorio. Tcnica de gradiente de sacarosa: (tcnica alternativa) 1. En un tubo de ensayo se colocan 5 ml de sacarosa 25 M y se agrega la parte superficial 2 ml del extracto de heptico. 2. Se centrifuga a 7000 rpm durante 30 minutos. 3. Separe los gradientes que se formaron despus de la centrifugacin con una pipeta pasteur y se colocan en tubos graduados para medir el volumen. 4. Tomar una alcuota de cada uno de los gradientes y se tien con los colorantes respectivos para cada organelos. 5. Observar al microscopio buscando en seco fuerte la estructura y despus observando con el objetivo de inmersin, mantener los tubos a 4C. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Para la separacin de organelos celulares, Qu otras tcnicas existen? 2) Cules son los principios de la centrifugacin diferencial o ultracentrifugacin? 3) Cules son las ventajas y las desventajas de trabajar con clulas enteras o fraccionadas? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial Continental. Pgs. 122-125 2. Cooper, G. 2002. La clula. Segunda edicin. Editorial Marbn. Pgs. 17-24

81

3. Coutio, R. y Fernandez, S. 1997. Biologa celular. Manual de laboratorio experimental. Textos universitarios. Primera edicin. Pgs. 21-22 4. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 100-112

82

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 18 CATALASA: UNA ENZIMA PRESENTE EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES OBJETIVO: Identificar la presencia de la catalasa en diversos tejidos de origen animal y vegetal. FUNDAMENTO: La catalasa es una enzima oxidante que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua. Existe prcticamente en todas las clulas excepto en ciertas bacterias anaerobias. El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos, pero dada su toxicidad debe transformarse rpidamente en compuestos menos peligrosos. Para ello se usa con frecuencia esta enzima que cataliza su descomposicin. Adems la catalasa se usa en la industria textil para la eliminacin del perxido de hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de hidrgeno. La catalasa es una proteina tetrmero formada por cuatro subunidades idnticas (350,000 kD). Cada monmero contiene un grupo prosttico Hemo en el centro activo. En algunas especies tambin contiene una molcula de NADP por subunidad cuya funcin es proteger a la enzima de la oxidacin por su sustrato H2O2.(1) GENERALIDADES: Las enzimas son protenas catalizadoras producidas por las clulas vivas; regulan la rapidez y especificidad de las miles de reacciones qumicas intracelulares. Aunque las enzimas son sintetizadas dentro de las clulas, no tienen que estar en el interior de la clula para actuar como catalizador; muchas se han extrado de las clulas y as conservan su actividad completa. Pueden purificarse o cristalizarse para estudiar sus propiedades catalticas. Las reacciones reguladas por enzimas son fundamentales para todos los fenmenos vitales: respiracin, crecimiento, fotosntesis, contraccin muscular, conduccin nerviosa, fijacin de nitrgeno, desaminacin, digestin etctera.(2) Las enzimas suelen ser incoloras, pero las hay amarillas, verdes, azules, pardas o rojas. Casi todas ellas son solubles en agua o soluciones salinas diluidas, aunque algunas, por ejemplo, las de las mitocondrias, estn unidas por una lipoprotena y resultan insolubles en agua. El poder cataltico de algunas enzimas es en verdad extraordinario. Una molcula de catalasa, que contiene hierro, obtenida de hgado de res, logra el desdoblamiento de unos cinco millones de molculas de perxido de hidrogeno

83

(H2O2) por minuto a 0C. La sustancia sobre la cual acta la enzima se llama sustrato; en este caso, el perxido de hidrogeno es el sustrato de la enzima catalasa. (Ver Fig. 18.1).

Figura 18.1 Captacin de la catalasa

El nmero de molculas de sustrato sobre las cuales acta una molcula de enzima por minuto se llama nmero de recambio de la enzima; en particular el de la catalasa es de 5 000 000. Casi todas las enzimas tienen nmeros muy altos, lo cual explica que puedan ser tan activas, a pesar de que las cantidades son muy pequeas en la clula. El perxido de hidrogeno, txico, es un producto colateral de distintas reacciones enzimticas. La catalasa protege la clula al destruir el perxido.(3) El perxido de hidrogeno puede ser desdoblado nicamente por tomos de hierro, pero en este caso la velocidad disminuye. Se necesitaran unos 300 aos para que un tomo de hierro pudiera desdoblar el mismo nmero de molculas de H2O2 que una molcula de catalasa desdobla en un segundo.(2) MATERIAL: Navaja. Pinzas de diseccin. Probetas de 50 ml. Termmetro de 0-1000C. Mechero. Mortero. Tapn horadado. 84

 2 tubos de ensayo 15 x 125 mm. Toallas de papel. Guantes de ltex. Dispositivo para bao mara. Pinzas para tubo de ensayo. MATERIAL BIOLGICO: Diversos tejidos de origen animal como: hgado de res y de pollo, sesos de res, msculo, y tejidos vegetales como: hojas y races, espinacas, etc. REACTIVOS: Solucin de perxido de hidrgeno al 3%. TCNICA: 1. Se harn cortes de varios tejidos animales y vegetales debiendo anotar cuidadosamente su origen, evitando tocarlos con las manos porque se pueden contaminar con las sustancias de la piel del experimentador. 2. Con las pinzas de diseccin toma un fragmento de 1 cm2 aproximadamente de cada uno de los tejidos y colcalos en un pedazo de papel absorbente cuidando que los tejidos no se toquen entre s. Mrcalos para su identificacin. 3. En otro pedazo de papel toma cortes de tejidos iguales a los primeros, pero que hayan sido hervidos previamente. Manjalos tambin con las pinzas. 4. En dos tubos de ensayo limpios, coloca 5 ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3%. Toma una porcin de uno de los tejidos hervidos y otro del mismo sin hervir y colcalos en tubos de ensayo que contengan el perxido. 5. Observa y anota los resultados.

6. Tomar otro par de tubos y agrgales 5 ml de perxido de hidrgeno al 3% en cada uno. 7. Repite la operacin anterior con un par de porciones de otro tejido. Contina de esta manera hasta que se haya investigado todas las muestras de tejido. 8. Realiza otros cortes y tritralos en un mortero por separado. Enjuaga el mortero cada vez que se vaya a triturar un tejido distinto. 9. Colcalos en 5 ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3% en tubos de ensayo limpios y agrega una porcin de tejido. Observa y anota los resultados. Contina de esta manera hasta que se hayan investigado todas las muestras de tejido.

85

10. Se recomienda que los tubos se sujeten con las pinzas para tubo de ensayo, para evitar la transferencia de calor y por lo tanto la activacion del peroxido de hidrogeno. 11. Armar el calorimetro como lo muestra la figura 18.2 y colocar en el 10 ml de perxido de hidrgeno al 3% en la cmara de reaccin, moja el bulbo del termmetro y psalo a travs del tapn horadado, el bulbo del termmetro debe tocar el lquido.

Figura 18.2 Calormetro

12. Anota la temperatura inicial. Una vez que se ha determinado la temperatura inicial del perxido de hidrgeno, en el calormetro, introduce dos gotas de extracto de hgado. Inserta el tapn en su lugar sin que quede apretado, para permitir el escape de cualquier gas que se genere. 13. Anota los cambios de temperatura de la cmara de reaccin cada 30 segundos, hasta un periodo de 5 minutos y repite este procedimiento dos veces ms con perxido de hidrgeno fresco y ms extracto de hgado. Calcula el promedio de las mediciones de temperatura para cada intervalo de 30 segundos anotando los resultados. Posteriormente realiza una grfica con los resultados, en el eje de las x tiempo en segundos y en el eje de las Y temperatura en C. ANOTA LOS RESULTADOS EN LAS SIGUIENTES TABLAS: TEJIDO HERVIDO SIN HERVIR

TEJIDO TRITURADO

RESULTADOS

86

ANOTA RESULTADOS EN LA SIGUIENTE TABLA DE LAS TEMPERATURAS OBTENIDAS EN EL CALORMETRO: 30 seg Temperatura s iniciales Temperatura s iniciales Temperatura s iniciales Promedio OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cul es el cambio total de temperatura que tuvo lugar en la cmara de reaccin? 2) Cul es la fuente del calor determinado en este experimento? 3) Si la catalasa es una enzima que rompe el perxido de hidrgeno formando oxgeno y agua, De qu manera se muestra en nuestro experimento la presencia o ausencia de catalasa en los tejidos? 4) De los tejidos experimentados, Cul de ellos es el ms activo?, Cul es el menos activo? 5) Qu se puede inferir de los resultados obtenidos, sobre la actividad de la catalasa en los tejidos hervidos y sin hervir? 6) Frecuentemente se utiliza perxido de hidrgeno como antisptico y se observa que al aplicarlo a una herida se produce burbujeo, Qu es lo que indica este hecho? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Nelson, J. 2002. Principios de Biologa. Enfoque humana. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Limusa, S.A. Pgs. 119-122 2. Maillet M. 2002. Biologa celular: manual. Barcelona. Segunda edicin. Editorial Masson. Pgs. 157-158 3. Plattner, H. 2001. Manual de biologa celular. Barcelona. Primera edicin. Editorial Omega. Pgs. 137-139 4. M Beln Garrido Garrido 2002. http://w3.cnice.mec.es/eos/MaterialesEducativos/mem2002/proteinas/pr ctica/catalasaboton.html http://br.geocities.com/saladefisica5/leituras/calorimetro20.gif 60 seg 30 seg 60 seg 30 seg 60 seg 30 seg 60 seg 30 seg 60 seg

87

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 19 IDENTIFICACIN DE FOSFATASA ACIDA EN LISOSOMAS OBJETIVO: Identificar la presencia de fosfatasa cida como marcador de los lisosomas. FUNDAMENTO: En el citoplasma de la mayor parte de las clulas eucariticas hay dispersos pequeos sacos de enzimas digestivas, llamados lisosomas. Las enzimas de stos organelos desdoblan molculas complejas cuyo origen es tanto intracelular como extracelular. Se han identificado 40 enzimas digestivas distintas en los lisosomas; la mayor parte son activas en condiciones bastante cidas (pH 5). La potencia de las enzimas y el bajo pH mantenido por el lisosoma son buenos ejemplos de la importancia de la separacin de funciones en distintos compartimientos. (4) En la mayor parte de las condiciones normales, las enzimas lisosmicas y sus acciones estn limitadas por la membrana de dicho organelo. Algunas formas de dao tisular se han atribuido a la fuga del contenido de los lisosomas. Los lisosomas primarios se forman por gemacin en el complejo de Golgi. Sus enzimas hidrolticas se sintetizan en el retculo endoplsmico rugoso. A medida que estas enzimas pasan por la luz del retculo endoplsmico, se agregan azcares a cada molcula, a manera de seales de identificacin. Esta seal permite al complejo de Golgi enviar de manera apropiada la enzima a los lisosomas en lugar de exportarla de la clula.(5) GENERALIDADES: Los lisosomas degradan bacterias o desechos que han sido ingeridos por clulas fagocticas. El material ingerido es rodeado por una vescula que se forma con parte de la membrana plasmtica. Uno o ms lisosomas primarios se fusionan con la vescula que contiene la materia extraa y se forma una vescula mayor, llamada lisosoma secundario. Las potentes enzimas digestivas del lisosoma entran en contacto con las molculas ingeridas y las degradan en sus componentes. Las enzimas lisosmicas tambin son liberadas en la clula en algunos procesos normales. Las enzimas lisosmicas son recicladas por la propia estructura de la clula. Un lisosoma puede engullir otro organelo, digerirlo y regresar sus componentes al citosol para que vuelvan a ser usados. De esta manera hay un reemplazo contnuo de los organelos viejos. En resumen, las principales funciones de los lisosomas son: la digestin de los organelos desechados, digestin de la clula entera, digestin extracelular y fusiona y digiere el contenido de los endosomas tardos, vesculas pinocitticas y fagosomas.(3)

88

Las fosfatasas cidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas sus cantidades en prstata, estmago, hgado, msculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. La actividad de las fosfatasas (cida y alcalina) se mide mediante la hidrlisis de los steres orgnicos (mononucletidos) transformados en nuclesidos y liberacin de fosfatos inorgnicos, o bien con sustratos acoplados a travs de unin ster a un cromforo. Se ha visto que en individuos con carcinoma de prstata, se produce una elevacin en los niveles de la enzima en suero, como consecuencia del aumento de isoenzima prosttica. Cuando no se ha producido metstasis y el tumor se encuentra circunscrito a la glndula, el incremento ser pequeo o nulo. En cambio, ste ser importante cuando existe compromiso de otros tejidos, especialmente, el seo. En principio, se pens que la fraccin tartrato lbil era especfica de prstata. Hoy se sabe que existen fosfatasas cidas tartrato lbil de origen no prosttico.(2) MATERIAL: Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Pipetas graduadas. Espectrofotmetro. Mortero con pistilo. Embudo. Vasos de precipitado. Papel filtro. MATERIAL BIOLGICO: Hgado de res. REACTIVOS: Buffer de acetatos 20 mM pH 4.8 P-nitrofenol 50 mM Hidrxido de sodio 20 mM TCNICA: 1. Se marca una serie de tubos con los datos de la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Buffer acetatos ml 3 2.7 3 2.7 3 2.7 3 2.7 3 2.7 Sustrato (p-Nf) ml 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Fracciones de hgado ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

89

2. Los tubos se preparan a 4C en un bao de hielo y se incuban durante 30 minutos a 37C. 3. Se detiene la reaccin agregando 0.5 ml de NaOH 0.1 N. 4. La actividad de la fosfatasa se mide a travs de la liberacin de nitro fenil que absorbe a 420 nm. Utilizando el tubo numero 1 como blanco. 5. Realizar una curva de concentracin de sustrato, cuantificando el nitro fenil liberado (Lecturas tomadas del espectrofotmetro). OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) En que organelos celulares se localiza la fosfatasa cida? 2) Qu importancia clnica tiene la cuantificacin de fosfatasa cida? 3) Qu enfermedades se relacin con esta enzima? 4) Cul es la clasificacin de las enzimas y a que grupo pertenece la fosfatasa cida? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Coutio, R. y Fernndez, S. 1997. Biologa celular. Manual de laboratorio experimental. Textos universitarios. Primera edicin. Pgs. 29-30 2. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pg. 110 3. De Robertis, E. 2003. Biologa celular y molecular. Argentina. Doceava edicin. Editorial El Ateneo. Pg. 129 4. Fosfatasa acida http://www.medicentro.com.co/labclinico/analisis/a_f/FOSFATASA_ACIDA.html 5. Clasificacin enzimtica http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ1-3.htm

90

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 20 NCLEO OBJETIVO: Observar e identificar el ncleo en clulas origen animal. FUNDAMENTO: El ncleo suele ser el organelo ms predominante de la clula. Se encuentra rodeado por una envoltura nuclear y se encuentra solo en clulas eucariotas, y es la localizacin de la mayora de los diferentes tipos de cidos nucleicos. Por lo comn es esfrico u oval y tiene un dimetro promedio de 5 m debido a su tamao y al hecho de que ocupa una posicin relativamente fija en el centro de las clulas se le denomin el centro de regulacin de la clula. En su interior encontramos toda la informacin gentica de la clula en forma de acido desoxirribonucleico (ADN), que presenta diversas organizaciones a lo largo de la vida celular.(2) Para esta prctica utilizaremos una sustancia buffer o amortiguador que sirve como regulador del pH al adicionarse al agua, volvindose este constante. De esta manera, si se agregan un cido o una base, no tendrn efecto alguno sobre el agua, ya que sta siempre se estabilizar de inmediato.(4) GENERALIDADES: El ncleo est rodeado por un par de membranas concntricas, que separan el contenido nuclear respecto del citoplasma circundante. Estas dos membranas guardan entre s una distancia de 40 a 40 nm y se fusionan a intervalos, en los llamados poros nucleares, que regulan el paso de determinados materiales hacia el citoplasma desde el interior del ncleo, y a la inversa. Dentro de la membrana nuclear se encuentra un medio semifluido en el cual estn suspendidos los cromosomas. Por lo general se encuentran en forma de estructuras muy alargadas y no pueden ser observados fcilmente con el microscopio ptico. Se utiliza el trmino cromatina para referirse a los cromosomas cuando se hallan bajo esta condicin. Cuando la clula va a dividirse en dos clulas, se modifica la apariencia de los cromosomas. Los hilos largos y delgados se enrollan en forma de cuerpos espesos, densos, los cuales pueden verse en el microscopio ptico con la ayuda de un colorante apropiado. Durante el proceso de la divisin celular, los cromosomas se distribuyen en nmeros exactamente iguales entre ambas clulas hijas.(3) Qumicamente, los cromosomas estn compuestos de ADN y protenas, llamadas histonas que son las principales asociadas a los cromosomas. Las histonas son protenas bsicas, debido a que son ricas en aminocidos tales

91

como lisina y arginina. Cada uno de estos aminocidos contiene un grupo amino libre, capaz de adquirir un protn por poseer un par de electrones no compartido. Por consiguiente, las histonas tienen carga positiva. El ADN lleva carga negativa debido a la presencia de numerosos grupos fosfato. Por tanto, no es sorprendente que las histonas se enlacen fuertemente con el ADN. Cuando se prepara la cromatina de cierta manera, el microscopio electrnico revela la presencia de hilos largos que contienen hinchamientos regularmente espaciados que dan la apariencia de cuentas sobre una cuerda. Los hinchamientos o cuentas reciben el nombre de nucleosomas. El hilo que las une es ADN. Cada nucleosoma contiene ADN y cuatro de los cinco tipos de histonas. Asociadas con el ADN de la cromatina se hallan tambin otras protenas, aunque en cantidades menores que las histonas. Estas otras protenas se mencionan a veces como las protenas acidas, pero quizs el trmino no histnicas es el ms exacto. Durante el periodo comprendido entre las divisiones celulares, cuando los cromosomas se hallan extendidos, uno o ms de ellos pueden estar adheridos a un cuerpo esfrico de buen tamao. Este cuerpo recibe el nombre de nucleolo y es fcilmente visible con el microscopio ptico. En el nucleolo se sintetizan varios tipos de molculas de ARN. Parte de este ARN se utiliza en la configuracin de los ribosomas. Los ribosomas son esenciales para la sntesis de protenas en las clulas (Ver Fig. 20.1).(1)

Figura 20.1 Ciclo celular

MATERIAL: Microscopio. Portaobjetos. Cubreobjetos. Mortero con pistilo. Embudo. Papel filtro. Vaso de precipitado. 92

Pipetas graduadas. Pipeta pasteur. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Centrifuga. Licuadora.

MATERIAL BIOLGICO: Hgado de pollo fresco. REACTIVOS: Buffer de separacin (buffer de fosfatos 10mM sodio0.15 M, KCl 3.3 mM y MgCl 2.6 mM a pH 7.4) Acetorcena. y cloruro de

TCNICA PARA CENTRIFUGACIN CELULAR. FRACCIONAMIENTO CELULAR: 1. El hgado se enjuaga con agua de la llave y se coloca en un vaso de precipitado, que contenga 20 ml del medio de extraccin o buffer de separacin, se desmenuza con las tijeras remplazando de 2 a 3 veces el medio. 2. Se vierte el contenido del vaso en una licuadora y se licua. Pasar a los tubos y centrifugas a 2000 rpm durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y guardarlo a una temperatura de 4C por si se necesitara ms adelante en la prctica. Observacin de ncleos: el sedimento contiene los ncleos o clulas enteras que no se rompen. Tomar una alcuota, hacer un frotis y teirlo con Acetorcena. Observar al microscopio en seco fuerte localizando la estructura (cuerpos discoides de color rosa) para despus observar en el objetivo de inmersin. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Qu funciones realiza el ncleo cuando se dice que esta interfsico? 2) Qu es el ADN y ARN? 3) Qu clase de sustancias qumicas pueden ser utilizadas como buffer? 4) Qu funcin tiene la acetorcena en la tincin? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 87-88

93

2. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 39-41 3. Hipertextos de rea de la biologa http://fai.unne.edu.ar/biologia/cel_euca/celula2.htm 4. Qumica del agua. Las soluciones buffer. http://www.elacuarista.com/secciones/quimica4_buffer.htm

94

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 21 DETERMINACIN DEL SEXO A TRAVS DE LA OBSERVACIN DEL CORPSCULO DE BARR OBJETIVO: Observar el corpsculo de Barr en clulas de epitelio bucal de mujeres y contrastando con clulas de epitelio bucal de varones. FUNDAMENTO: Barr y Bertrn descubrieron en 1949 un diminuto cuerpo cromtico en las clulas nerviosas de un gato hembra, el cual, no estaba presente en las clulas de los machos. Dado que la observacin se repiti en otros tejidos y en otros animales incluyendo el ser humano. Actualmente la tcnica se utiliza en la determinacin del sexo, (en atletas que participan en pruebas olmpicas y otras de carcter internacional), en la investigacin de estados intersexuales y en algunos de aberraciones cromosmicas.(1) GENERALIDADES: El cromosoma X contiene numerosos genes requeridos por ambos sexos, aunque una hembra normal tiene dos copias de cada locus, en tanto que un macho normal tiene solo una. La compensacin de dosis es un mecanismo que hace equivalentes las dosis de la hembra y la dosis nica del macho. En la mayor parte de los tejidos, el cromosoma X masculino es tan activo como los dos cromosomas X presentes en la hembra. En los mamferos, la compensacin de dosis por lo general implica la desactivacin de uno de los cromosomas X de la hembra. Durante la interfase, en el borde del ncleo de cada clula femenina de los mamferos es visible una mancha oscura de cromatina, llamada cuerpo o corpsculo de Barr (Ver Fig. 21.1). Se ha observado que el cuerpo de Barr representa uno de los dos cromosomas X, que se ha hecho denso.

Figura 21.1 Observacin del corpsculo de Barr

95

Se tie de color oscuro y es metablicamente inactivo. El otro cromosoma X se parece a los autosomas metablicamente activos por el hecho de que durante la interfase es un largo filamento no visible al microscopio ptico. A partir de stos y otros datos, se sugiri que en cualquier clula de una hembra mamfero slo uno de los cromosomas X es activo; el otro es inactivo y se observa como un cuerpo de Barr.(2) Cuando se tien clulas con colorantes bsicos, sus ncleos presentan zonas ms densamente teidas como las observadas alrededor del nucleolo, correspondientes a la heterocromatina y, zonas con coloracin ligera, la eucromatina. M.L. Barr encontr cuerpos cromatnicos en clulas nerviosas de gatas que no estaban presentes en el macho. Observ adems, que en diferentes clases de tejidos, incluyendo el epitelio de mucosa bucal, se presentan esos cuerpos heterocromatnicos, en el ser humano se presentan solo en la mujer, por lo cual tambin se les ha denominado cromatina sexual. Cuando en una clula existen dos cromosomas X, uno de ellos se vuelve relativamente inactivo y se hace heterocromtico (el cuerpo de Barr). Se ha descubierto que el nmero de corpsculo de Barr es igual al nmero de cromosomas X menos uno. Entonces, el cuerpo de Barr proviene de un cromosoma X que se conserva enrollado fuertemente en casi toda su longitud o todo en l durante la interfase. A consecuencia de tal enrollamiento apretado, tiene densidad suficiente para que, al teirse constituya un cuerpo visible.(3) Los cuerpos de Barr en las clulas de las hembras se observan de preferencia en los ncleos. Un cuerpo de Barr se observa como una pequea masa oscura, frecuentemente de forma planoconvexa, comprimida contra la superficie interna de la membrana nuclear. Suele tener una micra aproximadamente de dimetro, de manera que resulta netamente visible si el plano de seccin la atraviesa en la periferia.(2) MATERIAL: Microscopio. Abatelenguas. Porta y cubreobjetos. Portaobjetos. Cubreobjetos. Etiquetas. MATERIAL BIOLGICO: Clulas del epitelio bucal de mujeres y hombres. REACTIVOS: Barniz o parafina. Agua destilada. Solucin salina isotnica.

96

 Colorante de acetorcena. cido clorhdrico 0.1 M. Acetorcena al 2%. Mezcla de cido actico al 45% y alcohol etlico (3:1). TCNICA: 1. Tomar una muestra de la mucosa bucal, raspando suavemente con abatelenguas. 2. Colocar la muestra en un portaobjetos y con otro hacer un extendido. 3. En seguida colocar dos gotas de colorante en la lmina. Posteriormente se coloca el cubreobjetos pudindose hacer la lectura en el momento. 4. Observar al microscopio con los objetivos seco dbil, seco fuerte e inmersin. 5. Asegurarse de barrer todos los campos antes de reportar la ausencia de corpsculos de Barr. La literatura indica que en muestras de mucosa bucal la frecuencia puede variar entre el 20% y 50%. 6. Realizar dibujos de las muestras observadas tanto en hombres como en mujeres. TCNICA ALTERNATIVA: 1. Lavar perfectamente los portaobjetos y cubreobjetos con una mezcla de alcohol etlico-cido actico al 45%. 2. Con el abatelenguas raspar nuevamente la parte interna de la mejilla para tomar la muestra. 3. Depositar el material en el portaobjetos y hacer un frotis.

4. Etiquetar el portaobjetos segn sea el origen de la muestra (hombre y/o mujer). 5. Agregar una gota de cido clorhdrico y dejarla reposar por 20 minutos. 6. Absorber el cido con una toalla de papel.

7. Agregar una gota de acetorcena al 2% y dejarla reposar por 20 minutos. 8. Lavar con el cido actico dejndolo gotear sobre el portaobjetos inclinado. Enjuagar con agua destilada.

97

9. Colocar el cubreobjetos y sellar sus bordes con el barniz o con parafina caliente. 10. Observar al microscopio con el objetivo seco dbil, seco fuerte e inmersin. 11. Realizar dibujos de las observaciones, tanto en las muestras provenientes del varn como de mujer, resaltando en su caso el corpsculo de Barr. NOTA: Para obtener mejores resultados es necesario filtrar momentos antes a la realizacin de la prctica, la solucin de acetorcena al 2% para que el precipitado no interfiera en la observacin. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Por qu no se observa el Corpsculo de Barr en varones? 2) En que enfermedades puede observarse el Corpsculo de Barr en hombres y no en mujeres? 3) Cul es la utilidad que se le puede dar a esta prueba y en que reas puede ser aplicada? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 173-174 2. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 1059-1060 3. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 578-579

98

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 22 MITOSIS EN CLULAS VEGETALES OBJETIVO: Observar en clulas de origen vegetal las diferentes fases de la divisin mittica. FUNDAMENTO: Se llama ciclo celular al periodo de crecimiento y divisin de una clula. La mitosis es un proceso mediante el cual las clulas se multiplican. Cada clula madre dar por resultado dos clulas hijas que tendrn el mismo nmero de cromosomas que la original (Ver Fig. 22.1).

Figura 22.1 Divisin celular

En un sentido estricto, el trmino mitosis se refiere a la divisin del ncleo en dos ncleos hijos (cariocinesis), y se aplica el trmino citocinesis a la divisin del citoplasma para formar dos clulas hijas que contiene un ncleo cada una.

99

Toda clula proviene de otra ya preexistente; as, la divisin celular es un proceso mediante el cual las clulas se autorreproducen con la finalidad de perpetuarse. En los organismos pluricelulares existen dos tipos de clulas: las somticas, que conforman prcticamente todo el organismo, y las germinales, localizadas en las gnadas (testculos y ovarios).(3) GENERALIDADES: Reproduccin asexual. Los organismos unicelulares se reproducen mediante mitosis, la cual es un tipo de reproduccin asexual que se caracteriza porque se produce una descendencia sin la intervencin de gametos. Las diferentes formas de este tipo de reproduccin celular son: fisin binaria, gemacin y esporulacin. La fisin binaria es el proceso ms generalizado de reproduccin entre los seres unicelulares. El organismo se divide en dos partes aproximadamente iguales, cada una de las cuales crece hasta alcanzar el tamao adecuado segn la especie, y el proceso reproductor se repite. Este tipo de reproduccin es comn en los protozoarios, como las amibas. La gemacin difiere de la fisin binaria en que las dos partes resultantes de la divisin no son de igual tamao y, en consecuencia, se forma una gema o yema en la clula progenitora. El material gentico de la clula madre se duplica para originar una rplica; despus, una porcin de cromosomas, idntica a la que queda en la clula madre, emigra hacia la yema. Esta ltima puede independizarse, aumentar su tamao y repetir el ciclo de nuevo. La esporulacin es un proceso mediante el cual la clula se divide en repetidas ocasiones en el interior de la membrana; despus, sta se rompe y libera a las clulas hijas en forma de esporas. Cada espora posee una pared protectora muy resistente a condiciones desfavorables y tiene muy poco peso; estas caractersticas le permiten diseminarse en mltiples lugares. Los hongos y algunos protozoarios se reproducen por esporulacin.(8) INTERFASE. Antes de iniciarse el proceso de mitosis, ocurre la duplicacin del material gentico durante la interfase, que comienza en el momento del nacimiento de las clulas, cuando las dos clulas hijas se han separado. La interfase tiene tres etapas: G1, S y G2 (Ver Fig. 22.2).

100

Figura 22.2 Fases de la mitosis

ETAPA G1: Durante esta etapa se realiza el crecimiento de la clulas y, casi para finalizar aumenta la actividad de las enzimas necesarias para la sntesis de ADN. ETAPA S: Se reconoce porque incluye la duplicacin de ADN. ETAPA G2: La clula realiza un incremento en la sntesis de protenas y se prepara la divisin celular o mitosis, representada por la fase M del ciclo.(7) FASES DE LA MITOSIS. PROFASE: A travs del microscopio es posible notar que los cromosomas se distinguen en el ncleo, la membrana nuclear desaparece y los cromosomas se dispersan al azar en el citoplasma. Despus se inicia la formacin del huso acromtico, integrado por fibras de protena que salen de extremos opuestos de la clula y que la cruzan en su totalidad. METAFASE: Durante la metafase se observa que los cromosomas se ubican en el centro de la clula y forman la placa ecuatorial. En este momento, los cromosomas se encuentran unidos por los centrmeros a las fibras del huso acromtico. ANAFASE: Al principio de la anafase, los centrmeros se dividen y las dos partes iguales de cada cromosoma se separan, despus, se dirigen hacia la mitad de la clula. Los cromosomas viajan hacia los polos opuestos siguiendo las fibras del huso acromtico. Esta fase puede ser reconocida por los dos grupos de cromosomas en forma de V en ambos polos de la clula. TELOFASE: La divisin celular se completa durante la telofase. En esta fase empieza a formar una lnea muy fina a travs del centro de la clula. Cuando sta lnea se manifiesta, la clula original empieza a dividirse en dos clulas hijas, la membrana nuclear se restablece y el nucleolo se condensa dentro del ncleo. Aqu finaliza la mitosis o cariocinesis (Ver Fig. 22.3).

101

Figura 22.3 Divisin mittica

Por ltimo la clula se divide completamente en dos clulas hijas, las cuales crecern y se prepararan para la reproduccin.(4) MATERIAL: Portaobjetos. Cubreobjetos. Navaja de afeitar. Papel seda. Papel absorbente. Parafina o barniz para uas. Pincel. Lpiz con goma de borrar. Microscopio de campo claro. MATERIAL BIOLGICO: Chcharos germinados. REACTIVOS: cido clorhdrico 0.1 M. cido actico al 45%. Acetorcena al 2%. Aceite de inmersin. TCNICA: 1. Poner a germinar semillas de chcharos con cinco das de anticipacin a la prctica, siguiendo las indicaciones del Maestro. Los germinados deben tener una radcula de 1.5 a 2 cm de longitud. 2. El da de la prctica, cortar transversalmente una porcin lo ms delgada posible, de la parte apical de la radcula. Realizar 6 a 8 cortes en una raz si la longitud es la indicada, si mide de 2 a 3 cm la raz del germinado, realizar 2 cortes por cada raz (se recomiendan 6 a 8 cortes por preparacin, es decir, en este caso tres o cuatro races). 3. Colocar la porcin cortada en un portaobjetos, cubrirla con el cido clorhdrico 0.1M, dejndole actuar de 8 a 10 minutos. 4. Quitar el cido utilizando el papel absorbente.

5. Agregar al corte 2 3 gotas de solucin de acetorcena. Dejar as de 18 a 20 minutos. Indispensable cronometrar los tiempos indicados anteriormente.

102

6. Lavar el excedente de acetorcena con cido actico al 45%. Enjuagar con agua destilada. 7. Con una gota de agua, poner el cubreobjetos sobre el corte. Presionar firmemente con la goma del lpiz, sobre el cubreobjetos, movindolo suavemente para extender el tejido. 8. Sellar los bordes del cubreobjetos con el barniz o con parafina caliente, usando un pincel. 9. Buscar al microscopio, a seco fuerte, una zona de clulas meristemticas, observando despus con el objetivo de inmersin. 10. Realizar los dibujos correspondientes de las diferentes fases de la mitosis en la(s) muestra(s) observada(s) OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cuantos tipos de reproduccin existen? Descrbalos con sus caractersticas en un cuadro sinptico. 2) En que fase del ciclo celular ocurre la replicacin del ADN? 3) En que momento principia la citocinesis? FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Alarcn-Segovia, D. 2003. Fronteras de la biologa en los inicios del siglo XXI. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial El Colegio Nacional. Pgs. 89-95 2. Barthelemy, R. 2003. Tcnicas para el laboratorio de biologa. Mxico D.F. Primera edicin. Compaa editorial continental. Pgs. 121-129 3. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 139-149 4. Nelson, J. 2002. Principios de Biologa. Enfoque humana. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Limusa, S.A. Pgs. 166-171 5. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 95-107 6. Lodish, H. 2005. Biologa celular y molecular. Mxico D.F. Quinta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 178-181 7. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 93-97 8. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 47-52 9. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 115-123

103

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 23 MEIOSIS OBJETIVO: Observar en clulas de origen animal las diferentes fases de la divisin meitica. FUNDAMENTO: La meiosis consiste en dos divisiones nucleares y citoplasmticas, designadas primera y segunda divisiones meiticas, o simplemente meiosis I y meiosis II. Cada una comprende profase, metafase, anafase y telofase (Ver Fig. 23.1).

Figura 23.1 Meiosis

Durante la meiosis I, los miembros de cada par homlogo de cromosomas se unen primero y luego se separan y se distribuyen en ncleos distintos. En la meiosis II, las cromtides hermanas que constituyen cada cromosoma se separan y se distribuyen en los ncleos de las clulas hijas.(3)

104

GENERALIDADES: La mitosis produce la formacin de clulas que tiene exactamente el mismo nmero de cromosomas que la clula madre. Ello implicara dificultades si stas clulas formadas por mitosis tuvieran que servir de gametos. Si se uniera un espermatozoo humano provisto de 46 cromosomas con un vulo que tuviera 46 cromosomas, se producira un cigoto con 92 cromosomas; es decir, el doble del numero normal de cromosomas de la especie humana. El desarrollo del cigoto mediante mitosis implicara que todas las clulas subsiguientes tendran el nuevo nmero de cromosomas. Se comprender inmediatamente que despus de unas pocas generaciones en la cuales se repite el proceso, no habra espacio disponible en la clula para nada ms que cromosomas. En realidad, esta situacin raras veces ocurre en los seres vivientes. En determinado momento entre la formacin del cigoto y la de los gametos debe ocurrir un tipo especial de divisin celular. Este tipo especial de divisin celular se denomina meiosis. La meiosis consiste en dos divisiones celulares consecutivas, pero que comprenden una sola duplicacin de los cromosomas. (5) Por consiguiente, cuando una clula se divide por meiosis se producen cuatro clulas. Cada una contiene precisamente la mitad del nmero diploide normal 2n de cromosomas. Este medio nmero se denomina haploide o n. La reduccin del nmero de cromosomas no es un proceso al azar. En las clulas que se han reproducido por meiosis est presente nicamente un solo miembro de cada uno de los pares de cromosomas homlogos de la clula diploide. De tal manera que cuando los dos gametos se unen, el cigoto resultante (2n) obtiene un miembro de cada par de cromosomas homlogos procedente de cada gameto y por ende de cada progenitor. Cada una de las dos divisiones meiticas puede subdividirse en fases similares a las que ocurre en la mitosis. Sin embargo, en la primera de dichas divisiones se observan diferencias significativas en el comportamiento de los cromosomas.(7) PROFASE I. la profase de la primera divisin meitica es un proceso mucho mas lento y ms complejo que en la mitosis. Los citlogos subdividen la primera profase meitica en cinco estadios. Cuando los cromosomas se hacen visibles por primera vez (leptoteno de la profase I), cada homlogo aparece como una estructura individual. Pero en gran parte, sino todo, el ADN de la clula se ha duplicado durante la fase S que precede de la profase I, de tal manera que podemos concluir que los cromosomas en realidad ya se han duplicado. A medida que contina la profase (cigoteno y paquiteno), cada cromosoma presente en la clula se aparea longitudinalmente con su homlogo. Este proceso de apareamiento (llamado sinapsis) es un rasgo excluido de la meiosis; no ocurre en la mitosis. Los homlogos apareados reciben el nombre de bivalentes. Luego (estadio diploteno), los dos homlogos comienzan a separarse. En este momento la estructura doble de cada

105

cromosoma en el sentido de que cada uno consta de un par de cromtidas hermanas, es ya visible.(9) De modo que cada bivalente contiene cuatro cromtidas. Sin embargo, las cuatro cromtidas permanecen conectadas entre si por dos mecanismos: (1) las cromtidas hermanas de cada homlogo permanecen adheridas al centrmero compartido y (2) en uno o ms puntos, dos cromtidas no hermanas estn fusionadas. Estos puntos de fusionamiento se denominan quiasmas. En cada quiasma las cromtidas no hermanas ya han intercambiado segmentos. ste proceso de intercambio recibe el nombre de entrecruzamiento. El proceso es recproco, en cuanto a las partes intercambiadas por cada cromtida intercambiada son idnticas. Cada cromtida puede presentar dos, tres o ms quiasmas, de modo que si se cifran las cromtidas hermanas de un homlogo con los nmeros 1 y 2, y del otro homlogo con los nmeros 3 y 4, en un mismo bivalente se pueden dar una o ms de las siguientes combinaciones: 1-3, 2-3, 1-4 y 2-4. Cualquiera de stas combinaciones puede aparecer ms de una vez. Los sucesos que deben excluirse son los siguientes: (1) quiasmas entre cromtidas hermanas (los cuales no tendrn sentido por cuanto a su composicin gentica es idntica) y (2) participacin de ms de dos cromtidas no hermanas en cualquier punto a lo largo de la longitud del cromosoma (es decir, tres o cuatro cromtidas no pueden intercambiar segmentos en el mismo punto).(4) METAFASE I. La metafase I de la meiosis se parece a la metafase de la mitosis en cuanto a la desaparicin de la membrana nuclear y la aparicin del huso polar. Sin embargo, difiere en un aspecto importante de la metafase de la mitosis. En la metafase I los centrmeros de cada par de cromosomas homlogos se adhieren al huso: uno por encima y otro por debajo del ecuador celular. ANAFASE I Y TELOFASE I. Con la iniciacin de la anafase I, los dos centrmeros de cada bivalente migran hacia sus polos respectivos. Esto separa a los bivalentes en semibivalentes. Ntese que no se presenta rajadura o divisin de los centrmeros, tal como ocurre en la anafase mittica. Lo que ocurre es la separacin de los cromosomas homlogos. De tal manera, que la telofase produce dos clulas, cada una de las cuales posee un solo miembro de cada pareja de cromosomas homlogos presente en la clula original (aunque los homlogos originales han intercambiado recprocamente uno o ms segmentos de cromatida).(6) INTERCINESIS. En algunos organismos no se interpone ni una telofase ni una interfase entre la meiosis I y la meiosis II. La clula va directamente a la anafase I y a la profase II. Sin embargo, en aquellos organismos donde ocurre una interfase entres las dos divisiones, no se presenta tampoco una fase S. por consiguiente, no hay sntesis adicional de ADN. SEGUNDA DIVISIN. La segunda divisin meitica es similar a la divisin mittica. Los cromosomas estn todava presentes como dobletes. Los

106

centrmeros se adhieren al huso polar y se colocan en la placa ecuatorial durante la metafase II. En la anafase II la divisin de los centrmeros separa las cromtidas y cada una es llevada a su polo respectivo. Al terminar la segunda divisin meitica se han producido cuatro clulas. Cada una contiene un miembro para cada pareja homloga de cromosomas presente en la clula original. Por consiguiente, stas clulas contienen precisamente la mitad de los cromosomas de la clula progenitora (nmero haploide).(8) MATERIAL: Portaobjetos. Cubreobjetos. Navaja de afeitar o bistur. Pinzas. Tijeras. Lanceta. Pipeta pasteur. Microscopio. Trozo de cartulina o papel negro. Vidrio de reloj. MATERIAL BIOLGICO: Pez macho trucha. (Oncorhynchus mykiss) REACTIVOS: Parafina o barniz para uas. Etanol absoluto y cido actico glacial en proporcin 3:1. cido clorhdrico 0.1 M. cido actico al 50%. Acetorcena al 2%. Aceite de inmersin. TCNICA: o Introduzca el pez en una cubeta de diseccin y realice un corte rectangular desde el ano hasta el oprculo y observe la musculatura (Ver Fig. 23.2).

Figura 23.2 Diseccin de un pez

107

o Retire la musculatura y de esta manera quedan a la vista las vsceras del pez. o Con la ayuda de la pinza tome los testculos, los cuales aparecen como cintas alargadas de color blanco situadas en la parte superior de la cavidad abdominal desde la regin occipital hasta el poro genital. o Coloque los testculos sobre un portaobjetos. o Coloque encima otra laminilla, realice una suave presin y observe al microscopio con el objetivo seco fuerte. Para la fijacin: Utilizar una solucin fijadora compuesta por etanol absoluto y cido actico glacial en proporcin 3:1. Colocar la muestra en la solucin fijadora y 24 horas despus debe cambiarla por una preparada en el momento. El material debe conservarse en refrigeracin a -20C o en su defecto a 4 C. Para la tincin: Se deben limpiar los portaobjetos con una mezcla de 30 ml de agua destilada ms 10 ml de etanol y 10 ml de cido actic, dejando reposar por unos minutos. Limpiarlos con toallas o pauelos de papel que no dejen residuos ni fibras. Se coloca en un vidrio de reloj, un fragmento de la gnada en 5 ml de la solucin de etanol absoluto y cido actico glacial en proporcin 3:1 de 2 a 3 minutos. Una vez limpias, los fragmentos seleccionados de gnadas se colocan en otro vidrio de reloj con cido actico al 50 % preparado al momento no excediendo de 2 a 3 minutos. Una vez transcurrido el tiempo, se coloca sobre una superficie oscura para realizar la disgregacin y se agregan 2 o 3 gotas de acetorcena, cuidando que el material no se seque. Se le coloca un cubreobjetos y se deja reposar durante una hora.

Despus se dispersa la muestra golpeando suavemente el portaobjetos con un lpiz en la parte central, realzando despus el aplastado.

108

 Observar e identificar en la preparacin alguna de las etapas de la meiosis al microscopio con objetivo seco fuerte localizando la estructura y posteriormente utilizar aceite de inmersin para observar en 100x. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) En que difieren la mitosis con la meiosis? 2) Hay puntos de similitud entre ambas? Explique. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Alarcn-Segovia, D. 2003. Fronteras de la biologa en los inicios del siglo XXI. Mxico, D.F. Segunda edicin. Editorial El Colegio Nacional. Pgs. 105-109 2. Barthelemy, R. 2003. Tcnicas para el laboratorio de biologa. Mxico D.F. Primera edicin. Compaa editorial continental. Pgs. 134-137 3. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 249-261 4. Nelson, J. 2002. Principios de Biologa. Enfoque humana. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Limusa, S.A. Pgs. 193-201 5. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 117-120 6. Lodish, H. 2005. Biologa celular y molecular. Mxico D.F. Quinta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 181-185 7. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 985-986 8. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 507-509 9. Young, A. 2001. Biologa II. Mxico D.F. Primera edicin. Editorial Nueva Imagen. Pgs. 130-132 10. http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/meiosis.gif

109

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 24 EXTRACCIN DE ADN OBJETIVO: Observar la hlice del ADN, realizando una extraccin sencilla a partir de sangre total. FUNDAMENTO: Los cidos nuclicos reciben este nombre porque fueron los primeros que se descubrieron en el ncleo de las clulas; se trata de molculas orgnicas gigantes que contienen carbono, nitrgeno, hidrgeno, oxgeno y fsforo. Los cidos nuclicos son de dos tipos: el primero, el cido desoxirribonuclico (ADN), constituye el material gentico dentro de la clula. Cada gen es un segmento de una molcula de ADN. Nuestros genes determinan los rasgos que heredaremos y, que mediante el control de las sntesis de protenas, regulan las actividades que tienen lugar en nuestras clulas a lo largo de la vida y, el segundo el acido ribonucleico (ARN). (1) GENERALIDADES: La molcula de ADN es lineal sin ramificaciones, forma hebras largas, est formada por dos cadenas de polinucletidos enrolladas alrededor del mismo eje, comnmente conocida como doble hlice con giro a la derecha, cada una de ellas est formada por los fosfatos al exterior en contacto con el medio acuoso, stos se unen en el C5 y C3 de un azcar de cinco tomos de carbono llamado desoxirribosa se une a cada base en el ADN.(3) Las bases pricas y pirimdicas se enlazan en el extremo opuesto del azcar; las cuatro bases son: Adenina (A), Guanina (G), Tiamina (T) y Citosina (C). La adenina y la guanina son bases grandes de anillos dobles llamadas purinas; la timina y la citosina son bases ms pequeas de un solo anillo denominadas pirimidinas; se sitan en la parte interna de la molcula, quedando perpendicularmente al eje, se enlaza una base prica con una pirimdica por medio de puentes de hidrogeno, lo que le da mayor resistencia a la desnaturalizacin. Las cadenas de ADN son antiparalelas, es decir siguen direcciones opuestas, una va en sentido 5 a 3 y la opuesta en direccin 3 a 5 (Ver Fig. 24.1).(5) 110

Al enrollarse las cadenas, se Figura 24.1 Unin de las bases pricas y pirimdicas del ADN forman dos surcos o hendiduras paralelos a los giros de la hlice, uno mayor que el otro. En estos sitios las protenas interactan con los tomos de los nucletidos y controlan la expresin de genes especficos. La estructura mencionada se denomina configuracin B, si las condiciones fisiolgicas se alteran, poca sal o hidratacin elevada, la doble hlice cambia de forma y adquiere conformacin A, C, D, E y Z. La configuracin B es la ms estable y contiene por cada vuelta 10 pares de bases, se observa in vivo. La configuracin A es la ms torcida, tiene 11 pares de bases por cada vuelta, las bases estn inclinadas 20 grados de la perpendicular al eje de la hlice, fue la primera obtenida in vitro. La configuracin C es estrechamente espiralaza, compacta, tiene 9 1/3 pares de bases, la posicin de los nucletidos es diferente. La configuracin Z tiene un giro a la izquierda, el eje est en zigzag, es poco estable ya que diferentes partes de la molcula quedan expuestas.(6)

Figura. 24.2 Conformacin del ADN

MATERIAL: Microscopio Cubreobjetos Portaobjetos Pipetas Probeta. Varilla de vidrio. Mortero Vasos de precipitado Arena 111

 Trozos de tela para filtrar o gasa. MATERIAL BIOLGICO: Hgado de pollo. REACTIVOS: Alcohol de 96 Cloruro sdico 2M Dodecilsulfato de sodio. (SDS) TCNICA: 1. Triturar un fragmento pequeo de hgado de pollo en un mortero. Aadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas y se liberen los ncleos sueltos. 2. Aadir al triturado, 50 ml de agua destilada. Remover hasta hacer una especie de papilla o pur. 3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper. 4. Medir el volumen del filtrado con una probeta. 5. Aadir al filtrado un volumen igual de cloruro sdico 2M. Con sto conseguimos producir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina. 6. A continuacin se aade 1 g de SDS. As nos quedar el ADN libre de las protenas que tiene asociadas. 7. Aadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase, precipita el ADN (Ver Fig. 24.3).

Figura 24.3 Interfase con ADN

112

8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma direccin. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupacin de muchas fibras de ADN. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cmo se compone un nucletido? Dibuja su estructura. 2) En que difieren el ADN y el ARN? 3) Elabora una tabla comparativa entre ADN y ARN. FECHA DE REALIZACIN: BIBLIOGRAFA: 1. Nelson, J. 2002. Principios de Biologa. Enfoque humana. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Limusa, S.A. Pgs. 67-73 2. Lodish, H. 2005. Biologa celular y molecular. Mxico D.F. Quinta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 104-111 3. Luque, J. 2003. Texto Ilustrado de Biologa Celular e Ingeniera Gentica. Madrid. Segunda edicin. Editorial Harcourt S. A. Pgs. 9298 4. Ondarza R. 2000. Biologa moderna: la clula, bioqumica, gentica y biologa molecular, biologa general. Mxico D.F. Dcima edicin. Editorial Trillas. Pg. 277 5. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 53-55 6. Villee, C. 2003. Biologa. Mxico D.F. Octava edicin. Editorial Mc Graw Hill. Pgs. 583-593 7. http://www.arrakis.es/~rfluengo/anucleico.html 8. http://www.explora.cl/otros/biotec/adn.html

113

APNDICE A REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR El laboratorio es un rea de trabajo en la cual hay muchos riesgos en general, tanto para los alumnos como el personal acadmico y de investigacin que laboran en el. Todo trabajo o practica que se realice dentro de dicha rea debe contar con las precauciones debidas para evitar accidentes. El trabajo individual del alumno hace ver la importancia que tienen las precauciones de seguridad en el laboratorio. El alumno debe asistir con regularidad y puntualidad a las sesiones de laboratorio programadas. Dentro del laboratorio debers guardar disciplina, evitando as los accidentes. Cuando necesites ayuda o informacin adicional, debes consultar al maestro del laboratorio. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Equipo de proteccin. Lentes de seguridad Gafas (goggles) Lentes de seguridad con careta Bata de laboratorio Bata y mandil Guantes apropiados Campana de extraccin Extinguidor de lquidos inflamables Extinguidor de fuego de metales Regadera Extractores Conexin de agua, aire y gas.

Seguridad y precaucin

114

La accin de reactivos qumicos pueden ocasionar quemaduras por contacto, intoxicacin y por contacto. Leer cuidadosamente y con anticipacin las instrucciones de cada prctica antes de realizarla en el laboratorio. Actuar despus de saber lo que se tiene que hacer. Emplear el sentido comn si algo en el desarrollo experimental se considera peligroso. Escuchar atentamente las indicaciones de manejo y cuidado de los reactivos. Evitar fumar, jugar e ingerir alimentos dentro del laboratorio. Utilizar bata, lentes y guantes a la hora de realizar el experimento. Comprobar que el material seleccionado para el desarrollo de la prctica est en condiciones de trabajo. Emplear los reactivos despus de cerciorarse que son los requeridos y poniendo atencin a las indicaciones de precaucin que marcan las etiquetas. No utilice reactivos sin etiqueta. No probar sustancias y no aspirar los vapores directamente. No lleve a las mesas o lugares particulares los reactivos de uso general. Tapar los frascos de reactivos inmediatamente despus de ser empleados. En caso de preparar una solucin o reactivo, etiquetar inmediatamente. No succionar con la boca sustancias txicas. Maneje cuidadosamente las sustancias flamables y corrosivas para los reactivos. Medir los reactivos lquidos. Encender el cerillo antes de la vlvula de gas. Revisar que las vlvulas de agua estn cerradas. Cuidar las reas de trabajo no tirando desechos. No se realizar ningn experimento no autorizado. No trabaje jams solo en el laboratorio. No dejar una reaccin sin vigilancia. Si observa alguna situacin fuera de lo normal reprtela. No correr en el laboratorio. La calma es la mejor proteccin.

115

APNDICE B MANEJO DE RESIDUOS BIOLGICO-INFECCIOSOS EN EL LABORATORIO Clasificacin de los residuos biolgico-infecciosos. La sangre.- la sangre y los componentes de esta, solo en su forma liquida, as como los derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las funciones celulares de la sangre resultante (hemoderivados). Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos.- los cultivos generados en los procedimientos de diagnostico e investigacin, as como los generados en la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos. Los patolgicos.- los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo la orina y excremento. Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios. Los residuos no anatmicos son los siguientes: Los recipientes desechables que contengan sangre liquida. Los materiales de curacin, saturados, goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: liquido sinovial, liquido pericrdico, liquido pleural, liquido cefalorraqudeo o liquido peritoneal. Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener estos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el boletn epidemiolgico. Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes son sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades

116

infecciosas emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el boletn epidemiolgico. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatgenos.

Los objetos punzocortantes.- los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal. Manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos Los generadores y prestadores de servicios, adems de cumplir con las disposiciones legales aplicables, deben cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo, segn el caso: Identificacin de los residuos. Envasado de los residuos generados.

Identificacin y envasado. Durante el envasado, los residuos peligrosos biolgico-infecciosos no debern mezclarse con ningn otro tipo de residuos municipales o peligrosos. Se deben separar y envasar los residuos peligrosos biolgico-infecciosos de acuerdo con sus caractersticas fsicas y biolgico-infecciosas conforme a la siguiente tabla: Clasificacin y separacin de los residuos peligrosos biolgicoinfecciosos. Tipo de residuos Estado fsico Envasado Color Sangre Lquidos Recipientes Rojo hermticos Cultivos y cepas Slidos Bolsas de polietileno rojo de agentes infecciosos Patolgicos Slidos /lquidos Bolsas de Amarillo polietileno/recipientes hermticos Residuos no Slidos/lquidos Bolsas de Rojo anatmicos polietileno/recipientes hermticos Objetos Slidos Recipientes rgidos rojo punzocortantes polipropileno *tomada de la norma oficial mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Las bolsas debern ser de polietileno de color rojo traslucido de calibre mnimo 200 y de color amarillo traslucido de calibre mnimo 300, impermeables y con un contenido de metales pesados de no mas de una parte por milln y libres de cloro, adems debern estar marcadas con el smbolo universal de riesgo 117

biolgico (Ver Fig. 25.1), y la leyenda Residuos peligrosos biolgicoinfecciosos. Las bolsas se llenaran al 80 por ciento de su capacidad, cerrndose antes de ser transportadas al sitio de almacenamiento temporal y no podrn ser abiertas o vaciadas (Ver Fig. 25.2).

Figura 25.1 Smbolo universal de riesgo biolgico

Figura 25.2 Bolsa de polietileno color rojo para guardar y desechar residuos slidos biolgico-infecciosos

Figura 25.3 Bolsa de polietileno color amarillo para guardar y desechar residuos slidos patolgicos

Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes debern ser rgidos, de polipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no mas de una parte por milln y libres de cloro, que permitan verificar el volumen ocupado por el mismo, resistentes a fracturas y perdidas de contenido al caerse, destructibles por mtodos fsicos, tener separador de agujas y abertura para deposito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre permanente (Ver Fig. 25.4). Adems, debern contar con la leyenda que indique residuos peligrosos biolgico-infecciosos y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico. Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes y lquidos se

118

llenaran hasta el 80% de su capacidad, asegurndose los depsitos de cierre y no debern ser abiertos o vaciados.

Figura 25.4 Recolector de Polipropileno para punzocortantes.

Los recipientes de los residuos peligrosos deben ser rgidos, con tapa hermtica de polipropileno color rojo o amarillo, con un contenido de metales pesados de no mas de una parte por milln y libres de cloro, resistente a fracturas y perdidas de contenido al caerse, destructible por mtodos fsicos, deber contar con la leyenda que indique residuos peligrosos biolgicoinfecciosos y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico (Ver Fig. 25.5).

Figura 25.5 Recolector de Polipropileno para lquidos biolgico infecciosos.

Bibliografa: Norma oficial mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Norma oficial mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005

119

APNDICE C PREPARACIN DE SOLUCIONES EMPLEADAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR. Acetorcena Orceina 1 g Acido actico glacial 45 ml Agua destilada 55 ml Colocar 1 g de orceina y 45 ml de acido actico glacial en un recipiente tapndolo bien con lana de algodn, proceder a calentar a casi ebullicin. Una vez fro aadir 55 ml de agua destilada. Acido actico 45% Mezclar 45 ml de acido actico y 55 ml de agua destilada.

Acido clorhdrico 0.1M Medir 4.8 ml de acido clorhdrico concentrado y aforar a 100 ml con agua destilada. Azul de bromotimol Mtodo 1: disolver 0.1 g de indicador en 100 ml de alcohol de 60%. Mtodo 2: disolver 0.1 g de indicador en 88 ml de solucin de hidrxido de sodio 0.02 N y diluir con agua a 250 ml. Azul de metileno al 10% Pesar 10g de azul de metileno y disolver en 100 ml de agua destilada hasta obtener una solucin uniforme. Azul de metileno 1% Pesar 1g de azul de metileno y disolver en 100 ml de agua destilada hasta obtener una solucin uniforme. Buffer de fosfatos Solucin I: Pesar 13.8 g de NaH2PO4 y disolverlo en 250 ml de agua destilada 120

Solucin II: Pesar 35.85 g de Na2HPO4 y disolverlo en 500 ml de agua destilada. Mezclar 212.5 ml de solucin I +37.5 ml de sol II y aforar a 500 ml con agua destilada. Cloruro de sodio al 5% 5 g de cloruro de sodio 100 ml de agua destilada

Cristal violeta Pesar 3 g de cristal violeta y disolverlo en 20 ml de etanol, agregar inmediatamente 0.8 g de oxalato de amonio y 20 ml de agua destilada. Glucosa al 30% 30 g de glucosa 100 ml de agua destilada Fucsina bsica Pesar 1 g de fucsina y disolverlo en 100 ml de agua destilada.

Lugol Pesar 0.5 g de yodo, 1 g de yoduro de potasio, mezclar ambos en un mortero. Diluir con 150 ml de agua destilada, filtrar la solucin y guardarlo en frasco mbar. Reactivo de Benedict Solucin A: Pesar 173 g de citrato de sodio, adicionarle 100g de Na2CO3 completar a 800 ml de agua destilada. Filtrar y completar hasta 850 ml de agua. Solucin B: Pesar 17.3g de CuSO4 y disolverlo en 150 ml de agua destilada. Disolver suavemente la solucin b en la a agitando continuamente. Reactivo de Biuret Sulfato de cobre pentahidratado 1.5 g Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado 6 g Hidrxido de sodio al 10 % 300 ml Disolver el sulfato de cobre pentahidratado y el tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500 ml de agua destilada, agregar 300 ml de hidrxido de sodio al 10% y aforar a 1000 ml de agua destilada. Reactivo de Fehling Solucin a: disolver 34.65g de sulfato de cobre en 300 ml de agua destilada, aforar a 500 ml y conservar en frasco con tapn de hule. Solucin b: disolver 125g de hidrxido potsico y 173g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada aforando a 500 ml conservar en frasco revestido de parafina. Solucin de almidn al 1% Pesar 1g de almidn y disolverlo en 100 ml de agua caliente. Solucin de albmina

121

Separar la clara de un huevo y diluir en 2 a 4 volmenes de agua destilada. Filtrar a travs de gasa o algodn. Solucin de Locke. Cloruro sdico 0.9g, cloruro potsico 0.042g, cloruro de calcio 0.048g, bicarbonato sdico 0.02g, glucosa 0.2g, agua destilada 100 ml. Solucin de nitrato de plata al 1% Pesar 1g de nitrato de plata y disolverlo en 100 ml de agua destilada. Guardar en un frasco oscuro.

GLOSARIO DE TRMINOS UTILIZADOS EN BIOLOGA CELULAR. Aberracin: Desviacin del tipo normal que en determinados casos experimenta un carcter fisiolgico o morfolgico. ADN: Siglas del acido desoxirribonucleico, grupo prosttico nucleoprotenas depositario de las caractersticas genticas. ADP: Siglas que designan el adenosindifosfato. Adyacente: Situado en la inmediacin o proximidad de otra cosa. Almidn: Polisacrido de los rganos verdes de las plantas. Anaerobio: Organismo que no precisa un ambiente molecular para desarrollar su metabolismo. Aprestar: Engomar los tejidos. ARN: Siglas del acido ribonucleco. Componente nucleoprotenas, presente en el ncleo y en el citoplasma. esencial de las con oxigeno libre de las

Asexual: Dcese de la reproduccin que se verifica sin intervencin de los dos sexos. ATP: Siglas del adenosintrifosfato. Autosoma: Cada uno de los cromosomas, a excepcin de los sexuales o heterocrosomas, de una clula, organismo o especie. Biconvexa: Dcese del cuerpo que tiene dos superficies convexas opuestas. Carotenoide: Cada uno de los pigmentos vegetales amarillos, anaranjados y rojos presentes en los cloroplastos y en los plastidios. Coadyuvan a la

122

fotosntesis mediante la absorcin de luz y la transmisin de energa a la clorofila. Celulosa: Glcido polisacrido que forma las membranas de las clulas vegetales. Se utiliza para fabricar papel, seda artificial, colodin, celuloide y nitrocelulosa. Cigoto: Resultante de la unin de dos gametos, uno masculino y otro femenino. Macrogameto fecundado. Cromtida: Cada uno de los dos filamentos de cromatina que resultan de la duplicacin de un cromosoma. Cromforo: Dcese de los grupos de tomos no saturados que, estando presentes en la molcula de la sustancia qumica, hacen que esta sea coloreada. Diafragma: Disco horadado que sirve para regular la cantidad de luz que se ha de dejar pasar. Dicroico: Propiedad de algunos cuerpos de presentar dos coloraciones. Discorde: Ser opuestas entre si dos o ms cosas. Distensin: Tensin que sufren los tejidos, rganos, msculos o tendones. Estoma: Cada una de las pequesimas aberturas que hay en la epidermis de las hojas de los vegetales. Estroma: Tejido que sirve para el sostenimiento entre sus mallas de los elementos celulares, o de las sustancias activas contenidas en algunas clulas. Eucariota: Dcese de las clulas cuyos organelos estn compartimentalizados y tienen ncleo. Fiambre: Que despus de asado o cocido se ha dejado enfriar para no comerlo caliente. Fructuosa: Monosacrido que se descubri como producto de hidrlisis del azcar de caa. Glucosa: Monosacrido de color blanco, sabor dulce y soluble en agua. Se utiliza como edulcorante y en farmacia. Gnada: rgano del aparato reproductor de los animales en el que se forman y liberan los gametos. Gradiente: Diferencia que se presenta entre dos concentraciones en una mezcla de sustancias.

123

Hidrfilica: Dcese de la sustancia que absorbe el agua con gran facilidad. Hidrfobica: Dcese de la sustancia que repele el agua con facilidad. Hipertnica: Dcese de una solucin cuya presin osmtica es mayor que la otra. Hipotnica: Dcese de una solucin cuya presin osmtica es menor a la de otra solucin. Homeostasis: Tendencia de los seres vivos a presentar una constancia de condiciones ambientales en su medio interno. Homlogo: Dcese de los rganos de animales o vegetales de especies diferentes que tienen el mismo origen embriolgico, sin tener necesariamente la misma forma o funcin. Impeler: Dar empuje para producir movimiento. Inclusin: Estructura normal o patolgica que se encuentra en el interior de la clula y que resulta de sus procesos metablicos. Inmersin: Accin de introducir o introducirse una cosa en un liquido. Intersticio: Espacio pequeo que media entre dos cuerpos o entre dos partes de un mismo cuerpo. Isotnico: Dcese de las soluciones que a la misma temperatura tienen igual presin osmtica. Lignina: Sustancia de proteccin de las membranas de las clulas de los tejidos de accin mecnica y de sostn de las plantas. Locus: Punto peculiar en el cromosoma en el cual se encuentra el gen para un carcter dado. Longitud de onda: Es una vibracin peridica, distancia entre dos puntos que se encuentran en el mismo estado de fase. Metstasis: Reproduccin de una enfermedad en rganos distintos de aquel en que se present primero. Ntida: Limpio, terso, claro, puro, resplandeciente. Peroxidasa: Enzima de oxidorreduccin que cataliza las reacciones de aceptacin de electrones o de hidrgeno por parte de los perxidos. Procariota: Grupo de microorganismos carentes de estructura celular tpica, sin membrana nuclear ni orgnulos citoplasmticos, como los virus, las algas azules y las bacterias o esquizomicetes.

124

Suberina: Sustancia lipdica, impermeable, que se halla en el corcho o sber de ciertos vegetales. Tisular: Relativo a los tejidos. Turgencia: Presin ejercida sobre el interior de la pared celular de la planta por el contenido liquido de la clula; el interior de la clula es hipertnico en relacin con los lquidos que la rodea y entonces recibe ms agua por smosis.

125