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TEMA 13.- TOXICIDAD DE ORGANOCLORADOS: Disponibilidad de ATP y metabolismo. Accin de los plaguicidas organoclorados. Inhibidores y desacoplantes de la fosforilacin oxidativa. Accin de herbicidas sobre la fotofosforilacin. Disruptores endocrinos. 0.-Disponibilidad de ATP en las clulas y organismos Para la supervivencia, todas las clulas deben sintetizar molculas endgenas, ensamblarlas hasta complejos macromoleculares, membranas, orgnulos, etc.; mantener el ambiente intracelular y producir la energa necesaria para su funcionamiento. La mayor parte de las funciones vitales en la clula (trabajo qumico de sntesis, trabajo mecnico de contraccin, trabajo de transporte de molculas, transmisin de la informacin, etc) o en los organismos pluricelulares (donde se aaden los problemas de transporte, comunicacin y coordinacin) se realizan en base a la energa qumica en forma de ATP. En las mitocondrias (membrana interna) de organismos aerobios, la energa derivada del transporte de e- (C.T.E.M.), procedente de la oxidacin de nutrientes (NADH, FADH2), se emplea en la formacin de ATP (fosforilacin oxidativa). En el cloroplasto (membrana tilacoidal) se aprovecha la energa luminosa para, a travs de reacciones red-ox, es decir transporte de e-, obtener ATP (fotofosforilacin). Los xenobiticos que interfieran con la produccin de ATP o con su utilizacin, estn afectando al mantenimiento interno de la clula y por lo tanto a su supervivencia, generando disfunciones que podrn expresarse bajo diferentes formas de toxicidad, tanto crnica como aguda, en funcin de la dosis y la biodisponibilidad. 1.0.- Recordatorio:TRASPORTE DE ELECTRONES Y FOSFORILACION OXIDATIVA: Componentes, estructura y mecanismo de funcionamiento.de la cadena mitocondrial .- La cadena de transporte de emitocondrial est formada por 4 complejos proteicos con componentes red-ox, que son los que soportan el transporte de e-. Transportadores en los complejos: [HemoA-Fe Cu] O2 NADH [FMN Fe-S] CoQ [Cit b Fe-S CitC1] Cit c Succinato [FAD Fe-S] Co Q Asociado con el T. E. se genera un gradiente electroqumico de membrana a cargo de las bombas de H+, que son parte de los complejos transportadores, y se produce un acmulo de H+ (fuerza protnmotriz) en la cara externa. La hiptesis quimiosmtica de Mitchell propone que los H+ acumulados fuera,, entran desde la cara citoslica al interior mitocondrial a travs de la ATPsintasa (complejo Fo-F1) que cataliza la esterificacin del ADP con Pi para producir ATP. En la membrana interna mitocondrial hay transportadores de adenilatos (ATP y ADP).

1.1.- Alteraciones de la sntesis mitocondrial de ATP por xenobiticos.La energa qumica til para la realizacin de las actividades celulares esta asociada al metabolismo del ATP, se desprende de su hidrlisis y se genera a partir del metabolismo oxidativo (NADH) para la refosforilacin del ADP hasta ATP. Los efectos de los xenobiticos sobre estos procesos mitocondriales (T. E. y F. O.) se pueden comparar con los manifestados por otros agentes ya estudiados, clasificados en inhibidores o desacoplantes. En general los XBs se comportan produciendo interferencias en la membrana interna mitocondrial, interrumpiendo el paso de los e-, el gradiente de H+ o la actuacin de la ATP-sintasa. En un sentido muy amplio, los compuestos qumicos que interfieren con la sntesis de ATP mitocondrial se pueden asociar en cuatro grupos, segn se recoge en el siguiente esquema: I.- Inhibidores del metabolismo oxidativo. II.- Inhibidores del transporte electrnico. III.- Inhibidores de la liberacin de O2 a la C.T.E.M. IV.- Inhibidores de la fosforilacin oxidativa.

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Sustratos

ADP ATP

NAD

NADH+H

H+ e Inhibidores I

TEM
II

O 2 H 2O ATPasa
III

IV

I.- Inhibicin en la liberacin de [H] a la cadena de transporte electrnico mitocondrial (CTEM) * Glucolisis: hipoglucemia, yodoacetato crtico en neuronas * B-oxidacin: cido 4-pentenoico crtico en msculo cardiaco * Piruvato Deshidrogenasa: arsenito, DCl-VinilCYS, p-benzoquinona ** aconitasa fluoroacetato, NO

II.- Inhibicin el transporte electrnico.

* Inhibidores de los complejos del TE : *** I.- NADH-CoEQ reductasa: *** II.- succinato DesH: *** II.- Coenzima Q-Cit c reductasa: *** III.- Citocromo c oxidasa: *** IV.- Inhibidores mltiples: * Aceptores de electrones: III.- Inhibicin de la liberacin de O2 a la CTEM. * Agentes que provocan parlisis respiratoria: * Agentes que causan isquemia: * Agentes que inhiben la oxigenacin de la Hb: rotenona, amital, MetPhPiridinium(DPP+) malonato, DCVC, PentaCl-ButDien-cys, 2Br-hidroquinona antimicina A, mixotiazol, PCBs CN-, SH, azida, frmico dinitro-anilina, herbicidas difenil-eter, NO, PCBs CCl4, doxorrubicina, menadiona, DPP+

convulsivos, depresores del CNS alcaloides, cocaina CO, agentes oxidantes que forman meta-Hb(Fe3+)

IV.- Inhibicin de la fosforilacin del ADP , se puede producir al nivel de:

1 ATP sintasa: oligomicina, DDT, clordecone 2 Transportador ADP/ATP (antiporte): atractilosido, DDT, Ac Grasos, lisopospolpidos 3 Transportador de fosfato: N-etil maleimida, p-benzoquinona 4 Agentes desacoplantes del potencial de membrana: * * Ionforos: penta-Cl-fenol, dinitro-fenol, benzo-nitrilo, salicilato, valinomicina, gramicidina

* * Agentes permebealizantes de la membrana interna mitocondrial: pentaCl-butadienil-CYS, clordecone.

El dao sobre la fosforilacin oxidativa que impide la refosforilacin del ADP, produce la acumulacin del ADP y de los productos de su hidrlisis, a la vez que una disminucin en los niveles de ATP. Hepatocitos en cultivo expuestos a KCN y yodoacetato exhiben un rpido aumento de H+ y Mg+2 citoslicos, como resultado de la hidrlisis de las sales de ADP y AMP con Mg+2, al igual que la salida al medio de Pi y Mg+2. La cada en los niveles de ATP comprometen todas las operaciones que dependen de l. La prdida de iones influye sobre el volumen celular, disminuyndolo.

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GRUPOS DE INTERS: II y IV; EJEMPLOS.Grupo II.- Inhibidores del transporte electrnico. Interrumpen el flujo de e-, por combinarse con alguno de los portadores EN los complejos. Los inhibidores que actan sobre los complejos provocan un descenso del potencial de membrana, ya que interrumpen el bombeo de H+ y en consecuencia tampoco se produce ATP. .amital (barbitrico), rotenona (insecticida derivado de plantas), esteroides (hormonas), etc. Complejo I: Impiden la oxidacin del malato y otros sustratos de las enzimas dependientes de NAD+, impidiendo la generacin de gradiente de H+. La mayor parte de estos inhibidores se unen a las protenas Fe-S (ferrosulfuradas) del complejo I. Complejo II: El malonato interfiere competitivamente con la oxidacin del succinato por la SuccinatoDH. Algunos fungicidas producen inhibicin a este nivel, al interaccionar con uno de los S de los centros Fe-S no hemo del Complejo II, bloqueando la transferencia de [H] desde FAD. Complejo III: El antibitico ANTIMICINA A y su anlogo sinttico HOQNO, los PCBs, entre otros, afectan al complejo III. El lugar de interferencia de PCBs en el transporte electrnico se postula entre los citocromos b y c. Complejo IV: El CIANURO (CN-), la AZIDA y el CO se unen al Cu del complejo IV. Inhiben el paso final de los e- hacia el O2. Los dos primeros reaccionan con la forma oxidada del Fe3+ del cit aa3, mientras que el CO lo hace con la forma reducida. La muerte por CN- tiene lugar por asfixia tisular, especialmente del SNC. Si el envenenamiento no es letal, se puede tratar con nitritos que transforman la oxihemoglobina en metahemoglobina, la cual compite con el cit aa3 por el CN-, formando un complejo de metahemoglobina-cianuro, con la adicin de tiosulfato se desactiva el sistema con la formacin de tiocianato. Los plaguicidas o frmacos no son, en general, inhibidores PUROS del transporte de e- . Algunos HERBICIDAS como la di-NO2-ANILINA que actan como inhibidores del T.E. en diversos puntos. Grupo IV.AGENTES DESACOPLANTES de la fuerza H+-motriz e INHIBIDORES de la sntesis de ATP 4A - AGENTES DESACOPLANTES.Previenen la fosforilacin del ADP sin interferir en el transporte de e- . Cualquier compuesto que promueve la disipacin de la fuerza protn-motriz [H+] generada por el T.E. se considera un agente desacoplante. En condiciones in vitro, cuando se aaden agentes desacoplantes a mitocondrias respirando, se estimula el consumo de O2 por eliminacin de la influencia reguladora del Pi y ADP. El T.E. y el consumo de O2 se aceleran pero no se forma el ATP correspondiente. La F.O. y el T.E. estn desacoplados. La explicacin ms admitida para este mecanismo es un colapso, disminucin o prdida del gradiente de H+ a travs de membrana con los desacoplantes actuando como H+-foros o ION-foros. Plaguicidas: PENTACLOROFENOL (PCP) un disolvente contaminado con TCDD y TCDF, 2,4-DINITROFENOL (DNP); HCB, hexaclorobenceno, fungicida muy txico para humanos: Son desacoplantes y se usaron como plaguicidas. El gradiente de H+ lgicamente genera un gradiente de pH entre las dos caras de la membrana, lo que hace que muchos derivados fenlicos puedan protonarse en la cara externa, atravesar la membrana en forma molecular y una vez en el interior (pH ms alto) pierdan el H+, contribuyendo as a rebajar el gradiente de H+ y de potencial consiguiente. Muchos plaguicidas sufren biotransformaciones consistentes en hidroxilaciones por enzimas microsomales que introducen grupos -OH en sus anillos fenlicos. Mientras que la molcula patrn no poda actuar como desacoplante, la forma hidroxilada s puede hacerlo si no es rpidamente conjugada con glucsidos o glucurnidos. 4B - INHIBIDORES DE LA ATPasa. Bloquean la secuencia de fosforilacin del ADP hasta ATP. Se unen al complejo F0 - F1. OLIGOMICINA, diciclohexilcarbodiimida (-DCCD), 4-Cl-7-NO2-benzofurano: Todos ellos interfieren con alguna de las subunidades proteicas de la ATPasa. La oligomicina se une a una de las proteinas del complejo F0 y bloquea el paso de H+ a travs del canal F0 , inhibiendo la sntesis de ATP. COMPORTAMIENTO DE MUCHOS PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS No son desacoplantes puros ni inhibidores estrictos. En [ ] molares BAJAS, la mayora de ellos satisfacen las condiciones de desacoplantes, pero en [ ] molares ALTAS actan como inhibidores del T.E. Los herbicidas desacoplantes inhibidores afectan a varios lugares del T.E.M. Los HERBICIDAS pueden separase en dos grupos, en funcin de la relacin dosis-respuesta para interferir en el potencial de membrana y para el consumo de O2. 1) Tipo DINOSEB (diNO2fenoles, benzimidazoles, benzonitrilos): Desacoplan la fosforilacin y colapsan el potencial de membrana antes de que la utilizacin del O2 sea inhibida. Poseen protones disociables y pueden actuar como protonforos ( H+-foros).

2) Tipo DICRILOS (acilanilida, diNO2anilidas, difenileters): Colapsan el potencial de membrana a la vez que desacoplan la Pi-lacin y provocan la inhibicin del consumo de O2. La fosforilacin es afectada en mayor medida que la respiracin.

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3)

DDT e insecticidas ciclodinicos (aldrn, dieldrn):

Inducen un complicado conjunto de alteraciones en la actividad mitocondrial incluyendo la interaccin con el factor de acoplamiento de las subunidades F0 - F1 de la ATPasa. Dependiendo de cmo se realicen los ensayos, estos insecticidas organoclorados muestran efectos diversos, siempre en el sentido de disminuir la obtencin de ATP. El DDT altera las propiedades de permeabilidad selectiva de la membrana interna mitocondrial. Los electrofisiologistas le consideran neurotxico. Los bioqumicos postulan que la reduccin en la disponibilidad del ATP , a causa de las interferencias en el T.E.M. y la F.O., limita la disponibilidad de energa requerida para las bombas de iones en las neuronas. Las propiedades de permeabilidad de la membrana interna son alteradas por DDT y sus anlogos, como lo demuestran una serie de experimentos: la inhibicin del hinchamiento inducido por valinomicina (ionforo), induccin del hinchamiento pasivo, oxidacin del NADH exgeno y rotura de la matriz mitocondrial que conlleva la liberacin de las enzimas internas. . Los PCBs interfieren el transporte E- y disminuyen el consumo de O2. 2.- FOTOFOSFORILACION Y FOTOSINTESIS De forma anloga a como ocurre en la mitocondria, pueden producirse efectos adversos sobre las funciones del transporte de e- y de la fotofosforilacin en las membranas tilacoidales de los cloroplastos. Las plantas superiores y los microorganismos clorofilicos convierten la energa luminosa (hn) en energa qumica (ATP) y poder reductor (NADPH). Ello tiene lugar en los cloroplastos, que al igual que las mitocondrias, contienen su propio ADN y ARN y sintetizan protenas especificas. La fotofosforilacin est acoplada al flujo electrnico en la membrana tilacoidal mediante un gradiente de protones que, acumulados en el interior del tilacoide, generan una fuerza protomotriz. Esta fuerza se encarga de activar a la ATP-sintetasa de la membrana tilacoildal de los cloroplastos para producir ATP.

2A.-ALTERACIONES EN EL T.E. TILACOIDAL Y EN LA FOTOFOSFORILACIN

a) INHIBIDORES DEL T. E. Muchos HERBICIDAS actan interaccionando con el complejo proteico QB del fotosistema (PS) II o P680. Como consecuencia, se inhiben las reacciones en las que est implicado este complejo, como el transporte bsico de electrones desde el agua. Ello impide la formacin del gradiente de protones a travs de la membrana tilacoidal requerida para la sntesis de ATP. Reacciones parciales no dependientes del PS II o P680, tales como la fosforilacin cclica o la fotorreduccin de NADP+ , con un dador electrnico que evite el P680, no son inhibidos o lo son de forma muy leve. Estos herbicidas no inhiben fertemente la fosforilacin oxidativa mitocondrial. EJEMPLOS Herbicidas derivados de urea: monouron, diuron (3-(3,4-diclorofenil)-1, 1-dimetilurea), se unen de forma no covalente a una protena del PS II (32 kD), y se postula que desplazan el grupo redox prosttico PQ. El herbicida se une a una parte externa de la protena, localizada sobre el lado del estroma de la membrana tilacoidal. Herbicidas de este tipo son los derivados de urea (fenilureas doradas), s-triazinas doradas, uracilos sustituidos, piridazonas, benzonitrilos, acilanilidas, aril-carbamatos, que inhiben el T.E. en los fotosistemas de una forma ms especfica que otros inhibidores del T.E. en general. (ver tabla de herbicidas ). . Las ureas, junto a las triazinas son los inhibidores del T.E. fotosinttico ms especficos y que afectan menos al T.E. mitocondrial. HERBICIDAS QUMICOS: CLASES, NOMBRES Y TOXICIDAD AGUDA Especie qumica
Amidas DiNitroAnilinas Nitrilos Ureas Triazinas Benzonitrilos Acetanilidas Carbamatos

Nombre
Propanil Trifluoralin Diclobenil Monuron, Atrazina

DL50 (mg/kg)
10 000 270 3 000 1 000

Mecanismo de accin

Alaclor,metolaclor Profam

1 200 5 000

*Interrupcin del transporte de e- asociado a los fotosistemas o inhibicin de las reacciones luminosas, por lo que la fotosntesis resulta inhibida *Desacoplantes del T.E. - F.O. *Inhibidores del T.E.

Dinitrofenoles Halofenoles

Ac. Benzoicos Auxinas y Cl-fenoxiaceticos 2,3-D,2,3,4-T,Dicamba Hidrazinas Derivados de bipiridilo Diquat,paraquat b) AGENTES DESACOPLANTES

Estimulantes del crecimiento Inhib. de la sntesis de carotenos

agentes no selectivos de contacto

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Disocian el transpone electrnico y la fotofosforilacin. El gradiente de protones establecido a travs de la membrana tilacoidal durante el transporte electrnico es abolido (es decir, aumenta la permeabilidad de la membrana a los protones). La fosforilacin cclica y la no cclica son interrumpidas pero el transporte electrnico puede no afectarse o estimularse. El nico herbicida identificado hasta la fecha como un desacoplante puro a pH 8 es la perfluidona. Otros compuestos que desacoplan la fotofosforilacin tambien desacoplan la fosforilacin oxidativa mitocondrial. Halofenoles y dinitrofenoles.

RESUMEN DE INTERES: Todos los plaguicidas / herbicidas que inhiben o desacoplan el TE. mitocondrial
interfieren con el T.E. y/o fosforilacin en los cloroplastos. Sin embargo a la inversa no se cumple, muchos herbicidas como diuron y s-triazinas tienen un ligero efecto sobre el T.E.M. pero solo a concentraciones relativamente altas.

DISRUPTORES ENDOCRINOS
Los disruptores endocrinos (EDCs) son compuestos que interfieren con el normal funcionamiento de las hormonas, stas son los mensajeros responsables de transportar las seales que coordinan las funciones propias de los sistemas vivos, incluyendo reproduccin, desarrollo y conducta. Los estrgenos son las hormonas sexuales femeninas y los andrgenos las masculinas. Existen otros compuestos naturales con actividad estrognica, los fitoestrgenos (genisteina, cumestrol), etc. Tambin se vienen empleando desde los 1940`s en terapia compuestos sintticos con actividad estrognica fuerte, dietil stilbestrol (DES). Desde los aos 1970`s se viene describiendo que muchos de los XBs contaminantes afectan a la capacidad reproductiva de muchas poblaciones y es en los aos 1990s cuando se les definen como disruptores endocrinos (EDCs), que presentan afinidad y/o interfieren con los receptores de las hormonas sexuales y generan mal funciones y malformaciones. Dado que los XBs atraviesan la barrera placentaria, estos problemas son especialmente serios si la exposicin tiene lugar en el desarrollo fetal, crecimiento temprano o maduracin sexual. El aporte de estrgenos naturales no suele tener consecuencias, pero el aporte de compuestos sintticos, persistentes y bioacumulables si pueden generar respuestas anormales.

TCDD son agonistas del AhR;

pp-DDE es un antagonista andrognico,

PLAGUICIDAS con comportamiento de EDCs: DICOFOL, VINCLOZOLIN, CLORDECON, 2.4-D, 2,4,5-T, ATRAZINA, DIELDRIN, HEPTACLORO, MIREX, CLORDANO, DDT y sus metabolitos, PARATION, METOXICLORO, LINDANO, ENDOSULFAN, CLORPIRIFOS, MALATION, DIAZINON, CARBARIL y algunos piretroides sistticos. El resultado de su accin es una perturbacin del sistema hormonal que es crtico para mantener el desarrollo del cuerpo tal como ha sido seleccionado a travs de generaciones. Estas perturbaciones no son mutaciones genticas sino que alteran el sistema de mensajes qumicos que controla cmo y cuando se expresan los genes. Esquema del mecanismo de accin (ver con mayor precisin en la presentacin corrrespondiente)
Plaguicidas

DDT

Endosulfan

Vinclozolin Compuestos Industriales

Malathion Compuestos Naturales

PCB

17 -Estradiol

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El Diagrama esquemtico que representa los pasos por los que una hormona esteroidea puede ser sensible a la disrupcion por XBs ambientales, comprende las siguiente fases: 1.- Las H esteroideas (EA) tales como E2, tetosterona, y progesterona se sintetizan en las gnadas. Los inhibidores o inductores de las enzimas Cit P450, incluyendo plaguicidas y drogas, actan al nivel de su sntesis. 2.- Las hormonas (H) son secretadas en la sangre, donde estn libres o unidas a SHBG, y estn disponibles para las clulas. El grado de unin est mediado por varios factores, pero la H es capaz de liberarse de SHBG a una velocidad dependiente de su afinidad en la unin. Los XBs pueden alterar los niveles de SHBG, se ha comprobado que algunas H sintticas no se unen a SHBG como las H naturales, dejndolas mas disponibles para las clulas blanco y para el metabolismo heptico. 3.- Las H esteroideas difunden dentro de la clula y difunden en la regin perinuclear, donde estn localizados sus receptores (R) libres. 4.- La H se une al receptor (ER). Muchos XBs pueden unirse a ER o a AR. A veces la sustancia secretada en sangre es una preH que es transformada en la clula, a H activa. La tetosterona es transformada en algunos tejidos por la aromatasa a E2, mientras que en otros, la 5-reductasa la transforma a DHT. En msculo la T es una H activa. Algunos EDCs inhiben la activacin de la preH en el tejido blanco. 5.- El receptor R, unido a una H natural o sinttica, sufre un cambio conformacional, exponiendo lugares de unin de la proteina y formando homodmeros. 6.- Los homodmeros acumulan factores transcripcionales (tf), formando un complejo de transcripcin, que se une a una secuencia especfica sobre el DNA de los genes dependientes de la H, conocidos como elementos de respuesta a la H (HRE). El complejo transcripcional inicia la sntesis del mRNA. Algunas anti-H interfieren con la unin al DNA. 7.- El mRNA es transportado fuera del ncleo al citoplasma y con los AA transportados por sus tRNAs y los ribosomas se sintetizan las proteinas desde el molde del mRNA. 8.- La proteina, un marcador de la accin endocrina, puede ser una E, una H o un factor de crecimiento (citoquina), o un componente estructural de la clula. Un ejemplo de una H marcadora es la vitelogenina, una proteina sensible a estrgenos producida por los vertebrados ovparos. 9.- En algunos casos, los XBs interrumpen la funcin endocrina por alteraciones en la funcin heptica, incrementando o decreciendo el metabolismo de la H, as como los niveles en suero. Por ejemplo, algunos PCBs estimulan el metabolismo de T4, reduciendo dramticamente los niveles de T4 en suero. Varios plaguicidas han mostrado capacidad de estimular el hgado y reducir los niveles de H esteroideas en suero. Agonistas, actan como hormonas naturales por unin a los receptores y promueven las respuestas celulares. Antagonistas, se unen y bloquean los receptores, por lo tanto dejan a los mecanismos reguladores no disponibles a las seales de los mensajeros producidos normalmente por las hormonas. Alteran las concentraciones de las hormonas naturales promoviendo o interfiriendo en el tratamiento de las hormonas por las enzimas hepticas. Alterando el nmero de receptores en el desarrollo de tejidos, predisponiendo a estos tejidos a posteriores respuestas anormales. La discutida Neurotoxicidad de los organoclorados Efectos txicos de los PCDF y PCDD (situados en la parte alta del 10 % de los compuestos ms txicos) No se ha descrito relacin entre estos compuestos y la transmisin nerviosa, aunque si se ha sealado que la exposicin a altas dosis afecta a la conducta y al aprendizaje de los nios como consecuencia de daos sobre el sistema nervioso. Los experimentos con animales de laboratorio indican que la toxicidad de estos compuestos se relaciona fundamentalmente con el cncer, disfunciones hepticas y del sistema inmune, induccin enzimtica, alteraciones en la reproduccin. La toxicidad de los PCBs se viene centrando en su actuacin como disruptores endocrinos. Exposicin por largos periodos de tiempo, puede llegar a inducir cncer y defectos en el nacimiento por afectar al sistema reproductor; exposiciones a altas dosis pueden daar el sistema nervioso, causando adormilamiento, debilidad y hormigueo en los brazos y piernas. Los efectos txicos de los plaguicidas organoclorados se centran en la alteracin de la funcin hormonal como disruptores endocrinos. No obstante, algunos insecticidas como el DDT afectan al sistema nervioso. Su ingestin causa excitabilidad, temblores, ataques, confusin, convulsiones y parlisis de la lengua y labios. Su principal metabolito el DDE es un potente inhibidor de las hormonas masculinas, andrgenos; se le relaciona con los problemas reproductores que estn apareciendo en la poblacin humana y en la fauna salvaje. Estos dos organoclorados estn descritos experimentalmente como cancergenos, y como distorsionadores de la capacidad reproductora.