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SIMONE DE VASCONCELOS GENEROSO

LEVEDURAS PROBITICAS NO PROCESSO DE TRANSLOCAO BACTERIANA EM MODELO EXPERIMENTAL DE OBSTRUO INTESTINAL EM CAMUNDONGOS

Faculdade de Farmcia da UFMG Belo Horizonte, MG 2010

SIMONE DE VASCONCELOS GENEROSO

LEVEDURAS PROBITICAS NO PROCESSO DE TRANSLOCAO BACTERIANA EM MODELO EXPERIMENTAL DE OBSTRUO INTESTINAL EM CAMUNDONGOS

Tese apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincia de Alimentos da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do grau de Doutor em Cincia de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Valbert Nascimento Cardoso Co-Orientador: Prof. Dr. Jacques Robert Nicoli

Faculdade de Farmcia da UFMG Belo Horizonte, MG 2010

Aos meus pais e ao meu irmo, amores da minha vida...

AGRADECIMENTOS
Eis a tese pronta! E uma concluso: escrever os agradecimentos talvez seja to difcil quanto elabor-la... Tantas pessoas colaboraram direta ou indiretamente nestes quatro anos de intenso trabalho, algumas com sugestes e discusses, outras com o apoio, carinho e pacincia (talvez mais importante). Gostaria de citar algumas dessas pessoas:

Ao Prof. Dr. Valbert Nascimento Cardoso - FAFAR/UFMG, meu orientador, pelos ensinamentos, pacincia, confiana, e estmulos necessrios para a construo e viabilizao deste trabalho. Ao Prof. Dr. Jacques Robert Nicoli ICB/UFMG, meu co-orientador, pela presena constante, discusso de idias, sugestes e pelo intenso apoio. A Prof. Dra. Isabel Correia Faculdade de Medicina/UFMG, minha admirao de longa data, pelo incentivo, aprendizagem, pelos preciosos conselhos e pelo apoio nos congressos.

A minha famlia: me, pai e irmo, pelo amor incondicional, apoio, pacincia e incentivos sempre. A Prof. Dra. Simone Diniz FAFAR/UFMG por toda a ajuda e disponibilizao de materiais para a realizao das pesquisas.

Aos colegas do Laboratrio de Radioistopos/ FAFAR em especial Luciene Mota e Andr Luiz pelas idias, discusses e amizade.

MINHAS MOS DIREITAS, amigas, colegas de trabalho, companheirssimas: Mirelle Lomar Viana, Rosana das Graas e Iara Quirino. Sem vocs nada disso seria possvel.

Aos colegas de trabalho do laboratrio de Microbiologia do ICB/ UFMG, em especial ao Dr. Flaviano Martins, pelo apoio, presena constante e ajuda preciosa em todos os momentos.

4 A Prof. Dra. Rosa Arantes, Laboratrio de Patologia do ICB/UFMG, pelas anlises histolgicas alm de suas idias e discusses construtivas.

Ao Prof. Jos Augusto, Programa de Ps Graduao da Santa Casa, pela ajuda nas anlises imunolgicas.

Ao Prof. Dr. Roberto Junqueira pela sua ateno e ajuda nas anlises estatsticas.

A mdica veterinria Adelaide e ao funcionrio do biotrio Batista, por toda sua pacincia e disposio em ajudar.

Ao meu namorado, Rafael, pelo carinho, apoio, pacincia e ajuda. Minha amiga Bia, sempre presente, por todo apoio e pela sua amizade. A minha amiga Isabella, a minha v, tias, tios, primos, Kel, Camila, e minha madrinha, apoio constante!

Ao CNP e FAPEMIG pelo apoio financeiro.

A todos que de certa forma contriburam para a execuo deste trabalho.

Suba o primeiro degrau. No necessrio que voc veja toda a escada. Apenas d o primeiro passo (Matin Luter King)

SUMRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................ 09 LISTA DE FIGURAS................................................................................. 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................. 11 RESUMO.................................................................................................. 12 ABSTRACT.............................................................................................. 13 1 INTRODUO....................................................................................... 14 2 REVISO DA LITERATURA................................................................. 17 2.1 Microbiota Intestinal......................................................................... 17
2.1.1 Consideraes Gerais.......................................................................... 17 2.1.2 Estabelecimento da microbiota intestinal............................................... 17 2.1.3 Fatores relacionados colonizao do trato gastrointestinal.................. 19 2.1.4 Aes da microbiota sob o hospedeiro.................................................. 20

2.2 Probiticos........................................................................................ 22
2.2.1 Definio............................................................................................. 22 2.2.2 Tipos de probiticos............................................................................ 22 2.2.3 Viabilidade dos probiticos............................................................................. 23 2.2.4 Mecanismos de ao dos probiticos.................................................... 24 2.2.5 Efeitos benficos dos probiticos......................................................... 26 2.2.6 A levedura Saccharomyces boulardii..................................................... 28 2.2.6.1 Consideraes gerais........................................................................ 28 2.2.6.2 Benefcios da levedura na sade humana ......................................... 29 2.2.7 A levedura UFMG 905........................................................................... 31

2.3 Translocao Bacteriana.................................................................. 33

2.3.1 Consideraes gerais........................................................................... 33 2.3.2 Mecanismos da translocao bacteriana............................................... 34 2.3.2.1 Crescimento bacteriano exagerado..................................................... 35 2.3.2.2 Alteraes na barreira intestinal......................................................... 36 2.3.2.2.1 Permeabilidade intestinal........................................................................... 36

7 2.3.2.3 Resposta imunolgica....................................................................... 38 2.3.3 Probiticos e translocao bacteriana................................................... 41

2.4 Obstruo Intestinal........................................................................

43

2.4.1 Definio................................................................................................ 43 2.4.2 Fisiopatologia............................................................................................ 43 2.4.3 Obstruo intestinal e translocao bacteriana...................................... 44

2.5 Istopo Radioativo............................................................................ 45 CAPITULO I - O tratamento com clulas viveis e no viveis de

Saccharomyces boulardii preserva a integridade intestinal e reduz a translocao bacteriana num modelo de obstruo intestinal em camundongos............................................................................................................. 46

RESUMO.................................................................................................. 46 1 INTRODUO....................................................................................... 47 2 MTODOS............................................................................................. 48

2.1 Microrganismos................................................................................................. 48 2.2 Camundongos...................................................................................................... 48 2.3 Delineamento experimental................................................................................. 49 2.4 Procedimento cirrgico....................................................................................... 49 2.5 Procedimento de marcao da E. coli................................................................ 49 2.6 Determinao da translocao bacteriana........................................................ 50 2.7 Determinao da permeabilidade intestinal...................................................... 50 2.8 Anlise histolgica............................................................................................... 51 2.9 Determinao da IL-10 e INF-............................................................................. 52 2.10 Dosagem de sIgA............................................................................................... 52 2.11 Anlises estatsticas.......................................................................................... 52

3 RESULTADOS...................................................................................... 53
3.1 Ingesto alimentar e ganho de peso.................................................................. 53 3.2 Avaliao da translocao bacteriana............................................................... 53 3.3 Permeabilidade intestinal.................................................................................... 54 3.4 Avaliao da histologia intestinal....................................................................... 54 3.5 Anlise dos nveis sricos de IL-10 e INF-....................................................... 57

8 3.6 Anlise dos nveis intestinais de sIgA............................................................... 58

4 DISCUSSO.......................................................................................... 60 CAPITULO II - Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 protege contra a

translocao bacteriana, preserva a integridade da barreira intestinal e estimula o sistema imunolgico em modelo de obstruo intestinal em camundongos............................................................................................. 65

RESUMO.................................................................................................. 65 1 INTRODUO....................................................................................... 66 2 MTODOS............................................................................................. 67

2.1 Microrganismos................................................................................................. 67 2.2 Camundongos...................................................................................................... 67 2.3 Delineamento experimental................................................................................. 67 2.4 Procedimento cirrgico....................................................................................... 68 2.5 Procedimento de marcao da E. coli................................................................ 68 2.6 Determinao da translocao bacteriana........................................................ 69 2.7 Determinao da permeabilidade intestinal...................................................... 69 2.8 Determinao da IL-10 e INF-............................................................................. 70 2.9 Dosagem de sIgA................................................................................................. 70 2.10 Anlise histolgica............................................................................................. 70 2.11 Anlises estatsticas.......................................................................................... 70

3 RESULTADOS.....................................................................................

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3.1 Avaliao da ingesto e ganho de peso............................................................ 71 3.2 Efeito do probitico no processo de translocao bacteriana........................ 71 3.3 Avaliao da permeabilidade intestinal............................................................. 72 3.4 Nveis sricos de IL-10 e INF-............................................................................ 73 3.5 Nveis intestinais de sIgA.................................................................................... 74 3.6 Anlise histolgica............................................................................................... 75

4 DISCUSSO......................................................................................... 77 3 CONCLUSES INTEGRADAS............................................................. 82 4 PERSPECTIVAS................................................................................... 83 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICA........................................................ 84

LISTA DE TABELAS

[REVISO BIBLIOGRFICA] 1 Gneros e espcies predominantes de bactrias que colonizam o intestino do lactente......................................................................................................... 18 2 Microrganismos com propriedades de probiticos......................................... 23

[CAPTULO I] I.1 Biodistribuio da 99mTc- E.coli......................................................................... 53

[CAPITULO II] II.1 Biodistribuio da 99mTc- E.coli......................................................................... 71

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LISTA DE FIGURAS
[REVISO BIBLIOGRFICA] 1 2 Fatores que regulam a colonizao e a estabilidade da microbiota intestinal.. Representao esquemtica da interao entre probiticos e a mucosa intestinal............................................................................................................ 3 4 5 Viso microscpica da levedura Saccharomyces boulardii.............................. Mecanismos de translocao bacteriana.......................................................... Diagrama simplificado mostra como clulas imunolgicas podem reagir ao contedo luminal via receptores de antgenos especficos de clulas T ......... 6 37 25 29 34 19

Mecanismos da resposta imunolgica na TB.................................................... 40

[CAPITULO I] I.1 I.2 I.3 I.4 I.5 Permeabilidade intestinal.................................................................................. Cortes histolgicos da mucosa do intestino delgado de animais....................... Nveis de citocinas IL-10 no plasma dos animais............................................. Nveis de citocinas INF- no plasma dos animais............................................. Nveis de sIgA no fluido intestinal dos animais................................................. 54 56 57 58 59

[CAPITULO II] II.1 II.2 II.3 II.4 II.5 Permeabilidade intestinal.................................................................................. Nveis de citocinas IL-10 no plasma dos animais............................................. Nveis de citocinas INF- no plasma dos animais............................................. Nveis de sIgA no fluido intestinal dos animais................................................. Cortes histolgicos da mucosa do intestino delgado de animais....................... 72 73 74 75 76

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

TB OI S.b S.c E.coli DTPA 99m Tc 99m Tc - E.coli 99m Tc - DTPA S. boulardii S. cerevisiae LMN IFN- IL-10 sIg A TGI UFC LPS V.cholerae C. difficile GALT Ig A IL-1 IL-4 IL-5 IL-6 IL-12 IL-13 TNF- NK RNAm TGF- CD CO2 MBq 99 Mo CPM - Translocao bacteriana - Obstruo Intestinal - Saccharomyces boulardii - Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 - Escherichia coli - cido dietilenotriaminopentactico - 99m-Tecncio - Escherichia coli marcada com tecncio - cido dietilenotriaminopentactico marcado com tecncio - Saccharomyces boulardii - Saccharomyces cerevisiae 905 - Linfonodos mesentricos - Interferon- - Interleucina-10 - Imunoglobulina A secretria - Trato gastrointestinal - Unidade formadora de colnia - Lipopolissacardeo - Vibrio cholerae - Clostridium difficile - Tecido linfide associado mucosa gastrintestinal - Imunoglobulina A - Interleucina-1 - Interleucina-4 - Interleucina-5 - Interleucina-6 - Interleucina-12 - Interleucina-13 - Fator de necrose tumoral - Natural Killer - cido Ribonucleico - Fator de transformao do crescimento beta - Clulas dendrticas - Gs carbnico - Megabequerel - 99-Molibidnio - Contagem por minuto

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RESUMO

Existem evidncias dos efeitos benficos dos probiticos na proteo da barreira intestinal e modulao da funo imunolgica, reduzindo a translocao bacteriana (TB). O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos das clulas viveis e no viveis dos probiticos, Saccharomyces boulardii (Sb) e Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 (Sc) na TB induzida em modelo murino de obstruo intestinal (OI), assim como os mecanismos de ao. Foram utilizados 6 grupos de animais. Grupo I: Sham; Grupo II: OI; Grupo III: OI + Sb; Grupo IV: OI + Sb no vivel, Grupo V: OI + Sc ; Grupo VI: OI + Sc no vivel. Os animais receberam durante 10 dias por gavagem soluo salina (grupos I e II) ou tratamento com clulas viveis ou no viveis dos respectivos probiticos os (III a VI). No dcimo dia, todos os camundongos foram submetidos a OI, exceto o grupo I. A TB que foi determinada por meio da captao de
99m

Tc-

Escherichia coli no sangue, linfonodos mesentricos, fgado, bao e pulmes e foi significativamente maior no grupo II em relao ao grupo I. Os tratamentos com ambas as leveduras, com clulas viveis e no viveis, reduziram a TB para o sangue e todos os rgos investigados, alm de inibirem o aumento da permeabilidade intestinal, conforme determinado pela captao no sangue do
99m

Tc-DTPA. Esses dados foram

coerentes com o exame histolgico intestinal que mostrou leses mais graves no grupo II quando comparado aos grupos I e tratados com probiticos. Alm disso, os tratamentos com probiticos foram capazes de aumentar significativamente (p < 0,05) os nveis de IL-10, e tiveram o mesmo efeito sobre os nveis de sIgA quando comparados com os animais do grupo II. O grupo VI foi o nico a no apresentar aumento significativo nos nveis de sIgA. Concluindo, os tratamentos com os dois probiticos viveis ou no foram capazes de impedir a TB, provavelmente por imunomodulao e pela manuteno da integridade da barreira intestinal. No caso da levedura S. cerevisiae UFMG 905 alguns de seus efeitos, como estmulo produo de sIgA, parecem depender de sua viabilidade.

Palavras-chaves: probiticos, translocao bacteriana, Escherichia coli marcada com tecncio- 99m, permeabilidade intestinal, resposta imunolgica, Saccharomyces.

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ABSTRACT
There is evidence of the beneficial effects of probiotics in the intestinal mucosa protection and modulation of immune function, reducing bacterial translocation (BT). The aim of this study was to evaluate the effects of viable cells and nonviable probiotics, S. boulardii and S. cerevisiae (UFMG 905) in BT as well as its means of action in model intestinal obstruction (IO) in mice. We used 6 groups. Group I: Sham operated, Group II: intestinal obstruction (IO), Group III: IO+Sb and Group IV: IO+not viable Sb, Group V: IO+Sc, Group VI: IO+ not viable Sc. Animals in groups I and II were given for 10 days, gavage saline, and the animals in other groups received their treatments by gavage with probiotics. In 10 day all mice underwent the operation for the promotion of IO, except the Sham group. BT was determined by uptake of
99m

Tc-E.coli

in the blood, lymph nodes, liver, spleen and lungs was significantly higher in group HI than in group Sham. Treatment with both yeasts, with both viable and non viable cells, reduced BT in the blood and all organs investigated, in addition to inhibiting the increase in intestinal permeability, as determined by uptake in the blood of
99m

Tc-DTPA. These

data were confirmed by histology as intestinal histopathological lesions were more severe in the IO group compared to Sham and treated groups. Furthermore, treatments with probiotic were able to significantly increase the levels of IL-10 (p<0.05) and had the same effect on the levels of sIgA compared with the animals in group IO. The group IO+not viable Sc, was an exception since they were not observed significant increases in the levels of sIgA. In conclusion, treatments with both probiotics were able to prevent BT probably through immunomodulation and maintaining the integrity of the intestinal barrier. In the case of the yeast S. cerevisiae UFMG 905 some of its effects as stimulating the production of sIgA seem to depend on their viability.

KEYWORDS: probiotics, bacterial translocation,

Escherichia coli labeled with

technetium-99m, intestinal permeability, immune response, Saccharomyces.

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1 INTRODUO
O trato gastrointestinal (TGI) desempenha outras funes alm do simples processo de digesto, absoro e excreo dos alimentos (ISOLAURI et al., 2004; MACFIE et al., 2006). Ele considerado o maior rgo imunolgico do corpo, atuando tambm como barreira contra patgenos e antgenos do lmen intestinal (GATT et al., 2007). Alm disso, abriga complexo e diverso ecossistema de microrganismos que interagem entre si e com o hospedeiro mantendo uma relao de simbiose (RESTALENERT & BARRETT et al., 2003). Existem, porm alguns fatores que podem interferir na homeostase do TGI, rompendo o equilbrio entre a barreira intestinal e o contedo presente no lmen, promovendo a passagem de microrganismos atravs da barreira, para os linfonodos mesentricos (LMN) e outros rgos, evento conhecido como translocao bacteriana (TB) (GATT et al., 2007). Os possveis mecanismos envolvidos na TB so: supercrescimento microbiano, deficincia do sistema imunolgico e aumento da permeabilidade ou danos na barreira da mucosa intestinal (WIEST & RATH, 2003; GATT et al., 2007). A translocao de bactrias e endotoxinas atravs da mucosa intestinal pode ser responsvel pela liberao de mediadores e ativao de clulas imunolgicas que contribuem para o desenvolvimento de inflamao sistmica e falncia mltipla de rgos (TIMMERMAN et al., 2007). A prevalncia da TB em torno de 15% nos pacientes submetidos a cirurgias eletivas e ocorre mais frequentemente em pacientes com alteraes intestinais, como obstruo e isquemia intestinal, cncer de clon retal, uso de nutrio parenteral ou antibioticoterapia. Pode ocorrer tambm em pacientes em choque, com pancreatite ou ictercia obstrutiva, desnutridos ou imunossuprimidos (WIEST & RATH, 2003; MACFIE, 2004). Esses pacientes normalmente apresentam alterao da barreira intestinal, aumento da permeabilidade e resposta inflamatria sistmica podendo evoluir para sepse e bito (TIMMERMAN et al., 2007). Devido ao potencial efeito benfico da microbiota na funo intestinal e imunolgica, tornou-se crescente o interesse na utilizao de probiticos na medicina clnica para preveno e tratamento de vrias patologias (KELLY et al., 2007). H evidncias convincentes de que a terapia direcionada ao intestino melhora os resultados clnicos de vrios pacientes crticos (DEITCH, 2002; MCNAUGHT et al.,

15 2005). Sendo assim, a manuteno de balano ecolgico estvel no trato gastrointestinal seria o maior mecanismo de defesa na preveno da TB (SALZEDASNETTO et al., 2006). Os probiticos so definidos como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefcios sade do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Embora essa definio enfatize a necessidade da viabilidade dos probiticos, alguns autores tm demonstrado que mesmo mortos pelo calor ou por raios ultravioletas, os componentes destes microrganismos, como a parede das suas clulas, tambm podem ser eficazes mantendo os mesmos efeitos benficos das clulas viveis (KATARIA et al., 2009; MAEDA et al., 2009; ADAMS et al., 2010). Foram evidenciados vrios benefcios com a utilizao dos probiticos na promoo da sade e preveno de doenas. Eles tm sido utilizados com eficcia na diminuio da gravidade e durao da diarria por rotavrus e outros agentes patolgicos, alergias, dermatite atpica, e algumas doenas inflamatrias do trato gastrointestinal (KATARIA et al., 2009; LI et al., 2009; NG et al., 2009). Contudo, os mecanismos pelos quais os probiticos exercem seus efeitos benficos ainda no foram completamente identificados. Existem evidncias de que eles podem interferir na modulao do sistema imunolgico tanto por via sistmica quanto local (na mucosa intestinal), e atuar na preservao da barreira e da permeabilidade intestinal. Alm disso, sabe-se, que h diferenas significativas nos mecanismos de ao e nos benefcios entre as diferentes espcies de probiticos (NG et al., 2009). Saccharomyces boulardii uma levedura no patognica utilizada como probitico, sendo praticamente a nica levedura comercializada em medicina. Entretanto, outras leveduras de origem ambiental ou agroindustrial com propriedades bioteraputicas similares ou at melhores, certamente existem, principalmente considerando a rica biodiversidade encontrada nos ecossistemas microbianos brasileiros (MARTINS et al., 2005b). Baseado nessas evidncias, o Departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerias isolou nova linhagem de probitico, Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 com caractersticas semelhantes ao S. boulardii demonstradas em estudos in vitro e in vivo (MARTINS et al., 2005b; MARTINS et al., 2007). Alguns trabalhos prvios mostraram a capacidade do S. boulardii, em reduzir a TB (HEREK et al., 2004; GEYIK et al., 2006) assim como MARTINS et al. (2007) demonstraram a proteo do probitico Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 contra a

16 translocao da Salmonella Typhimurium. Porm, o modo como essas leveduras agem na proteo da TB ainda no foi completamente elucidado. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel dos probiticos Saccharomyces boulardii e Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 na TB utilizando modelo experimental de obstruo intestinal em camundongos. Alm disso, foram avaliados os possveis mecanismos de ao desses probiticos pela determinao da permeabilidade intestinal, avaliao dos aspectos histolgicos da mucosa intestinal e do comportamento imunolgico, seja por resposta local (determinao de sIgA no fluido intestinal) ou sistmica (determinao das citocinas IL10 e INF-, no soro) alm da anlise da viabilidade celular para ambos os probiticos . Ressalta-se que, para estudos de permeabilidade intestinal empregou-se mtodo inovador, desenvolvido pelo grupo de pesquisa do Laboratrio de Radioistopos da Faculdade de Farmcia da UFMG, utilizando o cido dietilenotriaminopentcetico (DTPA) marcado com o istopo radioativo tecncio-99m.

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2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Microbiota Intestinal

2.1.1 Consideraes Gerais

O trato gastrointestinal dos mamferos abriga uma comunidade microbiana que extremamente densa e diversa, estimada em 1014 unidades formadoras de colnias (UFC) de microrganismos, nmero que supera em dez vezes o total de clulas eucariontes que constituem o corpo humano (MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005; BRANDT et al., 2006). As bactrias esto distribudas em todo o trato gastrointestinal (TGI), porm de forma heterognea (BRANDT et al., 2006). Estima-se que o nmero de espcies bacterianas diferentes no TGI esteja em torno de 700 a 1000, embora estudos mais recentes indiquem que somente 30 a 40 destas espcies conseguem atingir nveis dominantes, desempenhando funes para o hospedeiro que as aloja. A microbiota intestinal varia qualitativamente, quantitativamente e metabolicamente, dependendo da poro anatmica colonizada, da espcie animal e da idade do hospedeiro (MARTINS et al., 2005a).

2.1.2 Estabelecimento da microbiota intestinal

Logo aps o nascimento, o intestino que era estril, comea a ser colonizado por bactrias anaerbias facultativas e anaerbias estritas. O primeiro contato do hospedeiro com bactrias ocorre no canal vaginal durante o nascimento. Fatores como a microbiota do trato vaginal da mulher; condies sanitrias, tcnicas obsttricas (parto cesreo ou vaginal) e tipo de alimentao (amamentao no seio ou por frmula) tm efeitos sobre a quantidade e a variedade de espcies que vo colonizar o intestino da criana (KELLY et al., 2007; ISOLAURI et al., 2004). Durante a primeira semana de vida, bactrias anaerbias facultativas, tais como enterobactrias e enterococos so as colonizadoras iniciais do intestino. Elas so seguidas por bactrias mais estritamente anaerbias como bifidobactrias. A colonizao inicial do intestino por bactrias anaerbias facultativas leva a uma

18 reduo do potencial redox no lmen intestinal que por sua vez, acredita-se ser o prrequisito para subseqente colonizao por bactrias anaerbias estritas

(MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005; KELLY et al., 2007). Os gneros e espcies de bactrias predominantes isolados das fezes de lactentes esto representados na TAB. 1.

TABELA 1 - Gneros e espcies predominantes de bactrias que colonizam o intestino do lactente Anaerbias facultativas
Escherichia E. coli Bifidobacterium

Anaerbias estritas
B. breve B. longum B. adolescentis B. bifidum B. infantis B. fragilis B. distasonis B. vulgatus B. ovatus B. thetaiotaomicron B. uniformis C. perfringens C. difficile C. butyricum C. tertium C. paraputrificum L. acidophilus L. fermentum L. brevis L. salivarius L. plantarum E. aerofaciens E. lentum E. rectale V. parvula P. saccharolyticus P. productus P. anaerobius

Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis

Bacteroides

Enterococcus

E. faecalis E. faecium

Clostridium

Enterobacter

E. cloacae

Lactobacillus

Klebsiella

K. pneumoniae

Eubacterium

Proteus Citrobacter Pseudomonas

P. mirabilis C. freundii P. aeruginosa

Veillonellae Peptococcus Peptostreptococcus

FONTE: MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005.

19 2.1.3 Fatores relacionados colonizao do trato gastrointestinal

A colonizao do trato gastrointestinal pela microbiota um processo complexo e multifatorial, que envolve fatores ambientais, alimentares, associados aos microrganismos e relacionados ao hospedeiro (FIG. 1) (MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005; BRANDT et al., 2006; KELLY et al., 2007).

Gentica Funo imunolgica

Contaminao ambiental Aleitamento materno ou artificial

Capacidade de adeso da bactria

Microbiota intestinal

Uso de antibiticos

Tipo de parto

FIGURA 1. Fatores que regulam a colonizao e a estabilidade da microbiota intestinal (BRANDT et al., 2006).

Para que ocorra a colonizao do coln, as bactrias tm que encontrar um habitat apropriado para adeso ao intestino. Quatro habitats bacterianos caractersticos foram descritos no intestino: o lmen intestinal, a camada de muco, as criptas intestinais, e as superfcies das clulas epiteliais (MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005; LUTGENDORFF et al., 2008). O estmago e o intestino delgado so ambientes desfavorveis para a colonizao e proliferao bacteriana pela ao do suco gstrico, da bile, da secreo pancretica e pelo intenso peristaltismo do intestino delgado. O leo um stio de transio bacteriolgica, entre a escassa populao bacteriana do jejuno e a densa microbiota do clon. No clon as bactrias encontram condies favorveis para sua proliferao devido ao peristaltismo lento e abundante suprimento nutricional (BRANDT et al., 2006; LUTGENDORFF et al., 2008).

20 A colonizao do trato gastrointestinal influenciada tambm, pela capacidade de ligao das bactrias em receptores denominados stios de adeso na mucosa intestinal. As espcies com esta caracterstica tendem a colonizar de forma permanente o trato gastrointestinal, sem necessidade de reintroduo peridica, e constituem a denominada microbiota autctone. Por outro lado, espcies alctones so aquelas externas ao ecossistema intestinal, sem adequada capacidade de aderir a mucosa, e que transitam no local num determinado instante (BRANDT et al., 2006; LUTGENDORFF et al., 2008). As superfcies microbianas que esto em contato com as clulas do hospedeiro devem ser aceitas imunologicamente pelo hospedeiro para evitar o desencadeamento de reaes inflamatrias danosas. Para continuar no intestino, os microrganismos colonizadores devem ser capazes de sobreviver s condies fsicoqumicas do intestino (fluxo intestinal para a digesto, pH e potencial redox) e competir de forma bem sucedida, com as espcies j estabelecidas e outras que estejam tentando ocupar os mesmos stios intestinais (MOUNTZOURIS & GIBSON, 2005). A microbiota intestinal autctone modifica-se durante a infncia, antes de tornarse mais estvel em relao s espcies bacterianas e nvel populacional ao longo do tempo, acompanhando o indivduo durante toda a vida (CHAPMAN & SANDERSON, 2005; BRANDT et al., 2006).

2.1.4 Aes da microbiota sob o hospedeiro

Nos ltimos anos, estudos clnicos e experimentais tm evidenciado que a interao microrganismo-hospedeiro pode influenciar favoravelmente a sade humana de diversas maneiras (ISOLAURI et al., 2004; OHASHI & USHIDA, 2009). HOOPER & GORDON (2001), investigaram extensivamente o papel da microbiota sobre a funo intestinal. Em modelo de camundongo gnotobitico (isento de germes colonizado com bactrias conhecidas), esses pesquisadores conseguiram demonstrar mudanas e maturao na funo intestinal medidas pela expresso dos genes de uma srie de marcadores relacionados com a nutrio, com a funo de barreira, com angiognese e com a diferenciao celular intestinal relacionada a funo imunolgica.

21 Podem-se definir alguns benefcios propiciados pela microbiota como: funes antibacterianas, metablicas, nutricionais e imunomoduladoras (ISOLAURI et al., 2004; BRANDT et al., 2006) Funo antibacteriana as bactrias autctones exercem proteo ecolgica

intestinal, impedindo o estabelecimento das bactrias patognicas. A resistncia colonizao a primeira linha de defesa contra a invaso por patgenos oportunistas. Isto acontece por meio da produo de bacteriocinas, perxido de hidrognio, produo de cidos orgnicos, competio por nutrientes e, por stios de adeso na mucosa (SULLIVAN & NORD, 2005; BRANDT et al., 2006). Funo nutricional e metablica a ao das bactrias sob determinados

nutrientes permite o estabelecimento de funes bioqumicas e digestivas, destacandose: recuperao de energia devido fermentao de carboidratos e protenas da dieta que alcanam intactas o coln; e sntese de vitaminas do complexo B e vitamina K. Os cidos graxos de cadeia curta podem exercer efeito antimicrobiano por diminuir o pH da luz intestinal, facilitando tambm a absoro de gua e sais no coln (MOUNTZOURIS et al., 2002; ISOLAURI et al., 2004). H outras atividades metablicas da microbiota cuja conseqncia para o organismo humano ainda pouco compreendida como a converso do colesterol em coprostanol, de bilirrubina em urobilina e a inativao da tripsina (BRANDT et al., 2006). Funo imunolgica alm das funes antimicrobianas, bioqumicas e

digestivas no seu hospedeiro, a microbiota indgena desempenha papel imunolgico extremamente importante. A microbiota interage com as clulas do epitlio do hospedeiro provocando modulao contnua do sistema imunolgico. Nos estudos realizados em modelos de animais isentos de germes, observou-se que a mucosa intestinal apresentou baixa densidade de clulas linfides, baixo nmero de placas de Peyer com dimenses reduzidas e mnima concentrao de imunoglobulinas circulantes. Aps a colonizao destes animais com microrganismos observou-se desenvolvimento do sistema imunolgico local, com aumento das placas de Peyer, dos linfcitos intraepiteliais e das imunoglobulinas circulantes (BRANDT et al., 2006). Assim, a colonizao bacteriana do trato gastrointestinal importante para o desenvolvimento da homeostase do sistema imunolgico do hospedeiro (OHASHI & USHIDA, 2009).

22

2.2 Probiticos
2.2.1 Definio

O termo probitico foi utilizado pela primeira vez em 1965, em contraste com a palavra antibitico e definido como uma substncia secretada por microrganismo que estimula o crescimento de outro (TEITELBAUM & WALKER, 2002). Recentemente, probiticos foram definidos pela FAO/WHO como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem beneficio sade do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Para que um microrganismo seja considerado probitico ele deve ser incuo, manter-se vivel durante a estocagem e transporte, sobreviver ao pH do lmen gstrico, ao da bile e das secrees pancretica e intestinal. Alm disto, no transportar genes transmissores de resistncia a antibiticos, competir por stios de adeso, impedindo aderncia de outros microrganismos patgenos e exercer benefcios ao sistema imunolgico e a sade em geral do hospedeiro (COPPOLA & GIL-TURNES, 2004; OHASHI & USHIDA, 2009).

2.2.2 Tipos de probiticos

Atualmente, vrios microrganismos so utilizados como probiticos (TAB. 2) (COPPOLA & GIL-TURNES, 2004). A maioria das preparaes com probiticos utiliza o grupo de bactrias designadas como do cido lctico (ex. lactobacilos, estreptococos, enterococos) ou produtoras de cido lctico (bifidobactrias) que so constituintes importantes e habituais da microbiota do TGI de humanos. Grande parte destas espcies no produz apenas cido ltico, mas tambm outras substncias antimicrobianas como perxido de hidrognio e bacteriocinas (SULLIVAN & NORD, 2005). Entretanto, outros microrganismos como a levedura Saccharomyces boulardii, que no so encontrados usualmente no TGI tambm tm sido estudados ou comercializados (PENNER et al., 2005). Uma vez que o probitico no coloniza permanentemente o intestino, ele deve ser consumido diariamente em quantidades suficientes (cerca de 1x109 a 1x1010 UFC/dia), pois para exercer efeitos benficos ao hospedeiro, seu nvel populacional

23 intestinal aps diluio pelas secrees deve ser da ordem de 107 UFC/g de contedo fecal (DUGGAN et al., 2002).

TABELA 2 Microrganismos com propriedades probiticas.

Lactobacilus Bifidobacterium Outras bactrias cido lticas Enterococcus faecalis Bacterias no cido lticas Bacillus cereus var. toyoi Escherichia coli cepa nissle Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii

L. acidophilus

B. adolescentis

L. amylovorus

B. animalis

Enterococcus faecium

L. casei

B. bifidum

Lactococcus lactis

L. crispatus

B. breve

Leuconstoc mesenteroides

L. delbrueckii subsp. Bulgaricus L. gallinarun L. gasseri L. johnssonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus

B. infantis

Pedicoccus acidilactici

B. lactis B. longum

Sporolactobacillus inulinus Streptococcus thermophilus

FONTE: COPPOLA & GIL-TURNES, 2004.

2.2.3 Viabilidade dos probiticos

Atualmente tm-se questionado a segurana quanto utilizao de clulas viveis de probiticos, uma vez que a administrao oral desses microrganismos, especialmente em populaes de riscos, como imunossuprimidos e prematuros, no ausente de perigos potenciais (KATARIA et al., 2009). Os probiticos podem translocar

24 do lmen intestinal para a corrente sangunea gerando aumento acentuado da resposta inflamatria e, em alguns casos como de leveduras probiticas podem desencadear fungicemia (KATARIA et al., 2009; ADAMS et al., 2010). Portanto, de extremo interesse determinar se os mesmos benefcios para a sade observados com a utilizao de clulas viveis de probiticos poderiam ser alcanados com suas clulas no viveis (KATARIA et al., 2009). Vrios estudos tm demonstrado que mesmo mortos pelo calor ou por raios ultravioletas os probiticos manteriam os efeitos benficos para o hospedeiro, uma vez que seus componentes, como a parede celular, continuariam a atuar de forma eficaz (KATARIA et al., 2009; ADAMS et al., 2010). Em recente trabalho LI et al. (2009) mostraram que tanto clulas viveis como no viveis do probitico Lactobacillus rhamnosus GG foi capaz de diminuir mediadores pr-inflamatrios induzidos por LPS e, tambm, contribuiu para aumentar os mediadores anti-inflamatrios. Efeitos benficos utilizando clulas no viveis de probiticos tambm foram observados por LIM et al. (2009). Estes pesquisadores avaliaram o papel do probitico morto no processo alrgico e observaram que os mesmos foram capazes de atuar como imunomoduladores, podendo ser utilizados na preveno secundria ou tratamento de doenas alrgicas respiratrias.

2.2.4 Mecanismos de ao dos probiticos

O modo de ao dos probiticos ainda no foi completamente esclarecido, embora tenham sido sugeridos vrios mecanismos que podem atuar

independentemente ou associados (LUTGENDORFF et al., 2008; OHASHI & USHIDA, 2009). Eles podem influenciar a microbiota intestinal, a funo da barreira intestinal e o sistema imunolgico da mucosa (FIG. 2), exercendo seus efeitos sobre vrios tipos de clulas envolvidas na resposta imunolgica inata e adaptativa, tais como macrfagos, clulas B, clulas T, e clulas NK (NG et al., 2009) Pode-se observar que os mecanismos de ao dos probiticos, assim como seus efeitos, so bastante semelhantes queles propostos para a microbiota intestinal autctone (MARTINS et al., 2005a).

25

FIGURA 2. Representao esquemtica da interao entre probiticos e a mucosa intestinal. Atividade antimicrobiana dos probiticos incluem a (1) produo de (2) competio por nutrientes, (3) inibio da aderncia bacteriana ou translocao, e (4) reduo do pH luminal. As bactrias probiticas podem tambm aumentar a funo de barreira intestinal, por (5) aumento da produo de muco (NG et al., 2009).

Um destes mecanismos a excluso por competio, em que o probitico compete com os patgenos por stios de fixao e nutrientes, impedindo sua ao transitoriamente. A excluso competitiva explica a necessidade da administrao continuada de elevadas doses dos probiticos, para manifestar seus efeitos (COPPOLA & GIL-TURNES, 2004; NG et al., 2009). Os probiticos podem tambm afetar patgenos pela sntese de bacteriocinas, de cidos orgnicos volteis e de perxido de hidrognio ou atuar sobre o metabolismo celular, reduzindo a concentrao de amnia no organismo e liberando enzimas como a lactase (COPPOLA & GIL-TURNES, 2004; NG et al., 2009).

26 Alm desses mecanismos, vrios estudos tm proposto a relao dos probiticos com o aumento da defesa imunolgica da mucosa, mediando o balano da resposta inflamatria por regulao da produo de citocinas pr e antiinflamatrias (ISOLAURI et al., 2004; OHASHI & USHIDA, 2009; NG et al., 2009). O mecanismo de ao dos probiticos relacionados com o sistema imunolgico ainda no foi completamente esclarecido, mas sabe-se que alguns probiticos so fagocitados pelas clulas especializadas no reconhecimento de antgeno (clulas M). Estas clulas por sua vez apresentam esses antgenos s clulas T que so estimuladas a produzirem citocinas. Alm disso, elas estimulam os linfcitos B a produzirem anticorpos, especialmente sIgA, ativando dessa forma o sistema imunolgico (OHASHI & USHIDA, 2009). Outro mecanismo de ao proposto seria de que as bactrias patognicas ativam o fator de transcrio NF-B induzindo desta forma, resposta inflamatria nas clulas epiteliais intestinais. Em contrapartida, os probiticos atuariam atenuando essa reposta inflamatria por bloquear a via de transcrio do NFB (NG et al., 2009). Alguns outros estudos sugerem que os probiticos tambm podem atuar em outros tipos de defesa que no imunolgicos. Vrios mecanismos de ao dos probiticos tm sido propostos para descrever seu efeito protetor na barreira intestinal e conseqentemente na TB, como fortalecimento das junes intestinais do tipo tight e aumento da secreo de muco (RESTA-LENERT & BARRETT, 2003; LUTGENDORFF et al., 2008; NG et al., 2009). Tanto a funo do transporte, de barreira, da diferenciao e do turnover epitelial so conhecidas por regular em parte o sinal de transduo, evento originado do receptor de fator de crescimento epidrmico. A ativao deste fator causa redistribuio dos filamentos de actina para a zona apical do epitlio e incita alteraes nas junes e no citoesqueleto que so associadas ao aumento da resistncia transepitelial e, portanto com aumento da funo de barreira. H evidncias de que os probiticos atuariam nesse mecanismo diminuindo assim, a permeabilidade intestinal (RESTALENERT & BARRETT, 2003; NG et al., 2009).

2.2.5 Efeitos benficos dos probiticos

Vrios estudos tm demonstrado o potencial dos probiticos em contribuir para a sade do hospedeiro (MADDEN et al., 2005; SULLIVAN & NORD, 2005; NG et al., 2009). Os principais benefcios evidenciados com o uso dos probiticos so: aumento

27 da tolerncia lactose; preveno e tratamento de diarrias (induzida por antibioticoterapia; radioterapia; infeco pelo Clostridium difficile) e de doenas inflamatrias intestinais e gastroenterites (MARTEAU & BOUTRON-RUAULT, 2002; SULLIVAN & NORD, 2005); controle da infeco por Helicobacter pylori (MADDEN et al., 2005); reduo de colesterol sangneo, preveno de alguns tipos especficos de cncer (TEITELBAUM & WALKER, 2002) e diminuio da alergia, principalmente em recm-nascidos, por alterao do padro de resposta imunolgica do tipo Th2 para Th1 (DUGGAN et al., 2002). H cada vez mais evidncias sobre os benefcios dos probiticos ligados a modulao da funo imunolgica como: aumento da produo de anticorpos; aumento da atividade das clulas NK; modulao da funo das clulas dendrticas; alterao da produo de citocinas; induo da regulao das clulas T levando a um tnus imunolgico na proporo adequada e modulao da apoptose (PENNER et al., 2005; BERMAN et al., 2006; OHASHI & USHIDA, 2009; NG et al., 2009). MCNAUGHT et al. (2005) em um trabalho envolvendo 103 pacientes crticos, divididos em grupo controle (recebendo terapia convencional), e grupo tratado (recebendo probitico mais terapia convencional), observaram diminuio dos nveis de IL-6 no 15 dia nos pacientes do grupo tratado. Este fato atenuou a resposta imunolgica e, conseqentemente, a resposta inflamatria sistmica desses pacientes. BERMAN et al. (2006), demonstraram a relao dos probiticos com o aumento da funo imunolgica inata. Neste estudo, 10 voluntrios saudveis utilizaram uma mistura de probiticos por oito semanas. Durante este perodo amostras de sangue foram coletadas para investigar a atividade fagocitria. Os resultados obtidos mostraram um significante aumento na atividade fagocitria de moncitos e neutrfilos no decorrer do tratamento, tendo seu ponto mximo no oitavo dia. IMAOKA et al. (2008) em um estudo in vitro utilizando modelo de colite, observaram um aumento na produo de IL-10 quando houve tratamento com probitico. LI et al. (2009) tiveram resultados semelhantes, porm utilizando modelo in vivo de inflamao induzida pela E. coli. Eles verificaram que animais tratados com probiticos tiveram uma menor expresso de marcadores pr-inflamatrios induzidos pelo LPS e um aumento dos mediadores antiinflamatrios. Os benefcios dos probiticos relacionados proteo da mucosa intestinal tambm tm sido estudados nos ltimos anos. Alguns trabalhos tm evidenciado o potencial dos probiticos em aumentar a funo da barreira epitelial, a glicosilao das clulas epiteliais e a produo de sIgA. Todos esses efeitos estariam relacionados com

28 aumento da defesa da barreira, diminuio da permeabilidade intestinal e conseqente proteo contra TB (ISOLAURI et al., 2004; PENNER et al., 2005; ZAREIE et al., 2006). RESTA-LENERT & BARRETT (2003) realizaram um estudo in vitro utilizando linhagens de clulas intestinais expostas a E. coli e a probiticos (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus acidophilus). Os resultados obtidos demonstraram que as clulas expostas aos probiticos tiveram aumento na resistncia transepitelial e, que este aumento foi acompanhado por alteraes no citoesqueleto levando ao aumento da resistncia das junes tight e diminuio da permeabilidade celular. Em estudo mais recente RESTA-LENERT & BARRETT (2006) analisaram o papel do sistema imunolgico sobre a mucosa, utilizando clulas intestinais expostas a citocinas (IFN- ou TNF-) por 48 horas e outro grupo de clulas intestinais expostas s mesmas citocinas mais probiticos. Os resultados demonstraram que ambas as citocinas aumentaram a permeabilidade intestinal, e que esse efeito foi minimizado pelo tratamento com probiticos. CABALLERO-FRANCO et al. (2007) mostraram que a administrao oral de probitico em ratos, aumentou o contedo luminal basal de mucina em 60%. Alm disso, houve aumento na expresso do RNAm e secreo de mucina extracelular, inibindo a adeso de E. coli enteropatognica a clulas epiteliais intestinais. Este fato sugere papel protetor dos probiticos via secreo de muco.

2.2.6 Saccharomyces boulardii

2.2.6.1 Consideraes gerais

A levedura Saccharomyces boulardii um dos poucos microrganismos utilizados como probiticos que no so de origem humana (MARTINS et al., 2005a). Foi descoberta em 1920, na Indochina, onde Henri Boulard, um microbiologista francs, estava procura de uma linhagem de levedura que fosse capaz de suportar altas temperaturas na produo de vinho. Na mesma poca houve epidemia de clera em uma das vilas que ele visitava e ele foi informado que a populao local preparava um ch com a casca de uma fruta da regio (lichia) para aliviar e at mesmo parar a diarria. Posteriormente, verificou-se que a fruta estava recoberta por uma levedura, e que a eficcia contra a diarria devia-se a ela. A levedura ento descoberta foi chamada de Saccharomyces boulardii (MCFARLAND & BERNASCONI, 1993).

29 A S. boulardii (FIG.3) uma levedura no patognica, termotolerante (cresce temperatura de 37C) e atualmente, seu uso est muito difundido em medicina principalmente, na Europa (MARTINS et al., 2005a; CZERUCKA et al., 2007). Destaca-se ainda que, a levedura insensvel ao dos sucos digestivos e drogas antibacterianas. Sua administrao deve ser realizada de maneira repetida e regular, pois ela no coloniza o trato gastrointestinal (GAON et al., 2003; MARTINS et al., 2005a), embora seja capaz de atingir rapidamente altas concentraes no clon. Dois a cinco dias aps a descontinuao do seu uso ela no mais encontrada nas fezes. (MARTINS et al., 2005a).

FIGURA 3. Viso microscpica da levedura Saccharomyces boulardii. Disponvel em : <http://www.bioplanet.net/magazine/bio_mayjun_2000> Acesso em 03 outubro 2006.

2.2.6.2 Benefcios da levedura na sade humana

Diversos estudos tm demonstrado alguns mecanismos de ao especficos da S. boulardii como: secreo de protease que cliva as toxinas produzidas pelo C. difficile; secreo de protenas que exercem efeitos anti-secretrios no caso da toxina do Vibrio cholerae; adeso de alguns patgenos na levedura; (MARTINS et al. 2010); inibio de perdas de gua, sdio e potssio induzidas pela toxina do V. cholerae e de E. coli em clulas epiteliais intestinais (MARTINS et al., 2005a) e adeso da toxina em receptores especficos na levedura (BRANDO et al., 1998). No caso de infeces do TGI, benefcios clnicos significantes em humanos tm sido demonstrados com a utilizao de S. boulardii como: 1. preveno da diarria associada infeco por Clostridium difficile (SURAWICZ, 2003); 2. preveno de

30 diarria associada antibioticoterapia (DSOUZA et al., 2002); 3. reduo de diarrias persistentes em crianas (GAON et al., 2003); e preveno e tratamento da diarria do viajante (MARTINS et al., 2005a). Estudos com animais demonstraram que administrao de S. boulardii propiciou proteo contra leses intestinais causadas por diarria induzida por patgenos (CZERUCKA et al., 2000). Administrao de S. boulardii em camundongos gnotobiticos e convencionais demonstrou que a levedura protege esses animais contra infeces por Salmonella typhimurium e Shigella flexneri. (RODRIGUES et al., 1996). Outros mecanismos de ao da levedura tambm evidenciados incluem: preservao da funo da barreira intestinal, por meio do aumento da resistncia transepitelial e imunomodulao (CZERUCKA et al., 2000), diminuio da

permeabilidade intestinal (VILELA et al., 2008), alm de efeitos diretos na mucosa intestinal levando a aumento da produo de sIgA (DALMASSO et al., 2006b). Todos estes mecanismos contribuem para o aumento da proteo da mucosa e conseqente preveno da TB. CZERUCKA et al. (2000) realizaram estudo, in vitro, utilizando clulas humanas do coln T84, infectadas com E. coli e tratadas com S. boulardii. Os resultados obtidos demonstraram que S. boulardii preveniu a diminuio da resistncia transepitelial causada pela infeco por E. coli, e preservou as junes intra-epiteliais, favorecendo a manuteno da barreira intestinal. A levedura no modificou o nmero de bactrias aderidas, mas reduziu em 50% o nmero de bactrias intracelulares, importante via para a TB. Em um trabalho mais recente VILELA et al. (2008), avaliaram o papel do S. boulardii na permeabilidade intestinal em pacientes com doena de Crohn. Os resultados obtidos mostraram que os pacientes tratados com a levedura obtiveram resultados benficos, apresentando diminuio na permeabilidade intestinal. DALMASSO et al. (2006b) avaliaram a ao da levedura nas clulas inflamatrias utilizando modelo de doena infamatria intestinal. Estes autores concluram que o S. boulardii age na inflamao por alterao especfica do comportamento migratrio das clulas T, que se acumulam nos linfonodos mesentricos. Portanto, o tratamento S. boulardii limitaria a infiltrao de clulas Thelper 1 em clulas do clon inflamado e a inflamao induzida pela produo de citocinas pr-inflamatrias.

31 A influncia do S. boulardii na secreo de citocinas de linfcitos intra-epiteliais infectados com E. coli e Candida albicans foi investigada in vitro por FIDAN et al. (2009). Eles observaram que a secreo de citocinas pr-inflamatrias como a IL-1 estava diminuda nos linfcitos infectados e incubados com S. boulardii. Porm houve um aumento da secreo de citocinas anti-inflamatrias como IL-4 e IL-10. Estes resultados demonstram que S. boulardii pode atuar reduzindo a resposta prinflamatria. Alguns estudos in vivo, demonstraram tambm a capacidade do S. boulardii em reduzir a TB (HEREK et al., 2004; GEYIK et al., 2006). GEYIK et al. (2006), realizaram um estudo com 60 ratos em um modelo de ictercia obstrutiva. Os animais foram tratados por sete dias com salina ou S. boulardii, sendo observada uma reduo significativa na translocao no grupo tratado com a levedura.

2.2.7 A levedura UFMG 905

Poucas leveduras tm sido estudadas como possveis probiticos e agentes bioteraputicos, sendo a S. boulardii uma das primeiras e praticamente a nica comercializada e utilizada em medicina. Porm, outras Saccharomyces spp. ou linhagens de outros gneros de leveduras provavelmente devem possuir atividade probitica similar, ou melhor, que a S. boulardii (MARTINS et al., 2005b). Por ser uma das maiores do mundo, a biodiversidade brasileira representa uma fonte de grande potencial para microrganismos candidatos ao uso como probiticos. Neste contexto, o Laboratrio de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais props estudar espcies de leveduras ambientais e agroindustriais isoladas no pas como possveis agentes teraputicos (MARTINS et al., 2005b). Doze linhagens de S. cerevisiae isoladas de diferentes fontes (insetos, frutos tropicais, queijos, esturio e alambique de cachaa) foram testadas in vitro e in vivo para avaliar uma possvel capacidade probitica. As leveduras foram testadas quanto capacidade de sobreviver no trato digestivo de mamferos e de proteo contra patgenos. Os dados obtidos demonstraram que a levedura S. cerevisiae UFMG 905, derivada da produo da cachaa, foi a nica que mostrou melhores dados em relao sobrevida no trato digestivo e proteo contra o desafiados experimental com Salmonella Typhimurium e Clostridium difficile em camundongos (MARTINS et al.,

32 2005b e c). Adicionalmente, os animais tratados tiveram melhor preservao dos tecidos do fgado e menor infiltrado inflamatrio quando comparado com o grupo controle. Melhor preservao do trato intestinal tambm foi observada nos animais tratados (MARTINS et al., 2005b). Dados recentes mostraram tambm um efeito imunomodulador da levedura (MARTINS et al., 2007). Estes dados sugerem que esta levedura pode inibir ou reduzir a translocao de patgenos, porm tornam-se necessrios mais estudos in vivo, assim como a avaliao da sua funo imunomoduladora e proteo da barreira intestinal, a fim de concretizar o seu possvel uso como probitico.

33

2.3 Translocao bacteriana

2.3.1 Consideraes Gerais

O termo translocao bacteriana (TB) definido como a passagem de microrganismos viveis ou no e de seus produtos, como endotoxinas, do lmen intestinal para os linfonodos mesentricos, assim como para outros rgos mais internos, levando a estimulao do sistema imunolgico (LICHTMAN, 2001; WIEST & RATH, 2003; GATT et al., 2007). Foi evidenciado que as bactrias Gram negativas anaerbias facultativas translocam mais facilmente que as anaerbias estritas e as Gram positivas (WIEST & RATH, 2003), isto porque o oxignio sanguneo inibe o crescimento de bactrias entricas anaerbias (LICHTMAN, 2001). H vrias evidncias de que a TB est associada ao aumento da incidncia de complicaes spticas (MACFIE et al., 1999; WIEST & RATH, 2003). A relao entre TB e sepse foi demonstrada por OBOYLE et al., (1998), que avaliaram a TB em 448 pacientes cirrgicos submetidos laparotomia. Neste estudo foi realizada a cultura dos linfonodos mesentricos e sangue dos pacientes. Os resultados obtidos mostraram que a translocao ocorreu em 15,4% dos pacientes, e que o microrganismo mais comum identificado foi E. coli. Alm disso, 41% dos pacientes que tiveram translocao desenvolveram sepse, comparado com os 14% dos pacientes que apresentaram cultura negativa. Estes dados demonstram que a TB est associada com significante aumento do desenvolvimento de sepse ps-operatria em pacientes cirrgicos.. Em um trabalho mais recente MACFIE et al. (2006) avaliaram a TB em 927 pacientes e observaram sua prevalncia em 14%, alm de forte relao com aumento da sepse ps - operatria. A TB tambm pode ocorrer em indivduos sadios. H evidncias de que o processo de TB, desde que em nvel baixo, possa ser um importante evento fisiolgico para alertar e preparar o sistema imunolgico do hospedeiro. Em recente estudo SALZEDAS-NETTO et al. (2006) demonstraram, uma reduo significativa da TB quando os animais utilizados (ratos) foram previamente desafiados com a mesma bactria utilizada para a induo da TB. Sendo assim, possvel que a TB ocorra para que o TGI possa expor amostras de antgenos do interior do lmen, gerando clulas imunocompetentes, processo conhecido como tolerncia oral (GATT et al., 2007).

34 2.3.2 Mecanismos da translocao bacteriana

Os principais mecanismos envolvidos na promoo da TB so: 1. alteraes na microbiota gastrointestinal resultando em crescimento microbiano exagerado; 2. alteraes fsicas da barreira intestinal (por exemplo: injria dos entercitos devido a radiao ou a toxinas ou por reduo do fluxo sanguneo para o intestino); 3.deficincia da resposta imunolgica do hospedeiro (FIG. 4) (BERG, 2001; LICHITMAN, 2001; WIEST & RATH, 2003).

Trauma/ Choque Hipoperfuso intestinal TNP Antibiticos Anticidos Diminuio na motilidade Danos da isquemia
Endotlio / Ativao de cel. endoteliais

Epitlio

Imunussupresso Clulas de Payer Linfonodos mesentricos

Hipxia da mucosa Acidez Depleo de ATP

Ativao de neutrfilos Ativao de macrfagos e do complemento

Colonizao do intestino proximal Crescimento bacteriano exagerado

Permeabilidade intestinal

Citocinas Pr Infamatrias Oxidantes Proteases

Injria pela reperfuso Xantina oxidase

GALT Leses no fgado

Injria a outros tecidos Translocao de bactrias Endotoxinas Exotoxinas

Sepse

Falncia Mltipla de rgos

FIGURA 4. Mecanismos de translocao bacteriana. A hipoperfuso intestinal pode provocar isquemia levando a danos no epitlio, aumentando a permeabilidade intestinal. O crescimento bacteriano exagerado e alteraes na barreira intestinal tambm contribuem para translocao. A imunossupresso contribui essencialmente para a propagao das bactrias e de seus produtos levando aos estgios de sepse e falncia mltipla de rgos (WIEST & RATH, 2003).

35 2.3.2.1 Crescimento bacteriano exagerado

O trato gastrointestinal um rgo dinmico podendo influenciar direta ou indiretamente a translocao intestinal de partculas (WIEST & RATH, 2003). Toda vez que ocorre desequilbrio no balano ecolgico, ou seja, alterao na microbiota intestinal influenciado por antibioticoterapia, acidez gstrica, diminuio da produo de muco, ictercia obstrutiva e alteraes na motilidade intestinal, o crescimento bacteriano exagerado favorecido, levando a um aumento na colonizao do trato gastrointestinal facilitando a TB (NAABER et al., 2000; BERG, 2001; WIEST e RATH, 2003). Somente alguns tipos de bactrias intestinais so capazes de translocar para os linfonodos mesentricos, estes incluem E. coli; Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococci, e alguns Streptococci (WIEST & RATH, 2003). Recentemente, tem sido demonstrado que a capacidade para translocar melhor em algumas espcies especficas, sendo atribuda melhor aderncia e facilidade de penetrao no muco e na camada epitelial quando comparado com as espcies no patognicas. Alm disso, diferena da virulncia entre as espcies, adicionada resistncia do hospedeiro so fatores que determinam a sobrevivncia e a propagao das espcies mais virulentas (WIEST & RATH, 2003). A relao entre a colonizao intestinal e a TB foi demonstrada por MACFIE et al. (1999), em estudo prospectivo com 279 pacientes cirrgicos, nos quais aspiraes nasogstricas foram retiradas, colocadas em meio de cultura e comparadas com as culturas obtidas do linfonodo mesentrico retirado dos mesmos durante a laparotomia. Alm disso, o curso do ps-operatrio de todos os pacientes foi monitorado utilizando culturas de sangue e urina, para confirmao de sepse ps-operatria. A TB foi confirmada quando as culturas dos linfonodos foram positivas. Os resultados desse estudo indicaram que a colonizao bacteriana ocorreu mais freqentemente nos pacientes idosos com enfermidades gstricas ou intestinais que necessitaram de operao de urgncia. Os dados tambm mostraram que a colonizao predisps translocao. A TB ocorreu em 21% dos pacientes e foi significantemente mais frequente naqueles que tiveram cultura da aspirao nasogstrica positiva. Este estudo confirma que a colonizao intestinal proximal, comum em pacientes crticos, est associada com aumento da TB e da morbidade sptica.

36 2.3.2.2 Alteraes na barreira intestinal

2.3.2.2.1 Permeabilidade intestinal

A defesa do hospedeiro contra a invaso de microrganismos consiste, principalmente, na barreira mucosa intestinal. Ela composta por numerosos fatores locais como: muco, cido gstrico, enzimas pancreticas, bile, barreira celular epitelial com junes intracelulares, motilidade intestinal e bactrias que compem a microbiota (MARCHIANDO et al., 2010). Estruturalmente o epitlio intestinal compreendido por camada nica de clulas colunares organizadas entre vilosidades e criptas. A unio entre os entercitos ocorre por meio dos desmossomos, junes tight e Gap (WIEST & RATH, 2003). Entre os numerosos componentes da barreira intestinal, as junes paracelulares do tipo tight desempenham um papel essencial no controle da permeabilidade intestinal (CENAC et al.,2003). Elas permitem a comunicao intercelular e a passagem somente de pequenas molculas, impedindo a passagem de bactrias e tambm de molculas maiores, como lipolissacardeos (WIEST & RATH, 2003). As mucinas secretadas pelas clulas epiteliais criam um gel viscoso impedindo a penetrao de bactrias patognicas. O muco tambm age como lubrificante, reduzindo a abraso fsica mucosa e protegendo os danos induzidos por cidos e outras toxinas luminais. O transporte ativo de cloreto pelas clulas epiteliais promove um fluxo fluido intraluminal que lava os agentes danosos enquanto a bile atua diminuindo a internalizao de patgenos pelo epitlio. (WIEST & RATH, 2003; MACFIE, 2004). A microbiota intestinal tambm atua na defesa do hospedeiro, competindo com bactrias patognicas pelos stios de adeso na mucosa impedindo que estas se liguem, secretando substncias como bacteriocinas, alm da competio direta por nutrientes (COPPOLA & GIL-TURNES, 2004). Todos estes mecanismos ajudam a prevenir a ligao da bactria ao epitlio, evento proposto como o primeiro passo para a penetrao da bactria nas clulas epiteliais, levando a TB (WIEST & RATH, 2003; MACFIE, 2004). Alm disso, h uma interao entre a barreira intestinal, a microbiota e o sistema imunolgico que podem atuar promovendo ou impedindo doenas (FIG.5). A barreira epitelial normalmente restringe a passagem do contedo da luz intestinal, incluindo microrganismos e seus produtos, mas uma pequena frao desses materiais consegue passar gerando uma ativao benfica do sistema imunolgico. Porm, em situaes

37 de desequilbrio pode haver perda da funo da barreira intestinal promovendo maior passagem do contedo luminal, levando a uma superativao do sistema imunolgico.

FIGURA 5 Diagrama simplificado mostra como clulas dendrticas (CD), macrfagos (M), e clulas T podem reagir ao contedo luminal via receptores de antgenos especficos de clulas T (TCR). A clula T responde a estmulos antignicos tornando-se Th1 e Th2. Estas adaptaes do sistema imunolgico inato levam a liberao de citocinas que exercem efeitos inflamatrios (TNF- e INF-) e antiinflamatrios (IL-10, TGF-). Na ausncia de adequada imunoregulao as citocinas pro - inflamatrias sobressaem levando a ativao de sinal de transduo e com isso, afrouxamento das junes do tipo tight e disfuno de barreira, o que permite um aumento na quantidade de material luminal levando a um ciclo de autoamplificao (MARCHIANDO et al., 2010).

A avaliao das alteraes na permeabilidade intestinal pode ser feita por meio de testes especificamente designados para medir a funo da barreira intestinal, como a determinao da passagem paracelular de molculas grandes como acares e

38 frmacos, do intestino para o plasma e conseqentemente para urina (LICHITMAN, 2001; KATOUZIAN et al., 2005). Os testes mais comuns empregados na anlise da permeabilidade intestinal utilizam a medida de molculas de polissacardeos (ex. lactulose/ramnose), que resistem degradao pelas dissacaridases, na urina de 24 horas (BJARNASON, et al., 1995; KATOUZIAN et al., 2005). Porm, apesar de ser um mtodo sensvel ele apresenta algumas desvantagens como a necessidade de um volume grande de urina e por ser mtodo caro em estudos com animais devido utilizao de gaiolas metablicas. Alm disso, sendo um acar ele contra-indicado em modelos com supercrescimento microbiano, pois pode ser fermentado levando a uma leitura errada do resultado (KATOUZIAN et al., 2005). Atualmente, substncias marcadas com istopos radioativos, como e
99m 99m

Tc-EDTA

Tc-DTPA tambm tm sido utilizadas, como alternativa, no estudo da

permeabilidade intestinal tanto na urina como no plasma obtendo bons resultados (JORGENSEN et al., 2006; VARELLA et al., 2006). Em recente trabalho VIANA et al. (2009) avaliaram a permeabilidade intestinal de camundongos, submetidos a obstruo intestinal, por meio da determinao do percentual de
99m

Tc-DTPA encontrado no

sangue dos animais, mostrando uma boa sensibilidade do mtodo em avaliar alteraes na permeabilidade celular.

2.3.2.3 Resposta imunolgica

O trato intestinal um rgo imunolgico ativo, contendo todos os tipos de elementos envolvidos na resposta imunolgica (BERG, 2001). O tecido linftico associado ao intestino (GALT) o maior rgo imunolgico do corpo, contendo 25% da massa das clulas imunolgicas da mucosa. Este rgo abrange o epitlio, o interior da submucosa e da lmina prpria, incluindo mais da metade das clulas linfides, placas de Peyer, epitlio folicular associado (constitudo de clulas M), linfcitos intraepiteliais, macrfagos, neutrfilos e clulas dendrticas (WIEST & RATH, 2003). As clulas M so importante componente do GALT, pois muitas vezes constituem a defesa inicial contra os microrganismos do lmen intestinal para o epitlio. As clulas M so um tipo no usual de clulas epiteliais, pois no possuem em sua superfcie microvilosidades ou glicoclix. Elas tm citoplasma bastante prolongado com extenses para dentro da lmina prpria formando uma bolsa, onde antgenos so

39 fagocitados por macrfagos, e ento penetram nas placas de Peyer. As placas de Peyer so formadas por folculos linfides que liberam linfcitos aps o processamento de antgenos (SAWAI et al., 2001). Quando este sistema (FIG. 6) atua, os antgenos so transportados pelas clulas M at as clulas apresentadoras de antgenos (macrfago e clulas dendrticas) presentes nos linfonodos mesentricos. Ocorre ento o processamento e

apresentao dos antgenos aos linfcitos T CD4+ e clulas B inativas. Estes apresentam a segunda linha de defesa contra a translocao e iniciam a produo de citocinas. Os linfcitos T induzem a produo de citocinas TH1 e TH2. Citocinas TH1 (IL-2, INF- e TNF-) estimulam a imunidade celular, resultando em ativao de macrfagos, neutrfilos e linfcitos T, principalmente linfcitos TCD8 +. As citocinas TH2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13) so responsveis pela ativao de linfcitos B, regulando deste modo a produo de anticorpos (KUDSK, 2002). largamente aceito que os nveis de citocinas aps um insulto inflamatrio, como por LPS (lipopolissacardeos), so caracterizados por aumento inicial e subseqente diminuio do TNF- , seguido por IL-1, IL-6 e IL-10 respectivamente. Entretanto muitos pacientes com sepse exibem elevaes constantes nos nveis de TNF-, IL-1 e IL-6 at sua morte (MARCHIANDO et al., 2010). A presena da imunoglobulina sIgA aumenta fortemente a funo de barreira do intestino, desempenhando papel fundamental na formao da resposta imunolgica colonizao microbiana (RODRIGUES et al., 2000). A sIgA considerada um dos principais mecanismos de proteo mucosa, pois ela se liga aos microrganismos patgenos reduzindo a associao destes com o epitlio e diminuindo assim sua penetrao (BERG, 1995). SAWAI et al. (2001), em um estudo sobre os efeitos da sIgA no processo de TB sugeriram que esta imunoglobulina se liga diretamente a E. coli, impedindo sua aderncia a superfcie epitelial. Baixas concentraes de sIgA intestinal esto de fato associadas com aumento da aderncia bacteriana mucosa. O papel das clulas T foi examinado em camundongos isentos de CD4+ ou CD8+, por injeo intraperitonial de anticorpos monoclonais anti-T. A completa depleo de CD4+ ou CD8+ ou ambos no epitlio intestinal, lmina prpria e linfonodos promoveu translocao de E.coli. Alm disto, a transferncia de CD4+ ou CD8+ ou ambos para os camundongos depletados reduziu a TB. Estes resultados evidenciam que as clulas T desempenham importante papel na defesa do hospedeiro contra a TB (BERG, 1995).

40

FIGURA 6. Mecanismos da resposta imunolgica na TB. Clulas dendrticas (CD) medeiam o transporte de bactrias comensais para interior das clulas intetsinais. As clulas M do epitlio intestinal podem trazer bactrias para dentro do GALT onde as CD englobam os microrganismos. CD apresenta os antgenos capturados para os linfcitos T e B localizados no GALT, ou nos linfonodos mesentricos. A apresentao do antgeno para os linfcitos B desencadeia a produo de IgA responsvel por prevenir a adeso das bactrias a mucosa (KRAEHENBUULH & CORBETT, 2004).

41 2.3.3 Probiticos e Translocao Bacteriana

Atualmente, o aumento de evidncias sobre os benefcios da manuteno e promoo da microbiota intestinal humana tem levado ao aumento de estudos envolvendo o tratamento de diversas enfermidades, incluindo a TB, com probiticos e prebiticos (SCHMIDT & MARTINDALE, 2003). A utilizao dos probiticos na

preveno da TB uma terapia alternativa e atua na manuteno do balano da microbiota intestinal, assim como na modulao do sistema imunolgico (SALZEDASNETTO, 2006). RAYES et al. (2002) realizaram estudo com 95 pacientes submetidos a transplante heptico. Estes foram divididos em trs grupos: o grupo 1 recebeu frmula enteral padro mais descontaminao intestinal com antibiticos; o grupo 2 recebeu frmula enteral com fibras mais probiticos vivos; e o grupo 3 recebeu frmula enteral com fibras mais probiticos mortos. Os resultados obtidos demonstraram reduo

significativa de infeco bacteriana no grupo tratado com probiticos vivos (13%) quando comparado com o grupo controle (48%) e com o grupo tratado com probiticos inativos (34%). Alm disso, o grupo tratado com probiticos vivos apresentou menor tempo de terapia medicamentosa e de internao hospitalar. EIZAGUIRRE et al. (2002) determinaram os efeitos da administrao de probiticos na TB no modelo de intestino curto em ratos. No seu estudo, os animais foram divididos em trs grupos: grupo 1 simulado (Sham); grupo 2 cirurgia com 80% de resseco intestinal; grupo 3 - o mesmo procedimento cirrgico mais com pretratamento por 10 dias com probiticos inoculados por gavagem. Os resultados mostraram que a incidncia de TB foi significantemente menor no grupo tratado com probitico (50%) quando comparado com o grupo no tratado (87%). E ainda, os animais do grupo tratado com probiticos apresentaram ganho de peso maior e mais rpido quando comparado com o grupo no tratado, apesar dos valores no terem diferido estatisticamente. SEEHOFER et al. (2004) tambm encontraram efeitos benficos com a utilizao de probiticos no processo de TB. Neste estudo 68 ratos foram divididos em sete grupos: grupo 1 - Sham; o grupo 2 - os animais passaram por operao para remoo de 70% do fgado; grupo 3 - sofreu anastomose colnica; grupo 4 - os animais tiveram 30% do fgado removido mais anastomose colnica; grupo 5 - passou pelo mesmo procedimento mais tratamento com uma combinao de probiticos e fibras administrados por gavagem dois dias antes e depois da operao; o grupo 6 - os

42 animais tiveram 70% do fgado removido mais anastomose colnica; grupo 7 - passou pelo mesmo procedimento mais tratamento com uma combinao de probiticos e fibras administrados por gavagem dois dias antes e depois da operao. A TB ocorreu em todos os grupos, porm foi maior nos grupos que passaram pela resseco parcial do fgado mais anastomose colnica. A administrao de probiticos levou a reduo do nmero total de bactrias que colonizaram o ceco, especialmente as Gram negativas e enterococos e aumentou o nmero de lactobacilos. A administrao de probiticos tambm reduziu significativamente a TB nos linfonodos mesentricos. Houve reduo da TB para fgado e bao a diferena no foi estatisticamente significativa.

43

2.4 Obstruo Intestinal

2.4.1 Definio

Obstruo intestinal (OI) definida como a interrupo total ou parcial do fluxo do contedo intestinal devido obstculo mecnico ou interferncia de um mecanismo funcional, podendo ocorrer sbita ou progressivamente (DANI & CASTRO, 1993). H vrios critrios para classific-la quanto: ao nvel (delgado alto e baixo ou clon), ao grau (completa, incompleta - subocluso ou ala fechada), ao estado de circulao sangnea (simples ou estrangulada), ao tipo de evoluo (aguda ou crnica) e natureza da obstruo (mecnica, vascular ou funcional) (VIDAL, 2005). Ao que se verifica, em torno de 20% das cirurgias por quadros de abdome agudo so de pacientes com OI. As principais causas so: adeses ps-cirrgicas (correspondem a 40% dos casos de OI), hrnias (12%), tumores (15%) e doenas inflamatrias intestinais, como a doena de Crohn obstrutiva (15%) (MACUTKIEWICZ & CARLSON 2005; BROWN & ADAMS 2002). Pelo fato da maioria das operaes ser de urgncia, as complicaes psoperatrias so freqentes. As mais observadas so: infeco de parede, leo prolongado, sepse e complicaes pulmonares (VIDAL, 2005). Porm, recentemente, com a evoluo dos mtodos de diagnstico e dos tipos de tratamentos, o ndice de mortalidade devido OI est em torno de 10% (BROWN & ADAMS 2002; CHANG et al., 2001).

2.4.2 Fisiopatologia

A OI resulta em alteraes significantes da fisiologia intestinal. Uma vez que o intestino obstrudo, h uma interrupo total ou parcial do fluxo intestinal levando ao acmulo de gases e de secrees intestinais e diminuio do peristaltismo, provendo distenso abdominal. Todos esses fatores associados favorecem o crescimento bacteriano exagerado, alm de alteraes na funo imunolgica. Essas bactrias provocam um aumento da fermentao e, conseqentemente, um aumento da produo de gases e da presso osmtica intraluminal. O aumento da presso intraluminal por sua vez promove a sada de eletrlitos dos capilares para o lmen

44 intestinal e leva a reduo da perfuso no intestino podendo gerar isquemia e necrose (SAGAR et al., 1995; AKIN et al., 2002; CHANG et al., 2001) Ainda, durante a hipoperfuso, ocorre acidose da mucosa devido ao aumento da concentrao de CO2. Em conjunto, esses eventos favorecem alteraes da permeabilidade intestinal e podem levar a TB (SAGAR et al., 1995; AKIN et al., 2002; CHANG et al., 2001)

2.4.3 Obstruo Intestinal e Translocao Bacteriana

Diversos trabalhos tm estudado as alteraes provocadas pela OI (CHANG et al., 2001; AKIN et al., 2002; OLIVEIRA et al.; 2006; QUIRINO et al.; 2007). Os efeitos da OI na mucosa endotelial e na TB em ratos foram avaliados por CHANG et al. (2001). Os resultados obtidos neste estudo mostraram diminuio do nmero das vilosidades intestinais, e aumento do escore do dano mucosa, alm do aumento da TB nos ratos obstrudos quando comparados com o grupo controle. AKIN et al. (2002) verificaram a presena de TB utilizando o modelo de OI em ratos. A obstruo foi induzida por ligadura do leo distal a 5 cm da vlvula leo cecal, e aps 24 horas foi observado um significante aumento da populao de bactrias no intestino, alm da sua presena nos linfonodos mesentricos, fgado, pulmo e sangue. QUIRINO et al. (2007) e VIANA et al. (2009) tambm verificaram a presena de TB no modelo de OI em ratos utilizando
99m

Tc-E. coli. Os nveis de TB no sangue,

fgado, bao, pulmo e linfonodos mesentricos foram significantemente maiores nos ratos obstrudos quando comprados com o grupo Sham.

45

2.5 Istopo Radioativo

O
99m

Tecncio (99mTc) um radioncleo artificial originado da desintegrao

99m

radioativa do

Molibdnio, istopo proveniente da fisso nuclear do urnio (DINIZ, et

99m

al., 1999). Por ser um metal deficiente em eltrons, o

Tc reage principalmente com

grupos doadores de eltrons como aminas, amidas, tiis, sulfidrilas e isonitrilas. Essa propriedade utilizada para a marcao de frmacos como o DTPA e bactrias. Na marcao de bactrias, o mais provvel que o
99m

Tc reaja principalmente com

estruturas proticas, j que estas possuem grupos doadores de eltrons. Esta reao pode ocorrer com protenas que constituem a parede celular bacteriana e/ou com protenas citoplasmticas. A clula bacteriana permanece preservada aps o procedimento de marcao (DINIZ et al., 1999). Normalmente os estudos que investigam a TB utilizam o mtodo de cultura dos linfonodos mesentricos para quantific-la (WIEST & RATH, 2003). Entretanto, essa tcnica pode subestimar os nveis de TB, uma vez que no detecta fragmentos de bactrias e bactrias no viveis, que tambm estimulam a resposta imunolgica podendo desencadear sepse (WHITE et al., 2006). Alm disso, um mtodo extremamente trabalhoso exigindo condies asspticas. (WIEST & RATH, 2003). Diversos trabalhos tm utilizado bactria marcada com radioatividade como mtodo de identificao da translocao, obtendo-se bons resultados (OLIVEIRA et al. 2006; WHITE et al., 2006; QUIRINO et al, 2007; VIANA et al., 2009). Este mtodo apresenta a vantagem de no necessitar de condies asspticas, pois no utiliza cultivo bacteriano e mais rpido que o mtodo convencional.

46

CAPTULO I O tratamento com clulas viveis e no viveis de Saccharomyces boulardii preserva a integridade intestinal e reduz a translocao bacteriana num modelo de obstruo intestinal em camundongos Resumo
Existem evidncias de que probiticos podem proteger o TGI contra episdios patolgicos ou infecciosos. Os efeitos do tratamento oral com clulas viveis ou no viveis de S. boulardii (Sb) sobre a TB, permeabilidade intestinal, e alguns aspectos da histologia do leo e do sistema imunolgico foram avaliados em modelo de OI em camundongos. Quatro grupos de animais foram utilizados: Grupo I Sham (camundongos submetidos apenas a laparotomia); Grupo II OI (camundongos submetidos OI); Grupo III OI+Sb (camundongos submetidos OI aps tratamento prvio com clulas viveis da levedura); Grupo V OI+Sb no vivel (camundongos submetidos a Ol aps tratamento prvio com clulas no viveis da levedura). A TB, permeabilidade intestinal e leses histolgicas intestinais foram significativamente maiores no grupo OI quando comparado ao grupo Sham. Pr-tratamento com clulas viveis e no viveis de S. boulardii impediram estes aumentos e os dados obtidos para estes grupos foram semelhantes aos observados no grupo Sham. Os nveis sanguneos de IL-10 e intestinais de sIgA foram maiores nos animais que receberam os tratamentos com probiticos quando comparados com o grupo OI. Concluso: O tratamento oral com clulas viveis ou no viveis de S. boulardii reduz a permeabilidade intestinal, a TB e as leses intestinais, com modulao do sistema imunolgico em modelo murino de OI. Este efeito protetor independe da viabilidade da clula.

PALAVRAS-CHAVES: translocao bacteriana, S. boulardii, IL-10, sIgA, histologia

47

1 INTRODUO
Existem evidncias significativas que suportam a idia de que a microbiota intestinal equilibrada confere funes importantes para a sade do hospedeiro, tal como a proteo contra bactrias patognicas. Em condies normais, a composio da microbiota estvel, mas pode ser alterada devido a vrios fatores como: mudanas na dieta, medicamentos e estados de estresse (SOETERS, 2008). Nessas situaes, a microbiota normal rapidamente substituda pela proliferao de microrganismos patognicos, alm do aumento simultneo na permeabilidade intestinal (CORREIA & NICOLI 2006; WATKINSON et al., 2007). Disfunes na barreira intestinal podem permitir a penetrao de antgenos luminais, como bactrias e suas toxinas, evento conhecido como translocao bacteriana (TB) (GATT, et al., 2007). A translocao de bactrias e endotoxinas atravs da mucosa pode ser responsvel pela liberao de mediadores e pela ativao de clulas imunolgicas que contribuem para o desenvolvimento de inflamao sistmica e insuficincia mltipla de rgos (GATT et al., 2007; TIMMERMAN et al., 2007; WATKINSON et al., 2007). Trs mecanismos esto envolvidos na TB: crescimento excessivo de bactrias intestinais, deficincias nas defesas imunolgicas, e aumento da permeabilidade ou dano da barreira da mucosa intestinal (LICHTMAN, 2001; WIEST & RATH, 2003; GATT et al., 2007). Aumento da permeabilidade intestinal e TB so comumente observados aps choque, queimadura, ictercia, leso obstrutiva, resseco intestinal, transplante heptico ou obstruo intestinal (OI) e sua prevalncia em torno de 15% nos pacientes submetidos a situaes clnicas descritas acima (MACFIE et al., 2006; GATT et al., 2007 ). O tratamento ou preveno de alteraes na mucosa do intestino utilizando probiticos tem sido relatado (GEYIK et al., 2006; ZAREIE et al., 2006; MOGILNER et al., 2007). Probiticos so definidos como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefcios sade do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Embora essa definio enfatize a necessidade da viabilidade dos probiticos, alguns autores tm demonstrado que seus componentes estruturais, principalmente presentes em suas paredes tambm seriam eficazes, levando a concluir que preparaes utilizando clulas no viveis de probiticos poderiam ser benficas (LI et al., 2009; ADAMS et al., 2010). Saccharomyces boulardii uma levedura no patognica utilizada com eficcia no tratamento de variedade de doenas diarricas. Esta levedura tem sido usada com

48 sucesso para a preveno e/ou tratamento de diarria associada a antibiticos, gastroenterite aguda em crianas e adultos e diarria associada ao Clostridium difficile (BEAUGERIE et al., 2001; TIMMERMAN et al., 2007; WATKINSON et al.,2007; SOETERS, 2008). No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito do S. boulardii na TB e seus mecanismos de ao ainda no esto totalmente esclarecidos (HEREK et al., 2004; GEYIK et al., 2006). H evidncias de que ela atue na modulao do sistema imunolgico sistmico como local (mucosa intestinal), alm de atuar na preservao da barreira intestinal (DALMASSO et al., 2006b; MARTINS et al., 2010). Sendo assim, o presente estudo avaliou o efeito de clulas viveis ou no viveis de S. boulardii na TB, permeabilidade e integridade da barreira intestinal e sistema imunolgico em modelo de OI em camundongos.

2 METDOS
2.1 Microrganismos

Clulas viveis de Saccharomyces boulardii de uma preparao liofilizada comercial (Floratil , Merck SA, Rio de Janeiro, Brasil) foram utilizadas aps seu isolamento em gar Sabouraud dextrose (Difco, Sparks, E.U.A.). Para a utilizao das clulas da levedura no vivel, uma suspenso de S. boulardii foi autoclavada a 121C por 15 minutos e em seguida, uma alquota foi repicada em gar Sabouraud para a confirmao da no viabilidade da levedura. Escherichia coli ATCC 10536 foi obtida da American Type Culture Collection (Rockville, E.U.A.).

2.2 Camundongos

Neste trabalho foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 25 e 35 g. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, recebendo gua e rao ad libitum. Este estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Experimentao Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA / UFMG).

49 2.3 Delineamento experimental

Para cada experimento (determinao da TB, permeabilidade, histologia intestinal e anlises imunolgicas) os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: I. Grupo Sham (gavagem com 0,1 ml de soluo salina; simulao da operao); II. Grupo OI (gavagem com 0,1 ml de soluo salina; laparotomia e ligadura do leo); III. Grupo OI+Sb (gavagem com 0,1 ml de uma suspenso contendo 109 unidades formadoras de colnias (UFC) / ml de S. boulardii; laparotomia e ligadura do leo); IV. Grupo OI+Sb no vivel (gavagem com 0,1 ml de uma suspenso contendo 109 clulas no viveis de S. boulardii, laparotomia e ligadura do leo). Durante dez dias, todos os animais receberam gua e comida ad libitum e gavagem diria com os respectivos tratamentos. Os camundongos foram monitorados diariamente com relao ingesto alimentar e ganho de peso corporal.

2.4 Procedimento cirrgico

No dcimo dia, aps o tratamento com os probiticos, como descrito acima, os animais foram anestesiados, intraperitonealmente, com soluo de cloridrato de 2-(2,6xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina (Dopazen) e cloridrato de ketamina (Dopalen) nas concentraes de 8 mg/Kg e 60 mg/kg, respectivamente. Realizou-se laparotomia mediana de aproximadamente 3 cm, com exposio do ceco e leo terminal. Em seguida, o leo terminal sofreu ligadura com n simples utilizando-se fio de nylon 5.0 (BRASTURE, SP, Brasil). A sutura foi realizada com fio cuticular 5.0. Todos os grupos passaram pelo mesmo processo, exceto o grupo Sham que sofreu apenas laparotomia mediana com posterior sutura do abdmen, simulando o estresse cirrgico (OLIVEIRA et al., 2006; QUIRINO et al., 2007).

2.5 Procedimento de marcao da E. coli

99m

Para avaliao da TB foi utilizado a

Tc-E.coli como

radiotraador sendo

necessrio inicialmente, a marcao da referida bactria com o istopo radioativo. Este procedimento foi realizado conforme descrito por DINIZ et al. (1999). De uma culturame de E. coli foi feito o repique em agar tripticasena (Merck). Aps 18 horas de

50 crescimento a 37oC a bactria foi transferida, para soluo salina estril e sua concentrao ajustada espectrofotometricamente em 31% de transmitncia a 580 nm, correspondente a 108 UFC/ml. Posteriormente, uma alquota dessa suspenso bacteriana (2 ml) foi incubada em tubos contendo 1 ml de soluo de cloreto estanoso (580 mM, pH 7,0) a 37 C por 10 min. Aps a incubao, 37,0-55,5 MBq de 99m-tecncio (99mTc), obtido por eluio do gerador 99Mo/99mTc estril (IPEN / Brasil) foi adicionado e a preparao foi mantida em 37 C por 10 min. Os tubos foram ento centrifugados a 3.000 x g por 25 min. Este procedimento foi repetido trs vezes. Aps a ltima centrifugao, a radioatividade do sobrenadante e precipitado foi medida em calibrador de dose (CRC-25R Dose Calibrator, Capintec, Ramsey, E.U.A.) e o percentual de
99m

Tc incorporado nas clulas bacterianas foi determinada utilizando a

seguinte equao:
cpm (precipitado) % marcao = X 100

cpm (precipitado + sobrenadante)

Onde cpm a contagem por minuto.

2.6 Determinao da translocao bacteriana

No dcimo dia aps os tratamentos descritos acima, 0,1 ml de suspenso contendo 1,8 MBq de
99m

Tc-E.coli foram administrados por gavagem a todos os

animais. Aps 90 minutos, os camundongos (8 animais por grupo) foram submetidos ao procedimento cirrgico supracitado. Dezoito horas aps a operao, os animais foram novamente anestesiados, utilizando-se a mesma tcnica, para retirada de sangue, LMN, fgado, bao e pulmes. Estes foram pesados e colocados em tubos apropriados para a determinao da radioatividade (OLIVEIRA et al. 2006; QUIRINO et al., 2007). As amostras foram contadas em um contador com cristal NaI (Tl) (ANSRAbott, Chicago, E.U.A.). Os valores foram expressos em cpm/g ou ml.

2.7 Determinao da permeabilidade intestinal

A permeabilidade intestinal foi avaliada pela determinao da radioatividade no sangue aps a administrao oral de
99m

Tc- DTPA. Quatro grupos de cinco animais,

por perodo de tempo, foram tratados como descrito acima. No dcimo dia aps o

51 tratamento, todos os camundongos receberam, por gavagem, 0,1 ml de soluo contendo 18,5 MBq de 99mTc-DTPA. Aps 90 min, foram submetidos ao procedimento cirrgico como descrito anteriormente. Quatro, oito e 18 horas aps a OI, os animais foram anestesiados novamente e 500 l de sangue foram coletados e colocados em tubos apropriados para a determinao da radioatividade (VIANA et al., 2009). Os dados foram expressos em dose%, utilizando a seguinte equao:

cpm (sangue) % dose = cpm (dose administrada) X 100

Onde cpm a contagem por minuto.

2.8 Anlise Histolgica

Dezoito horas aps o procedimento cirrgico, quatro animais de cada grupo descrito acima foram sacrificados. Trs anis do leo na rea adjacente interveno cirrgica foram obtidos, fixados em formol a 4% e processados para incluso em parafina. De cada amostra, pelo menos 3 sees histopatolgicas (4-5 m) foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E), codificadas e analisadas por microscopia ptica por um nico patologista, que desconhecia as condies experimentais de cada grupo. Escore intestinal com base em critrios descritos por CHIU et al. (1970) foi determinado para cada amostra. O sistema de classificao de CHIU composto por cinco subdivises de acordo com as mudanas de vilosidades e glndulas da mucosa intestinal da seguinte forma: grau 0: mucosa normal, grau 1: desenvolvimento do espao subepitelial de Gruenhagen na ponta da vilosidade; grau 2: extenso do espao com elevao epitelial moderada; grau 3: elevao epitelial macia com poucas vilosidades; grau 4: ulcerao de vilosidades com capilares expostos; e grau 5: desintegrao da lmina, e hemorragia. Cada seo foi marcada por animal e por grupo. O resultado foi expresso como a mdia da avaliao de quatro animais por grupo.

52 2.9 Determinao de IL-10 e INF-

Dezoito horas aps a cirurgia, 05 animais por grupo foram sacrificados. O sangue foi coletado do plexo axilar e centrifugado a 1.000 x g por 10 minutos para separao do soro, que foi estocado a -70C at o uso. Posteriormente, os nveis de IL10 e INF- foram avaliados pela tcnica de ELISA, utilizando kits comerciais especficos (Biosource International, Camarillo, CA, USA). Os resultados foram expressos em pg/ml.

2.10 Dosagem da sIgA

Decorridas 18 horas da cirurgia, 05 animais por grupo foram sacrificados. A determinao de sIgA no fluido intestinal foi feita pela tcnica de ELISA com descrita por RODRIGUES et al. (2000). Todos os anticorpos foram obtidos da Sigma (St. Louis, EUA). Os resultados obtidos foram expressos em g/mL.

2.11 Anlises Estatsticas

Os experimentos foram realizados em duplicata. Os dados da TB foram avaliados com o teste de Kruskall-Wallis, anlise de varincia e uma anlise post hoc pelo teste de Dunn. Permeabilidade intestinal, escore da histologia e resultados imunolgicos foram comparados por meio do teste T Student. As diferenas foram consideradas estatisticamente significativas para p < 0,05. Todas as anlises foram realizadas utilizando o programa BioEstat verso 3.0 (Sociedade Civil Mamirau / MCT - CNPq).

53

3 RESULTADOS
3.1 Ingesto alimentar e ganho de peso

A ingesto alimentar e o ganho de peso foram semelhantes entre os quatro grupos durante os dez dias de tratamento experimental.

3.2 Avaliao da translocao bacteriana

De acordo com os resultados mostrados na TAB.I.1, a OI provocou um aumento significativo na TB, como demonstrado pela captao de E. coli-99mTc no sangue, LMN, fgado, bao e pulmes dos animais do grupo OI quando comparado com os do grupo Sham (p < 0,05). A administrao do probitico S. boulardii reduziu a TB no sangue e todos os rgos investigados, quando comparado com o grupo OI (p < 0,05). Resultados semelhantes foram obtidos quando os animais foram tratados com clulas no viveis do probitico. Esses valores no diferiram estatisticamente aos obtidos no grupo Sham (p > 0,05)

TABELA I.1- Biodistribuio da 99mTc- E.coli rgo/Sangue Sham OI OI+Sb OI+Sb no vivel 190,21 a 213,00 a 691,38 a 251,00 a 171,25 a

LMN Bao Fgado Pulmo Sangue

85,22a 23,75 a 473,26 a 152,08 a 140,80 a

845,83 b 676,25 b 1794,14 b 629,58 b 465,81 b

160,41 a 193,33 a 649,69 a 252,09 a 184,33 a

a, b Letras diferentes na mesma linha indicam diferenas estatisticamente significativa (p < 0,05) pelo teste de Kruskall-Wallis, anlise de varincia e anlise post hoc pelo teste de Dunn. Dados expressos em mediana. N = 8.

54 3.3 Permeabilidade intestinal

A FIG.I.1 mostra aumento da permeabilidade intestinal no grupo OI quando comparado ao grupo Sham ao longo de todos os tempos investigados (p < 0,05). Prtratamento com S. boulardii reduziu a permeabilidade intestinal, mesmo quando as clulas no viveis foram utilizadas (p < 0,05) e os valores foram semelhantes ao observado no grupo Sham.

* *

FIGURA I.1 Permeabilidade intestinal. Grupos Sham (), OI (), OI+Sb () e OI+Sb no vivel ().Barras de erros mostram o desvio padro. *Indica diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Dados expressos em mdia. N = 5.

3.4 Avaliao da histologia intestinal

Os aspectos histolgicos so representados na FIG.I.2. As amostras obtidas a partir do grupo Sham no apresentaram alteraes histolgicas (pontuao 0,25 0,5) (FIG.I.2 A, B). Por outro lado, as pores do intestino delgado dos animais submetidos a OI mostraram eroso focal da superfcie do epitlio associada a edema intenso e

55 congesto vascular da parede intestinal, principalmente na lmina prpria (FIG.I.2 C, D). Perturbao da arquitetura da mucosa intestinal tambm foi observada, caracterizada por um aumento da celularidade e vilosidades ampliadas apresentando reduo de altura. Alm disso, foram observados presena de espao subepitelial de Gruenhagen no topo das vilosidades e elevao epitelial com vilosidades destrudas. O escore intestinal do grupo OI (4,0 0,0) foi estatisticamente maior do que observado no grupo Sham (0.25 0,5) (p<0,05). Em contrapartida, os animais que receberam o tratamento com S. boulardii apresentaram edema discreto e uma arquitetura estrutural preservada da mucosa intestinal (FIG.I.2 E, F). Aspectos semelhantes foram observados quando os animais foram tratados com clulas no viveis de S. boulardii. Neste caso, o aumento de celularidade da lmina prpria e reduo discreta da altura das vilosidades intestinais foram tambm observados, mas no houve presena de espao subepitelial de Gruenhagen na ponta da vilosidade ou elevao epitelial com vilosidades destrudas em qualquer uma das amostras avaliadas neste grupo (FIG.I.2 G, H). Para ambos os tratamentos com a levedura o escore intestinal foi significativamente menor (0,25 0,5) quando comparado ao grupo OI (p<0,05).

56

FIGURA I.2 Cortes histolgicos da mucosa do intestino delgado de animais. (A, B) grupo Sham: aspecto normal do epitlio ileal e da parede intestinal, correspondente ao escore <1. (C, D) grupo OI: observa-se alteraes epiteliais e vasculares importantes com dilatao do espao sub-epitelial na ponta da vilosidade por edema (seta), vilosidades rebaixadas, com capilares expostos, edema da submucosa (seta longa) o que corresponde a pontuao 4. (E, F) grupo OI+Sb e (G, H) grupo OI+Sb no vivel: significativa preservao do aspecto estrutural da mucosa do leo, correspondendo ambos a pontuao <1. H & E, aumento original para A, C, E, G: 10X, B, D, F, H: 20X. N = 5.

57 3.5 Anlise dos nveis sricos de IL-10 e INF-

Os nveis de IL-10 dos animais que receberam ambos os tratamentos com a levedura vivel e no vivel foram de 160,0 pg/ml e 159,9 pg/ml, respectivamente. Estes resultados estavam estatisticamente aumentados quando comparado com o grupo OI (50,75 pg/ ml) e o grupo Sham (29,58 pg/ ml) (p < 0,05) (FIG.I.3). A FIG.I.4 mostra que os nveis de INF- so similares entre o grupo OI (159 pg/ml) e os grupos tratados (160 pg/ml e 159,9 pg/ ml, respectivamente) (p > 0,05).

FIGURA I.3 Nveis de citocinas IL-10 no plasma dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sb e OI+Sb no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Dados expressos como mdia. N = 5.

58

FIGURA I.4 Nveis de citocinas INF- no plasma dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sb e OI+Sb no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Dados expressos como mdia. N = 5.

3.6 Anlise dos nveis intestinais de sIgA

A FIG.I.5 mostra que os nveis de sIgA foram similares no grupo OI quando comparado ao grupo Sham (742,0 mg/g e 736,0 mg/g, respectivamente) (p > 0,05). O tratamento com ambas as clulas viveis e no viveis do probitico aumentaram significativamente os nveis de sIgA (1390,0 mg/g e 1139,0 mg/g, respectivamente) quando comparado ao grupo OI (p < 0,05).

59

FIGURA I.5 Nveis de sIgA no fluido intestinal dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sb, e OI+Sb no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Os dados esto expressos como mdia. N = 5.

60

4 DISCUSSO
A funo da barreira intestinal descreve a habilidade do epitlio intestinal em separar o contedo luminal potencialmente prejudicial, por conter bactrias e endotoxinas, do ambiente interno do corpo. Por conseguinte, qualquer prejuzo ao intestino contribui para a translocao de bactrias e de endotoxinas para a circulao portal e sistmica (MACFIE et al., 2006; GATT et al., 2007). Devido ao potencial efeito benfico da microbiota intestinal na integridade da barreira e na funo imunolgica tornou-se crescente o interesse na utilizao de probiticos na medicina clnica para preveno e tratamento de diversas patologias (KELLY et al., 2007). H evidncias convincentes de que essa terapia direcionada ao intestino melhora os resultados clnicos de vrios pacientes em estado crtico (DEITCH, 2002; MCNAUGHT et al., 2005). Assim, a manuteno do equilbrio ecolgico estvel no trato gastrintestinal seria o maior mecanismo de defesa na preveno da TB (SALZEDAS-NETTO et al., 2006). O presente estudo utilizou tratamento oral com suspenso de clulas viveis e no viveis de S. boulardii para verificar seu potencial impacto na TB e na manuteno da integridade da barreira intestinal, alm do seu papel no sistema imunolgico em modelo de OI em camundongos. Para analisar a influncia de S. boulardii na TB utilizou-se a tcnica de marcao de E. coli com radioistopo 99m-tecncio. Poucos estudos tm sido realizados para avaliar essa influncia, e a maioria optam pelo mtodo por cultura microbiana (HEREK et al., 2004; GEYIK et al., 2006). Este mtodo apresenta algumas desvantagens uma vez que pode subestimar nveis de TB, pois no detecta fragmentos de bactrias e bactrias no-viveis que tambm podem provocar estmulo excessivo da resposta imunolgica, alm de ser uma tcnica laboriosa exigindo condies asspticas para sua aplicao (WIEST & RATH, 2003; WHITE et al., 2006). Por outro lado, o mtodo que emprega a
99m

Tc-E. coli, rpido, direto e simples para a determinao da TB. O

mesmo no requer condies asspticas e detecta a presena de fragmentos assim como clulas inteiras de bactria no-viveis e viveis em diversos compartimentos internos do organismo (WIEST & RATH, 2003; WHITE et al., 2006). Os resultados mostraram maior captao de
99m

Tc-E. coli no sangue, LMN,

fgado, bao e pulmes dos animais do grupo OI quando comparado aos do grupo Sham (p < 0,05) (TAB.I.1). Estes resultados esto de acordo com estudos anteriores em que a OI tambm promoveu aumento da TB (OLIVEIRA et al., 2006; QUIRINO et

61 al., 2007). Os possveis mecanismos responsveis por essa situao provavelmente esto relacionados com perturbao do equilbrio ecolgico da microbiota, dano da barreira intestinal por leso direta aos entercitos e/ou suas junes devido a fisiopatologia da OI (ALDEMIR et al., 2002; WHITE et al., 2006). Pr-tratamento com clulas viveis ou no viveis da levedura foi capaz de reduzir significativamente os nveis de TB (p < 0,05) (TAB.I.1). HEREK et al. (2004) e GEYIK et al. (2006) encontraram resultados semelhantes usando S. boulardii na preveno da TB, em modelos experimentais de queimaduras e ictercia obstrutiva, respectivamente. Segundo LICHTMAN (2001) e MACFIE et al. (2006), baixos nveis de TB considerado fenmeno fisiolgico necessrio para a maturao e manuteno de sistema imunolgico gastrointestinal competente. Os resultados obtidos no grupo Sham corroboram para a afirmao de translocao fisiolgica (TAB.I.1). Os provveis mecanismos de proteo do S. boulardii na reduo da TB podem estar relacionados sua ao na barreira intestinal e na resposta imunolgica. Sabe-se que o aumento da permeabilidade intestinal caracterizado pela passagem de molculas maiores que 150 Daltons do lmen para a corrente sangunea (ARRIETA et al., 2006). Neste estudo, a permeabilidade intestinal foi avaliada por meio da determinao da radioatividade no sangue aps a administrao oral de
99m

Tc-DTPA.

O DTPA um complexo trissdico com peso molecular de 549 Daltons. Este composto atxico, solvel em gua, no metabolizado no estmago e apresenta filtrao quantitativa pelos rins, alm de ser facilmente detectvel (ARRIETA et al., 2006). A OI induziu aumento da permeabilidade intestinal, como observado na FIG.I.1. Conforme mostrado na mesma figura, ambos os tratamentos reduziram a permeabilidade intestinal para nveis fisiolgicos, ou seja, com valores similares queles observados para o grupo Sham durante todo o experimento (p > 0,05). Diminuio na permeabilidade intestinal tambm foi observada em modelos in vitro, utilizando a levedura e cultura de clulas T84 infectadas com E. coli enteropatognica e Salmonella Typhimurium. Nestes estudos E. coli enteropatognica (DAHAN et al., 2003) e Salmonella Typhimurium (MARTINS et al., 2010) aumentaram a permeabilidade intestinal e estes autores observaram que S. boulardii foi capaz de impedir este aumento. Em estudo clnico recente, VILELA et al. (2008) observaram alteraes importantes da integridade da mucosa intestinal em pacientes com doena de Crohn em remisso. Esses mesmos pesquisadores mostraram que o tratamento oral com S. boulardii foi capaz de reduzir a permeabilidade intestinal.

62 Os mecanismos que poderiam explicar a manuteno da integridade epitelial pela levedura no so bem conhecidos. No entanto, a capacidade do S. boulardii de modular a transduo de vias envolvidas no controle da estrutura de juno celulares durante processos infecciosos poderia ser uma explicao (DAHAN et al., 2003). Alm disso, como demonstrado pelas anlises histopatolgicas (FIG.I.2), a obstruo intestinal est associada com vrias leses graves. Entretanto, animais tratados com S. boulardii apresentaram boa preservao do epitlio intestinal mesmo em situao extrema como a OI (FIG.I.2E e G). Este fato indica que a manuteno da barreira intestinal com o uso de probitico pode justificar a diminuio significativa dos nveis de TB. Resultados semelhantes foram relatados por ALDEMIR et al. (2002) e GEYIK et al. (2006) que observaram maior altura das vilosidades em camundongos tratados com S. boulardii e submetidos obstruo da ala intestinal, quando comparado ao grupo controle. Os probiticos podem interferir tambm, no sistema imunolgico atuando de forma sinrgica com a barreira intestinal. Sabe-se que um desequilbrio nas respostas TH1/TH2, com predomnio da resposta TH1 leva a estimulao excessiva na produo de citocinas pr-inflamatrias, como INF-, ativando sinal de transduo que afrouxa as junes do tipo tight alterando a funo de barreira. Esse evento conduz a aumento na passagem do contedo luminal promovendo maior ativao do sistema

imunolgico. Na ausncia de imunorregulao adequada, esta ativao pode causar aumento ainda maior da produo de citocinas pr-inflamatrias e perda de barreira, resultando em um ciclo de auto-amplificao, que pode resultar em sepse (MARCHIANDO et al., 2010). No presente estudo os nveis da citocina pr-inflamatria INF- foram estatisticamente semelhantes (p>0,05) nos grupos tratados tanto com clulas viveis como no viveis da levedura quando comparado ao grupo OI (FIG.I.3). Em contrapartida, o pr- tratamento com ambas as leveduras elevaram os nveis da citocina IL-10 quando comparado com o grupo OI (p<0,05) (FIG.I.4). A IL-10 uma citocina do tipo TH2 produzida principalmente por moncitos e, em menor quantidade pelos linfcitos, apresentando efeitos sobre imunorregulao, levando a diminuio da inflamao. A influncia do S. boulardii na secreo de citocinas em linfcitos intra-epiteliais infectados com E. coli e Candida albicans foi investigado in vitro por FIDAN et al. (2009). Estes autores observaram que a secreo de citocinas anti-inflamatrias como IL-4 e IL-10 foi aumentada em linfcitos infectados, mas incubados com S. boulardii. IMAOKA et al., (2008) em estudo in vitro utilizando modelo de colite, observaram aumento na produo de IL-10 quando houve tratamento

63 com probitico. Portanto, esses dados esto de acordo com os resultados obtidos para IL-10, indicando que S. boulardii pode atuar modulando a resposta imunolgica, contribuindo desta forma para a reduo dos nveis de translocao bacteriana. Outro importante mecanismo de ao do probitico o aumento da produo de sIgA. Sabe-se que a sIgA tem propriedade de impedir a adeso das bactrias presentes no lmen mucosa intestinal, sendo este um passo inicial necessrio para a posterior translocao (RODRIGUES et al.; 2000). As baixas concentraes de sIgA intestinal esto associadas com aumento da aderncia bacteriana na mucosa e da TB (RODRIGUES et al., 2000; MARTINS et al., 2005; DALMASSO et al., 2006a). Assim, os nveis aumentados de sIgA nos animais que receberam os dois tipos de tratamento, leveduras viveis e no viveis, poderiam tambm ter contribudo para a reduo da translocao bacteriana para estes grupos (FIG.I.5). Todos os probiticos, sejam bactrias ou leveduras, apresentam mais de um mecanismo para explicar o seu efeito protetor. Combinaes de produo de compostos antagnicos, competio por nutrientes ou stios de adeso,

imunomodulao do hospedeiro e fixao de toxinas de bactrias patognicas ou das prprias bactrias so os mecanismos mais freqentemente citados (CORREIA & NICOLI, 2006). Alguns destes mecanismos dependem da viabilidade dos probiticos como, produtos antagonistas ou anti-inflamatrios provenientes do metabolismo. Outros, tais como imunomoduladores ou molculas receptoras da estrutura celular, por sua vez, no dependem da viabilidade dos probiticos (KATARIA et al., 2009). Os resultados obtidos mostraram que tanto as clulas viveis como no-viveis do S. boulardii apresentaram efeito protetor na TB, levando a hiptese de que os mecanismos que medeiam tal efeito estariam relacionados com componentes estruturais, provavelmente da parede celular da levedura. De acordo com ADAMS (2010) os mesmos efeitos utilizando clulas viveis dos probiticos tambm so observados no tratamento com clulas no viveis. MAEDA et al. (2009) observaram aumento da capacidade fagoctica de macrfagos quando tratados com clulas no viveis de probiticos. LI et al. (2009) tambm observaram que tanto clulas viveis como no viveis de probitico tiveram efeitos similares na induo da produo de fatores anti-inflamatrios. Os dados obtidos neste trabalho mostraram que o tratamento prvio com clulas viveis e no viveis de S. boulardii foi capaz de reduzir a translocao bacteriana para nveis fisiolgicos, provavelmente devido a combinao de fatores tais como manuteno da integridade da barreira intestinal, modulao da resposta imunolgica

64 com aumento expressivo dos nveis de sIgA. Os dados obtidos sugerem que esses efeitos benficos foram oriundos de mecanismos que envolvem mais a estrutura da clula do que seu metabolismo.

65

CAPTULO II Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 protege contra a translocao bacteriana, preserva a integridade da barreira intestinal e estimula o sistema imunolgico em modelo de obstruo intestinal em camundongos
RESUMO
Probiticos so definidos como preparao contendo microrganismos vivos que conferem efeitos benficos para o hospedeiro quando administrados em quantidades adequadas. O presente trabalho avaliou se o tratamento oral com clulas viveis ou no viveis da levedura S. cerevisiae (UFMG 905) capaz de impedir a translocao bacteriana (TB), preservar a integridade da barreira intestinal e estimular a imunidade sistmica e local, em modelo murino de obstruo intestinal (OI). Quatro grupos foram utilizados: Grupo I Controle (Sham); Grupo II OI; Grupo III OI+Sc; Grupo V OI+Sc no vivel. A TB que foi determinada por meio da captao de
99m

Tc-E. coli no

sangue, LMN, fgado, bao e pulmes foi significativamente maior no grupo OI em relao ao grupo Sham. Ambos tratamentos com as leveduras reduziram a TB no sangue e em todos os rgos investigados, alm de reduzirem a permeabilidade intestinal, conforme determinado pela captao do
99m

Tc-DTPA no sangue. Dados

imunolgicos demonstraram que ambos os tratamentos foram capazes de aumentar significativamente os nveis sricos de IL-10, mas apenas as clulas viveis da levedura tiveram o mesmo efeito sobre os nveis intestinais de sIgA. Leses histopatolgicas no intestino foram mais graves no grupo de OI quando comparados aos grupos Sham e tratados. Concluindo, tanto as clulas viveis como no viveis da levedura foram capazes de impedir a TB, provavelmente por imunomodulao e pela manuteno da integridade da barreira intestinal. Apenas a estimulao da produo de sIgA parece depender da viabilidade levedura.

PALAVRAS-CHAVES: translocao bacteriana, permeabilidade intestinal, IL-10, sIgA, histologia, S. cerevisiae (UFMG 905).

66

1 INTRODUO
Probiticos so definidos como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem efeitos benficos para a sade do hospedeiro (FAO/ WHO, 2002). Embora essa definio enfatize a necessidade da viabilidade das clulas dos probiticos, alguns autores tm demonstrado que mesmo mortos pelo calor ou por raios ultravioletas esses microrganismos mantm seus efeitos benficos, uma vez que seus componentes, como a parede celular, atuam de forma eficaz (KATARIA et al., 2009). Lactobacilos e bifidobactrias so bactrias probiticas freqentemente

encontradas em produtos para humanos (TANNOCK, 2005), assim como a levedura Saccharomyces boulardii (CZERUCKA & RAMPAL, 2002). Esta levedura no patognica foi isolada do fruto da lichia na Indochina e tem sido utilizada como uma opo ao tratamento para diferentes tipos de diarria, como diarria associada a antibiticos, pelo Clostridium difficile e tambm nas doenas intestinais (CZERUCKA & RAMPAL, 2002; SURAWICZ, 2003). Poucas leveduras tm sido estudadas como possveis probiticos e agentes bioteraputicos, sendo a S. boulardii uma das primeiras e praticamente a nica comercializada e utilizada em medicina. Ela geneticamente semelhante a Saccharomyces cerevisiae, mas muito diferente metabolicamente (FIETTO et al. 2004). Isso leva questo de saber se outras leveduras tambm possuiriam propriedades bioteraputicas similares, ou melhores, que a S. boulardii (MARTINS et al., 2005b). Neste contexto, professores do Departamento de Microbiologia/ICB/UFMG propuseram a estudar espcies de leveduras ambientais e agroindustriais, isoladas no Brasil, como possveis agentes teraputicos. Neste sentido, a S. cerevisiae, linhagem UFMG 905, isolada da cana-de-acar foi a nica capaz de colonizar ou sobreviver com mais eficincia, no trato gastrointestinal de camundongos germ-free ou convencional. Alm disso, mostrou capacidade para proteger os animais contra infeco por Salmonella enterica sorovar Typhimurium e C. difficile (MARTINS et al., 2005b). Resultados adicionais mostraram que a S. cerevisiae UFMG 905 foi capaz, tambm, de reduzir a translocao bacteriana (TB) de S. Typhimurium e de estimular o sistema imunolgico em camundongos (MARTINS et al., 2007). O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de clulas viveis e no viveis da levedura S.cerevisae UFMG 905 no processo de translocao bacteriana, com nfase

67 na barreira intestinal e na modulao da resposta imunolgica local e sistmica em modelo experimental de obstruo intestinal.

2 METDOS
2.1 Microrganismos

Clulas viveis de Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 foram utilizadas e isoladas em gar Sabouraud dextrose (Difco, Sparks, E.U.A.). Para a utilizao das clulas da levedura no viveis, uma suspenso de S. cerevisiae UFMG 905 foi autoclavada a 121 C por 15 minutos. Em seguida, uma alquota foi repicada em gar Sabouraud para a confirmao da no viabilidade da levedura. Escherichia coli ATCC 10536 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Rockville, E.U.A.).

2.2 Camundongos

Neste trabalho foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 25 e 35 g. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, recebendo gua e rao ad libitum. Este estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Experimentao Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA / UFMG).

2.3 Delineamento experimental

Para cada experimento (determinao da TB, permeabilidade e histologia intestinal e anlises imunolgicas) os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: I. Grupo Sham (gavagem com 0,1 ml de soluo salina; simulao da operao); II. Grupo OI (gavagem com 0,1 ml de soluo salina; laparotomia e ligadura do leo); III. Grupo OI+Sc (gavagem com 0,1 ml de suspenso contendo 109 UFC / ml de S. cerevisiae UFMG 905; laparotomia e ligadura do leo); IV. Grupo OI+Sc no vivel (gavagem com 0,1 ml de suspenso contendo 109 clulas no viveis de S. cerevisiae UFMG 905, laparotomia e ligadura do leo). Durante dez dias, todos os animais receberam gua e rao ad libitum. Os respectivos tratamentos foram

68 realizados, diariamente, por gavagem. Os camundongos foram, durante o perodo dos experimentos, monitorados com relao ingesto alimentar e ganho de peso corporal.

2.4 Procedimento cirrgico

No dcimo primeiro dia, aps o tratamento descrito acima, os animais foram anestesiados, intraperitonealmente, com soluo de cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6dihidro-4H-1,3-tiazina (Dopazen) e cloridrato de ketamina (Dopalen) nas

concentraes de 8 mg/Kg e 60 mg/kg, respectivamente. Realizou-se laparotomia mediana de aproximADAMSente 3 cm, com exposio do ceco e leo terminal. Em seguida, o leo terminal sofreu ligadura com n simples utilizando-se fio de nylon 5.0 (BRASTURE, SP, Brasil). A sutura foi realizada com fio cuticular 5.0. Todos os grupos passaram pelo mesmo processo, exceto o grupo Sham que sofreu apenas laparotomia mediana com posterior sutura do abdmen, simulando o estresse cirrgico (OLIVEIRA et al., 2006; QUIRINO et al., 2007).

2.5 Procedimento de marcao da E. coli

Este procedimento foi realizado conforme descrito por Diniz et al. (1999). De uma cultura-me de E. coli foi feito o repique em gar tripticasena (Merck). Aps 18 horas de crescimento a 37oC a bactria foi transferida para soluo salina estril e sua concentrao ajustada espectrofotometricamente em 31% de transmitncia a 580nm, correspondente a 108 UFC/ml. Posteriormente, uma alquota dessa suspenso bacteriana (2 ml) foi incubada em tubos contendo 1 ml de soluo de cloreto estanoso (580 mM, pH 7,0) a 37 C por 10 min. Aps a incubao, 37,0-55,5 MBq de
99m

Tecncio (99mTc), obtido por eluio do gerador

99

Mo/99mTc estril (IPEN / Brasil) foi

adicionado e a preparao foi mantida em 37 C por 10 min. Os tubos foram ento centrifugados a 3.000 x g por 25 min. Este procedimento foi repetido trs vezes. Aps a ltima centrifugao, a radioatividade do sobrenadante e precipitado foi medida em calibrador de dose (CRC-25R Dose Calibrator, Capintec, Ramsey, E.U.A.) e o percentual de
99m

Tc incorporado nas clulas bacterianas foi determinado utilizando a

seguinte equao:

69
cpm (precipitado) % marcao =
Onde cpm a contagem por minuto.

X 100

cpm (precipitado + sobrenadante)

2.6 Determinao da translocao bacteriana

Quatro grupos de oito animais cada foram tratados conforme descrito acima (item 2.3). Aps dez dias de tratamento, 0,1 ml de suspenso contendo 1,8 MBq de
99m

Tc-E.coli foi administrada por gavagem a todos os animais. Aps 90 minutos, os

camundongos foram submetidos ao procedimento cirrgico supracitado. Dezoito horas aps a operao, os animais foram novamente anestesiados, utilizando-se a mesma tcnica. O sangue, linfonodos mesentricos (LMN), fgado, bao e pulmes foram removidos, pesados e colocados em tubos apropriados para a determinao da radioatividade (OLIVEIRA et al., 2006; QUIRINO et al., 2007). As amostras foram contadas em um contador com cristal NaI (Tl) (ANSR-Abott, Chicago, E.U.A). Os valores foram expressos em cpm/g ou ml.

2.7 Determinao da permeabilidade intestinal

Quatro grupos de cinco animais, por perodo de tempo, foram tratados como descrito acima (item 2.3). A permeabilidade intestinal foi avaliada no 10 o dia aps administrao, por via oral, de 18,5 MBq de administrao do
99m 99m

Tc-DTPA. Transcorridos 90 min da

Tc-DTPA, os camundongos foram submetidos ao procedimento

cirrgico como descrito anteriormente. Quatro, oito e 18 horas aps a OI, os animais foram anestesiados novamente e 500 l de sangue foi coletado e colocado em tubos apropriados para a determinao da radioatividade (VIANA et al., 2009). Os dados foram expressos em percentual de dose (% dose)utilizando a seguinte equao:
cpm (sangue) % dose = cpm (dose administrada) X 100

Onde cpm a contagem por minuto.

70 2.8 Determinao de IL-10 e INF-

Dezoito horas aps a cirurgia, 05 animais por grupo foram sacrificados. O sangue foi coletado do plexo axilar e centrifugado a 1.000 x g por 10 minutos para separao do soro, que foi estocado a -70C at o uso. Posteriormente, os nveis de IL10 e INF- foram avaliados no soro pela tcnica de ELISA, utilizando kits comerciais especficos (Biosource International, Camarillo, CA, USA). Os resultados foram expressos em pg/mL.

2.9 Dosagem da sIgA

Decorridas 18 horas da cirurgia, 05 animais por grupo foram sacrificados. A determinao de sIgA no fluido intestinal foi feita pela tcnica de ELISA com descrita por RODRIGUES et al. (2000). Todos os anticorpos foram obtidos da Sigma (St. Louis, EUA). Os resultados obtidos foram expressos em mg/mL.

2.10 Anlise Histolgica

As amostras de intestino delgado de cinco animais por grupo conforme citado acima foram retiradas para anlise histolgica 18 h aps a operao de OI. Um anel de 1 cm do leo distal, adjacente OI foi ressecado, fixado em 4% formol, desidratados, limpos, embebidos em parafina, cortado em seces de 4-5 mm de espessura, corados pela hematoxilina e eosina (H & E), e codificados e analisados por microscopia ptica por um nico patologista que desconhecia as condies experimentais para cada grupo.

2.11 Anlises Estatsticas

Os experimentos foram realizados em duplicata. Os dados da TB foram avaliados com o teste de Kruskall-Wallis, anlise de varincia e uma anlise post hoc pelo teste de Dunn. Permeabilidade intestinal e resultados imunolgicos foram comparados por meio do teste T Student. As diferenas foram consideradas

71 estatisticamente significativas para p < 0,05. Todas as anlises foram realizadas utilizando o programa BioEstat verso 3.0 (Sociedade Civil Mamirau / MCT - CNPq).

3 RESULTADOS
3.1 Avaliao da ingesto e ganho de peso

No houve diferena estatstica (p > 0,05) entre os quatro grupos em termos de ingesto alimentar e ganho de peso corporal (dados no mostrados).

3.2 Efeito do probitico no processo de translocao bacteriana

99m

Os dados apresentados na TAB.II.1 mostram maior captao de

Tc-E.coli em

todos os rgos investigados e sangue dos animais do grupo OI, quando comparados com os animais do grupo Sham (p < 0,05). Os resultados tambm mostraram que os animais tratados com clulas viveis ou no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 apresentaram reduo significativa na contagem de
99m

Tc-E.coli no sangue e nos

rgos investigados, quando comparado ao grupo OI (p < 0,05). No houve diferena estatstica entre o grupo Sham, grupo OI+Sc e OI+Sc no vivel (p> 0,05).

TABELA II.1-

Biodistribuio da 99mTc-E.coli Sham OI 845.83 b 676.25 b 1794.14 b 629.58 b 465.81 b OI + Sc 88.44 a 151.13 a 856.23 a 122.75 a 279.11 a OI+ Sc no vivel 98.70 a 220.00 a 959.44 a 112.32 a 273.53 a

LMN Bao Fgado Pulmo Sangue

85.22a 23.75 a 473.26 a 152.08 a 140.80 a

72
a, b Letras diferentes na mesma linha indicam diferenas estatisticamente significativa (p < 0,05) pelo teste de Kruskall-Wallis, anlise de varincia e anlise post hoc pelo teste de Dunn. Dados expressos como mediana. N = 8.

3.3 Avaliao da permeabilidade intestinal

A FIG.II.1 mostra que a permeabilidade intestinal no grupo de OI foi significativamente maior do que a observada no grupo Sham durante todos os tempos investigados (p < 0,05). O pr-tratamento com clulas viveis ou no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 protegeu contra o aumento da permeabilidade intestinal, e os valores obtidos foram similares aos observados no grupo Sham (p > 0,05).

FIGURA II.1 Permeabilidade intestinal Grupos Sham (), OI (), OI+Sc () e OI+Sc no vivel (x). Barras de erros mostram o desvio padro. *Indica diferena estatisticamente significativa. Teste T (p <0,05). Dados expressos como mdia. N = 5

73 3.4 Nveis sricos de IL-10 e INF- A FIG.II.2 mostra que os nveis de IL-10 foram estatisticamente maiores nos animais do grupo OI (50,75 pg/ml), quando comparado ao grupo Sham (29,58 pg/ml) (p < 0,05). Ambos os tratamentos aumentaram significativamente os nveis de IL-10, apresentando valores de 102 e 104 pg/ml para os grupos OI+Sc e OI+ Sc no vivel, respectivamente. Esses valores foram estatisticamente maiores do que queles observados para os grupos Sham e OI (p < 0,05). Pela FIG.II.3 observam-se nveis significativamente mais elevados de IFN- no grupo OI (159 pg/ml), quando comparado ao grupo Sham (65 pg/ml) (p < 0,05). Tratamento com clulas viveis (175 pg/ml) ou no viveis (169 pg/ml) de S. cerevisiae UFMG 905 no alterou os nveis de IFN- em relao aos animais do grupo OI (p > 0,05).

FIGURA II.2 Nveis de citocinas IL-10 no plasma dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sc e OI+ Sc no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Dados expressos como mdia. N = 5.

74

FIGURA II.3 Nveis de citocinas INF- no plasma dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sc e OI+ Sc no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p <0,05). Dados expressos como mdia. N = 5.

3.5 Nveis intestinais de sIgA

Observa-se pela FIG.II.4 que os nveis de sIgA foram estatisticamente iguais para os grupos Sham (736 mg/g), OI (742 mg/g) e OI+Sc no vivel (973 mg/g) (p > 0,05). O tratamento com clulas viveis da levedura aumentaram significativamente os nveis de sIgA (1248,0 mg/g), quando comparado aos demais grupos (p < 0,05).

75

FIGURA II.4 Nveis de sIgA no fluido intestinal dos animais. Grupos Sham, OI, OI+Sc e OI+Sc no vivel. Barras de erros mostram o desvio padro. Letras diferentes indicam diferena estatisticamente significativa. Teste T (p < 0,05). Dados expressos como mdia. N=5.

3.6 Anlise histolgica

A FIG.II.5 mostra que as leses histopatolgicas da mucosa do intestino delgado dos camundongos foram mais graves no grupo OI (FIG.II.5A-B) quando comparado ao grupo Sham (FIG.II.5C-D). Estas leses foram caracterizadas por reas de encurtamento intenso das vilosidades, alargamento e edema da lmina prpria. Por outro lado, a mucosa dos animais tratados com ambas as clulas viveis (FIG.II.5E-F) ou no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 (FIG.II.5G-H) mostrou aspecto similar ao padro normal, inclusive com presena de clulas caliciformes, exceto para o edema focal na mucosa e submucosa da lmina prpria.

76

FIGURA II.5 Cortes histolgicos da mucosa do intestino delgado de animais. Grupos OI (A, B), Sham (C, D), OI + Sc (E, F), e OI+Sc no vivel (G, H). Anis do intestino representam a parede do leo de diferentes grupos, com reas de eroso superficial e encurtamento das vilosidades (setas longas, A, B). Necrose da camada muscular e submucosa (seta fina, B). Recuperao parcial do aspecto viloso (setas, E, F), presena de clulas caliciformes (seta larga, H), exceto para o edema focal na sub-mucosa da lmina prpria (seta longa, G). H &E; Em (A, C, E, G) Barra representa 10. No grupo B, D, F, H, barra representa 5.

77

4 DISCUSSO

Poucas cepas de leveduras tm sido estudadas como possveis agentes bioteraputicos. S. boulardii uma das primeiras e, atualmente, a nica levedura comercializada em medicina humana. No entanto, outras Saccharomyces ssp. ou membros de outros gneros de leveduras, como Kluyveromyces ssp. (KUMURA et al., 2004) e Pichia spp. (TIAGO et al., 2009), provavelmente podem possuir atividade probitica semelhante, ou melhor, do S. boulardii. Neste contexto, o Departamento de Microbiologia/ICB/UFMG isolaram da cachaa a levedura S. cerevisiae, linhagem UFMG 905. Aps estudos in vitro e in vivo observaram que a mesma apresentou diversas caractersticas de um probitico (MARTINS et al., 2005b; MARTINS et al., 2007). Assim, o presente trabalho avaliou o tratamento oral com suspenso de clulas viveis ou no viveis de S. cerevisiae UFMG 905, no processo de translocao bacteriana com nfase na barreira intestinal e na resposta imunolgica local e sistmica. A TB foi avaliada por meio da captao de
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Tc-E. coli em diversos rgos e

sangue. Trata-se de mtodo rpido, direto e simples, capaz de detectar bactrias vivas, mortas e seus fragmentos, alm de no requerer condies asspticas. J os mtodos de cultura microbiana so muito trabalhosos e requerem ambientes asspticos e, ainda, detectam somente bactrias vivas (LITCHMAN, 2001; GATT et al., 2007). Segundo GATT et al. (2007) tanto bactrias vivas como seus fragmentos e subprodutos, presentes na corrente sangunea podem desencadear estmulos a resposta inflamatria. Em circunstncias normais, a mucosa intestinal a maior barreira para impedir que as bactrias invadam os tecidos e rgos sistmicos. Entende-se por translocao bacteriana a passagem de bactrias viveis endgenas e seus produtos atravs da mucosa intestinal intacta para os linfonodos mesentricos, cavidade peritoneal, bao, fgado e corrente sangunea (ALDEMIR et al., 2002). A maioria dos microrganismos que translocam so posteriormente sujeitos a fagocitose por macrfagos, mas alguns ainda so encontrados livres na corrente sangnea e vasos linfticos (LITCHMAN, 2001; WIEST & RATH 2003, GATT et al., 2007). Os resultados do presente trabalho mostraram que o modelo de obstruo intestinal promoveu aumento significativo da TB para o sangue e todos os rgos

78 investigados nos animais do grupo OI, quando comparados aos camundongos do grupo Sham (TAB.II.1). Na obstruo intestinal h interrupo total ou parcial do fluxo intestinal levando ao acmulo de gases, secrees e diminuio do peristaltismo. Estas alteraes promovem proliferao bacteriana e alterao da permeabilidade intestinal, eventos descritos como desencadeadores da TB (CHANG et al., 2001; AKIN et al., 2002). Por outro lado, os animais tratados previamente com clulas viveis ou no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 mostraram diminuio significativa da captao da
99m

Tc-E.coli para sangue e todos os rgos em relao ao grupo OI. Estes resultados

esto em conformidade com os observados com estudos com a levedura S. boulardii (HEREK et al., 2004). MARTINS et al. (2007) tambm observaram uma reduo dos nveis de TB para Salmonella Typhimurium em camundongos tratados com S. cerevisiae UFMG 905, mas em modelo experimental de infeco com este agente patognico. Alm disso, a TB nos animais tratados com as leveduras diminuiu para nveis semelhantes ao grupo Sham. Os baixos nveis de
99m

Tc-E. coli no sangue e rgos de

camundongos controle indicam uma TB basal, sem qualquer disfuno aparente. De acordo com dados da literatura, baixos nveis de TB caracteriza-se como processo fisiolgico essencial para modular o sistema imunolgico de forma local e sistmica, levando a induo de tolerncia aos antgenos em contato com a mucosa epitelial (LICHTMAN, 2001; DEITCH, 2002). Os mecanismos envolvidos na reduo da TB por probiticos ainda no esto totalmente elucidados, vrias hipteses tm sido sugeridas. No caso da levedura, ela pode competir com as bactrias para o receptor especfico sobre o epitlio intestinal e/ou aumentar a produo de sIgA, uma vez que ambos os mecanismos podem interferir na aderncia da bactria, passo inicial necessrio para a sua posterior translocao. Alm disso, bactrias que produzem fimbria tipo I, E. coli e Salmonella, so capazes de se ligar a resduos de manose presentes na parede celular de levedura (GEDEK, 1999). Assim, a ligao de E. coli na S. cerevisiae UFMG 905 no intestino dos camundongos pode inibir a adeso dessa bactria no epitlio intestinal e translocao. Outro mecanismo possvel que a levedura poderia preservar a integridade da mucosa intestinal e permeabilidade, que so afetadas durante os episdios infecciosos e patolgicos, alm de interferir no sistema imunolgico. No presente estudo, a permeabilidade intestinal foi avaliada utilizando a permeao do
99m

Tc-DTPA do intestino para o sangue. A anlise da alterao na

permeabilidade intestinal pode ser feita por meio de testes especificamente designados

79 para avaliar a funo da barreira intestinal, como passagem paracelular de molculas grandes (> 150 Daltons) ex. acares e frmacos, do intestino para o plasma e, conseqentemente, para a urina (LICHITMAN, 2001; KATOUZIAN et al., 2005). Os padres de alterao da permeabilidade intestinal podem apresentar-se como processo temporrio e reversvel dentro de algumas horas, como por exemplo, em situaes de estresse. Ou, por outro lado, processo de longo prazo que pode ser irreversvel ou reversvel, como em casos de inflamao, efeito de toxinas, desnutrio, citocinas prinflamatrias e hormnios (SUN et al., 2000). O
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Tc-DTPA-CaNa3 um complexo
99m

trissdico com peso molecular de 549 Daltons que satisfaz os critrios descritos acima, alm de ser facilmente detectvel. Segundo JORGENSEN et al. (2006) Tc-DTPA-

CaNa3 um mtodo vlido para avaliar as alteraes da permeabilidade intestinal. O pr-tratamento com clulas viveis e no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 impediu o aumento da permeabilidade intestinal, e os valores obtidos foram similares aos observados no grupo Sham, durante todo o perodo experimental (FIG.II.1). Estes resultados mostraram que independentemente da viabilidade das clulas, a levedura foi capaz de manter a integridade do epitlio intestinal sendo este um possvel mecanismo de proteo contra a TB. Estes dados esto de acordo com os encontrados por MIYAUCHI et al. (2009). Estes pesquisadores mostraram que tanto probiticos viveis ou no viveis foram capazes de proteger contra o aumento da permeabilidade da mucosa, em modelo de colite induzida. Este evento pode ser parcialmente explicado pelo aumento da expresso de znula ocludncia-1 e quinase de cadeias leves de miosina em clulas epiteliais intestinais tratadas com probiticos. Essas estruturas atuam aumentando a fora do citoesqueleto, diminuindo assim a permeabilidade intestinal. Reforando estes dados, a anlise histolgica (FIG. II.5A, B) mostrou que a OI foi associada com leses intensas da mucosa do intestino delgado, resultando em dano celular e arquitetnico que provavelmente promoveu TB. OI representa modelo de curto espao de tempo por leso sub-isqumica do leo. Amostras dos anis da parede do leo afetado pela OI mostraram leso da mucosa caracterizada por edema, dano epitelial, eroso superficial e alteraes de arquitetura representada pelo encurtamento e alargamento das vilosidades. Tratamento prvio com clulas viveis e no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 foi capaz de preservar o epitlio intestinal (FIG.II.5E-H). Resultados semelhantes foram relatados por ALDEMIR et al. (2002) e GEYIK et al. (2006) que observaram maior altura das vilosidades em ratos tratados com S. boulardii e submetidos obstruo da ala intestinal, quando comparados ao grupo

80 controle. A proteo claramente demonstrada na vista panormica das amostras representativas de OI+Sc e OI+Sc no vivel (FIG.II.5 E-H), que mostrou aspecto preservado das vilosidades, apesar da persistncia de edema e congesto vascular na lmina prpria. Pode-se especular que nestas condies tanto o epitlio quanto a lmina prpria das vilosidades do leo foram capazes de resistir leso sub-isqumica, como ficou demonstrado pelo aspecto mais preservado de vilosidades. No presente trabalho, clulas viveis e no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 tiveram efeitos benficos sobre a integridade da barreira intestinal, estes dados esto de acordo com aqueles observados por LI et al. (2009), mas com bactrias probiticas. Alm da importante funo de barreira, sabe-se que o trato gastrointestinal possui densa populao de clulas imunolgicas e que os probiticos poderiam atuar na imunomodulao regulando a quantidade e tipo de citocina a ser produzida por essas clulas (HILL & ARTIS, 2010; FINK, 2010). Os nveis e o tipo de citocinas circulantes so preditores de injria ou infeco. Os efeitos dos linfcitos TH1 e TH2 so contra-regulatrios. As citocinas TH1, tais como o INF- e TNF-, aumentam a imunidade mediada por clulas, o que resulta em ativao, crescimento e diferenciao de linfcitos T e B, bem como macrfagos, aumentando a capacidade fagocitria dos mesmos, porm em excesso responsvel por danos a barreira intestinal e aumento da permeabilidade (HILL & ARTIS, 2010; FINK, 2010). Em concordncia, no presente estudo foi observado aumento da produo da citocina INF- em todos os grupos submetidos a OI quando comparado com o grupo Sham (FIG.II.3). J a produo da citocina IL-10 foi estatisticamente maior nos grupos tratados com a levedura vivel ou no vivel, quando comparado ao grupo OI. (FIG.II.2). Esta citocina exerce regulao negativa na expresso de citocinas TH1 e antgenos MHC classe II. Tambm aumenta a sobrevivncia das clulas B e a proliferao e produo de anticorpos. Estudos em camundongos Knock-out sugeriram que a funo da IL-10 como imunorreguladora essencial no trato intestinal (GRIMBALDESTON et al., 2007). Este efeito estimulador da IL-10 por leveduras confirma os resultados similares obtidos por MARTINS et al. (2010) com S. boulardii. Estes resultados tambm so semelhantes aos encontrados por IMAOKA et al. (2008) e LI et al. (2009) que observaram aumento da produo de IL-10 aps os tratamentos com probiticos viveis ou no viveis, mostrando dessa forma o papel viabilidade. Outro mecanismo importante na proteo da TB seria o fato da levedura induzir a um aumento na produo de sIgA. Esta uma imunoglobulina presente na primeira imunorregulador da levedura e, que este no depende da sua

81 linha de defesa imunolgica do intestino, atuando como uma barreira contra a adeso de patgenos mucosa intestinal (HAJISHENGALLIS et al., 1992). No presente estudo, pode-se observar aumento da produo de sIgA intestinal aps o tratamento com clulas viveis de S. cerevisiae UFMG 905 , mas este efeito no ocorreu quando os animais foram tratados com clulas no viveis da levedura (FIG.II.4). Sabe-se que o aumento da produo de sIgA est relacionado estmulos dados por componentes da parede celular, mecanismo independente da viabilidade das clulas (RODRIGUES et al., 2000; SAWAI et al., 2001). Entretanto, os nveis intestinais de sIgA obtidos utilizando clulas no viveis S. cerevisiae UFMG 905 no mostraram aumento significativo, sugerindo que o estmulo produo desta imunoglobulina seria mediado pelo metabolismo da levedura. Esta hiptese pode ser respaldada por BUTS & DE KEYSER (2006). Estes autores observaram que a estimulao da produo de sIgA poderia ser alternativamente associada substncias secretadas pelas leveduras, como as poliaminas, que so potentes mediadores de resposta trfica intestinal. Concluindo, os resultados do presente estudo demonstraram que clulas viveis, bem como no viveis de S. cerevisiae UFMG 905 foram capazes de reduzir a TB e leses histolgicas, provavelmente por imunomodulao sistmica e pela manuteno da integridade da barreira intestinal. Apenas a estimulao da produo de sIgA parece depender da viabilidade da levedura.

82

3 CONCLUSES INTEGRADAS

- O tratamento oral prvio com clulas viveis e no viveis de ambas as leveduras foi capaz de exercer efeito protetor na barreira intestinal, reduzindo os danos provocados na mucosa, diminuindo os nveis de translocao bacteriana.

- As clulas viveis e no viveis de S.boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 exerceram efeitos imunomoduladores na resposta sistmica, mantendo os nveis da citocina pr-inflamatria INF- e aumentando os nveis da citocina anti-inflamatria IL10.

- O estmulo para a produo da imunoglobulina sIgA depende da viabilidade celular para a levedura S. cerevisiae UFMG 905. O mesmo no foi verificado para S.boulardii.

- Os resultados obtidos mostraram que a diminuio da permeabilidade e a manuteno arquitetura intestinal alm da, imunomodulao sistmica e reduo dos nveis de translocao bacteriana independem da viabilidade celular, para ambas as leveduras.

83

4 PERSPECTIVAS
- Avaliar os nveis das citocinas pr e anti- inflamatrias na mucosa intestinal na regio da obstruo intestinal;

- Investigar os mecanismos pelos quais os probiticos exercem ao na reduo da permeabilidade intestinal;

- Investigar a razo pela qual as clulas no viveis do S. cerevisiae UFMG 905 no estimularam a produo de sIgA.

- Realizar ensaios clnicos utilizando ambas as leveduras.

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