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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CONTROL FISICO ANTIMICROBIANO MECANISMOS DE ACCION: FISICO 1. Destruccin de microorganismos mediante calor: Al igual que los procesos de desinfeccin, la esterilizacin trmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un nico mecanismo de accin, sino ms bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. As, aunque el efecto final de la esterilizacin por calor hmedo a 121C es la desnaturalizacin y coagulacin de las protenas, son importantes otros mecanismos de destruccin, que justifican la utilizacin de calor hmedo a temperaturas inferiores, como veremos ms adelante. El primer efecto letal sera la produccin de rupturas de cadena nica en el ADN que provocaran la muerte celular por activacin o liberacin de enzimas con actividad de endonucleasas. El punto crtico aqu, para la supervivencia de la clula sera su capacidad para reparar la lesin, funcin que depende del estado gentico y fisiolgico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agregara la prdida de la integridad funcional de la membrana citoplsmica, lo que producira interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la sntesis proteica. Por ltimo, las temperaturas ms elevadas activaran ribonucleasas que degradando el ARNr producen la prdida de viabilidad de las clulas expuestas. Las temperaturas a la cual puede usarse el calor hmedo son:

Por debajo de 100CPasteurizacin.

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A 100C Ebullicin y Tindalizacin

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Por encima de 100C Autoclavado

Calor Hmedo (autoclave):

El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Los materiales debern disponerse de tal manera que se asegure el intimo contacto de todas sus partes con el vapor.
Calor Seco (estufa):

Mecanismo de accin: Es diferente al del calor hmedo. El calor seco provoca desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles elevados de electrolitos. La accin letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos estn en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea. Existen tres formas principales de esterilizacin por calor seco: flameado, incineracin y mediante la utilizacin del horno Pasteur, para ello se necesita alcanzar mayor tiempo y temperatura que en el autoclave, debindose mantener un objeto a 160C durante 2hs. El motivo de estos incrementos estaran dados porque la ausencia de agua disminuira el nmero de grupos polares de las cadenas peptdicas, lo que dara mayor estabilidad a las molculas bacterianas, por lo que se requerira mayor energa para abrirlas. 2. Esterilizacin por radiacin: El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorcin por el ADN y el resultante dao de este. As provocan la formacin de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formacin de dmeros de pirimidina de tipo ciclobutano. Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibicin de la sntesis de ADN y secundario a esto, inhibicin del crecimiento y la respiracin. ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 3. Esterilizacin por filtracin: El mecanismo de accin: es bastante simple: detienen todas las partculas que posean un tamao mayor que los poros. En realidad los "poros" quedan formados por los espacios que resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que forman la membrana. As, algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por suma de partculas retenidas previamente, etc. por lo cual "el tamao del poro" es un valor virtual definido por el tamao de la partcula retenida, ms que por un dimetro real medible.

MECANISMO DE ACCION: CONTROL QUIMICO MICROBIANO 1. Agentes que daan la membrana Los solventes orgnicos (fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos (detergentes) daan la integridad estructural de la membrana (es decir, la disposicin ordenada de lpidos y protenas), de modo que interfieren con su funcin, ejerciendo un efecto neto de Interferencia con procesos de transporte y metabolismo energtico. Salida de pequeas molculas de la clula.

A. Detergentes ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Detergentes (= desinfectantes tensioactivos o surfactantes) Los detergentes sintticos, al igual que los jabones, contienen una porcin hidrofbica (normalmente una larga cadena lipfila) y una porcin hidrfila (un grupo polar), lo cual les permite formar micelas en solucin acuosa, as como formar capas que cubren y solubilizan molculas hidrfobas. Segn sea la porcin hidrfila, los detergentes se pueden clasificar en: a) Detergentes inicos:

Catinicos (grupo activo con carga positiva) Son los detergentes ms potentes en cuanto a su actividad desinfectante, siendo activos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los principales son los llamados compuestos de amonio cuaternario: Sales de amonio cuaternario, sobre todo aquellas que van como cloruros o bromuros. Su frmula general se puede representar as: Los cuatro sustituyentes (R1 a R4) del N son cadenas de hidrocarburos variados. Las sales de amonio cuaternario ms activas son aquellas que tienen tres grupos alqulicos cortos y un grupo alqulico largo: cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio Mecanismo de accin: La porcin hidrfoba penetra en las membranas, mientras que el grupo polar catinico se asocia con los fosfatos de los fosfolpidos, provocando alteraciones en dichas membranas, reflejadas en la ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL prdida de su semipermeabilidad, con salida de

metabolitos de N y P desde el citosol. Es entonces cuando el detergente puede entrar al interior celular, con un efecto secundario de desnaturalizacin de protenas. Su actividad se mejora a pH alcalino. Son rpidamente bactericidas a concentraciones muy bajas (del orden de una parte por milln, 1 ppm), siempre que en el material a tratar no exista materia orgnica. Usos, ventajas e inconvenientes: Tienen baja toxicidad, por lo que se pueden emplear como desinfectantes y antispticos de la piel. Se emplean igualmente en la desinfeccin de material de industrias alimentarias.Su actividad se ve neutralizada por jabones y fosfolpidos, precipitando en su presencia. Aninicos(grupo activo con carga negativa) - Con grupos carboxilo como porcin hidrfila:

Jabones Saponinas Sales biliares cidos grasos disociables Con grupos sulfato como porcin hidrfila:

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Dodecisulfato sdico (SDS), tambin llamado

laurilsulfato sdico Sulfonato de alquilbenceno Mecanismo: Provocan una gran disrupcin de membranas, con efectos de lisis. Son activos sobre todo a pH cido, preferentemente sobre bacterias Gram-positivas, pero poco sobre Gram-negativas, ya que stas quedan ms protegidas por la barrera del lipopolisacrido de la membrana externa. Usos: Cuando los detergentes aninicos se combinan con cidos, se logran desinfectantes sanitarios muy potentes (debido al efecto sinrgico de ambos componentes) y de rpida actuacin (unos 30 segundos).

No inicos (no suelen tener actividad antimicrobiana). No tienen actividad antimicrobiana, pero algunos tienen empleo en otros campos de la Microbiologa: los steres del cido oleico (bajo nombres comerciales como CarbowaxJ, Tween-80J) pueden adicionarse a medios de cultivo para evitar la formacin de grumos y favorecer el crecimiento disperso de ciertas bacterias (como Mycobacterium tuberculosis); adems el oleico puede estimular el crecimiento.

B. Compuestos fenlicos a) Fenoles Son causando: o o Daos a membranas, con prdida de constituyentes citoplsmicos. ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA rpidamente bactericidas a bajas concentraciones,

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL o o Inactivacin irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana. o o Desnaturalizacin de protenas. Tienen baja solubilidad en agua, por lo que se emplean en frmulas que incluyen agentes emulsificadores (jabones) que, adems, aumentan su actividad. b) Fenol

El fenol o cido carblico, histricamente uno de los primeros desinfectantes en usarse, slo se emplea en la actualidad como patrn para ensayar el poder desinfectante de otros compuestos. A partir del fenol se pueden lograr desinfectantes con mayor actividad antibacteriana y con menor toxicidad sustituyendo hidrgenos del anillo bencnico por radicales alqulicos o por halgenos. H aqu algunos ejemplos:

c) Cresoles

Son los alquil-fenoles. El radical alqulico puede estar en posicin orto, meta o para, dando respectivamente el ortocresol, el meta-cresol y el para-cresol. Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada tricresol. Se obtienen por destilacin del alquiltrn de carbn, y se emplean como emulsiones de jabn verde bajo los nombres comerciales de LysolJ y CreolnJ.

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se usan como desinfectantes de material de desecho bacteriolgico y como desinfectantes de la piel.

d) Difenilos halogenados

El

hexaclorofeno

(hexacloro-orto-difenilmetano)

es

bacteriosttico a bajas concentraciones (sobre todo contra cocos Gram-positivos), incluso incorporado en jabones, pasta de dientes y cosmticos. Algunas marcas comerciales incluan hace unos aos este compuesto, hasta que se comprob que su absorcin por la piel, sobre todo inflamada, puede causar neurotoxicidad e incluso, toxicidad sistmica, por lo que en la actualidad ha dejado de usarse.

e) Alquilsteres del para-hidroxibenzoico

Actan de forma similar a los alquilfenoles, pero no son txicos, debido a que al ser ingeridos, se hidrolizan rpidamente, dando el inocuo para-hidroxibenzoato. Se emplean como conservantes de alimentos y de productos farmacuticos.

f) Ciertos aceites esenciales de origen vegetal ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Desde la antigedad, y de modo emprico, se vienen usando algunos aceites esenciales de plantas aromticas como conservantes y antispticos, ya que como se ha podido comprobar, contienen varios compuestos fenlicos:

o El timol (de Thymus, los tomillos); o El eugenol se emplea en odontologa como antisptico.

C. Alcoholes Los alcoholes desorganizan las bicapas lipdicas penetrando en la regin hidrocarbonada de los lpidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son esterilizantes. Su accin desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la cadena aliftica de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 tomos de carbono (C8-C10), ya que los alcoholes de cadenas ms largas de C10 tienen una baja solubilidad en agua.

a) Etanol (CH3-CH2OH)

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se emplea en desinfeccin de la piel antes de inyecciones cutneas, as como en desinfeccin de los termmetros clnicos, siempre que se deje el tiempo suficiente de contacto. Es ms efectivo en soluciones acuosas entre 50-70%, ya que para su mejor accin se implica la intervencin del agua. A 100% de pureza es poco efectivo. b) Isopropanol Es menos voltil y ms efectivo que el etanol. Se emplea igualmente en desinfeccin de termmetros. Sin embargo, su efecto txico (narctico) es mayor y ms duradero que aquel.

2. Agentes desnaturalizantes de protenas

A. cidos y bases fuertes Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OHdisociados, respectivamente. En principio, su actividad es proporcional al grado de disociacin, pero algunos hidrxidos son ms potentes de lo sugerido por su mero grado de disociacin, debido a la accin txica directa que puede ejercer el catin metlico. Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien la accin de bases fuertes. Tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha para aislarlo y purificarlo: se lica un esputo de enfermo sospechoso en una solucin 1M de sosa (NaOH) y se deja 30 minutos antes de sembrar. Bajo estas condiciones, prcticamente slo sobrevive el Mycobacterium tuberculosis. B. cidos orgnicos

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Los cidos orgnicos, que son poco disociables, ejercen su efecto en cuanto molculas intactas (sin disociar), que penetran a la clula. El cido benzoico y el cido srbico se usan ampliamente como conservantes alimentarios. Ciertos cidos (como el actico, lctico, propinico) aparecen en alimentos fermentados, actuando como conservantes naturales. Estos mismos, as como el ctrico se pueden aadir a otros tipos de alimentos, para prolongar el periodo de posible almacenamiento de los productos. El cido brico se ha usado como conservante (a veces ilegal) de alimentos, as como en oftalmologa.

AGENTES MODIFICADORES DE GRUPOS FUNCIONALES Esta amplia clase de agentes se caracteriza, en general, por los siguientes efectos: o Alteran grupos que forman parte de los centros activos de enzimas y otras protenas. o Alteran grupos funcionales de cidos nucleicos, componentes de pared y de membrana. Como ya vimos en la clasificacin de agentes desinfectantes, dentro de este grupo se distinguen a su vez: 1. metales pesados 2. agentes oxidantes 3. tinturas de colorantes 4. agentes alquilantes

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1. Metales pesados Las sales solubles de Hg, As, Ag, Cu, etc, "envenenan" la actividad enzimtica formando mercptidos con los grupos -SH de la cistena. Tambin interaccionan con -NH2, -COOH y radicales fosfato. Los ms efectivos son los derivados del mercurio y de la plata (actan a menos de 1 ppm).

a. Mercuriales Se vienen usando desde antiguo en Medicina.

Cloruro de mercurio (HgCl2). En solucin al 0,1% fue muy usado como desinfectante potente, pero es muy txico, y apenas se emplea en la actualidad. Compuestos orgnicos de mercurio (como el MercurocromoJ, la MercrominaJ, el Mertiolato): No son totalmente fiables como desinfectantes y presentan cierta (aunque baja) toxicidad, pero se emplean mucho como antispticos de la piel y de heridas. Sales de fenilmercurio. Son potentes inhibidores no slo de bacterias, sino de levaduras, hongos y algas. Se usan especialmente en el control de posibles contaminantes microbianos (p.ej., bacterias oportunistas del gnero Pseudomonas) en productos farmacuticos, cosmticos y oftalmolgicos. b. Compuestos de plata

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Bien sea en forma de sales solubles, o en preparaciones coloidales, los compuestos de plata se usan ampliamente como antispticos, aunque estn restringidos, al tener efectos irritantes y custicos. Nitrato de plata (AgNO3). Es muy bactericida frente al gonococo (Neisseria gonorrhoeae), y por ello se usa habitualmente para prevenir la oftalmia gonoccica del recin nacido. Coloides orgnicos de plata. En ellos los iones Ag+ se van liberando lentamente. Tienen efectos bacteriostticos, y encuentran su principal aplicacin en oftalmologa. Cremas de nitrato de plata y sulfodiazina de plata. Usadas para el tratamiento de quemaduras, han reducido notablemente la mortalidad derivada de las grandes quemaduras. c. Compuestos de cobre No tienen aplicacin en Bacteriologa Mdica, pero se emplean en Agricultura para el control de hongos y algas.

2. Agentes oxidantes Los efectos de los agentes oxidantes que se tratan a continuacin son la inactivacin de protenas enzimticas (convitiendo los radicales -SH en disulfuros -S-S-). Adems, los ms potentes tambin atacan radicales amino, el grupo indol (presente en el triptfano), y la tirosina.

a. Halgenos.

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Son bactericidas muy tiles y muy potentes. El iodo no tiene parangn como desinfectante de la piel, y el cloro no tiene igual en el tratamiento de aguas. Yodo: Aparte de su efecto oxidante, se combina irreversiblemente con residuos de tirosina de las protenas. Sus principales presentaciones son la tintura de iodo y los iodforos.

Tintura de iodo: es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en alcohol de 70%. Su mximo efecto bactericida lo tiene a pH<6. Es un magnfico antisptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un efecto doloroso y custico en heridas abiertas. Iodforos: son mezclas de iodo con agentes tensioactivos

(detergentes), en los que stos actan como portadores del iodo, al que van liberando lentamente, sin provocar irritacin. Tambin se emplean en desinfeccin de instalaciones de industrias alimentarias.

Cloro: El cloro fue uno de los primeros antispticos en usarse (antes de conocerse su mecanismo, e incluso antes de que se supiera el autntico papel de los microorganismos en las enfermedades infecciosas). Holmes (Boston, 1835) y Semmelweiss (Viena, 1847) lo introdujeron en la prctica de los mdicos y matronas para impedir la transmisin de la sepsis puerperal, que era contagiada de mujer a mujer por las manos de los doctores y de las parteras, y que era una notable causa de mortalidad de mujeres durante muchos siglos. El cloro se presenta bajo las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberacin de cloro

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL libre (Cl2); a su vez, el Cl2 reacciona con el agua para dar cido hipocloroso, que a pH cido o neutro es un oxidante fuerte: Cl2 + H2O ---------> ClOH + H+ + Cl(ClO)2Ca + H2O ----> Ca++ + H2O + 2 ClO(ClO)2Ca + 2H2O ---> Ca(OH)2 + 2 ClOH

La disociacin del cido hipocloroso depende del pH (se realiza a pH<7) ClOH -------> H+ + ClO-

Cloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloracin de aguas para bebida y de aguas de piscinas. Su actividad se ve muy influida (mermada) por la presencia de materia orgnica; por ello, se suele determinar la demanda de cloro del agua a tratar. Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso mata rpidamente (15-30 segundos) a slo 1 ppm. Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de litio. A 200 ppm de cloro se usan ampliamente, ya como lquidos (lejas), o en polvo, en industrias alimentarias y lcteas (para desinfectar el equipamiento y maquinaria que ha de entrar en contacto con los alimentos a procesar), en restaurantes, hoteles, hospitales, etc. b. Agua oxigenada.

El perxido de hidrgeno (H2O2), en solucin al 3%, se us en otro tiempo como desinfectante, pero est actualmente ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL en desuso, debido a que algunas bacterias son resistentes, por la posesin de catalasas y peroxidasas. Adems, en desinfeccin de heridas abiertas su efecto es muy pobre, porque el agua oxigenada es descompuesta por la catalasa tisular. Se emplea en la desinfeccin de lentillas blandas, dejando tiempo suficiente de actuacin. Tambin, en desinfeccin de superficies inertes y equipos quirrgicos. c. Permanganato potsico (K3MnO4).

Al 1%, se usa como antisptico uretral.

d. Acido peractico (CH3-CO-O-OH).

Es un fuerte agente oxidante. En forma de vapor se usa en la esterilizacin de cmaras de cra de animales libres de grmenes.

3. Colorantes Algunos colorantes derivados de la destilacin del alquitrn de carbn, sobre todo los trifenilmetanos y las acridinas, no slo tien las bacterias (recurdense las prcticas), sino que tambin actan como antibacterianos, incluso a pequeas concentraciones. Los colorantes bsicos son los ms efectivos. En general, su mecanismo depende de su afinidad hacia los grupos fosfato (cidos) presentes en las nucleoprotenas. ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Encuentran su uso como antispticos de lesiones dermatolgicas, infecciones de la piel y pequeas heridas. Su principal inconveniente es que muchos de ellos se inactivan en presencia de suero y otras protenas.

a. Colorantes de trifenilmetano:

Son derivados de la anilina. Entre ellos se encuentran el verde brillante, el verde malaquita, el violeta de genciana, el violeta cristal y la fuchsina bsica. Son muy selectivos hacia bacterias Gram-positivas, sobre las que son efectivos a slo 0,2-2 ppm. En cambio, las Gram-negativas suelen ser resistentes, debido a su membrana externa. El efecto antibacteriano se debe a la pseudobase, que es ms lipfila que el respectivo catin, y bajo esa forma accede al interior celular, donde se une a los grupos fosfato de los cidos nucleicos.

b. Colorantes derivados de la acridina (llamados flavinas, por su color amarillento -Lat: flavus-).

Los ejemplos tpicos son la acriflavina, la proflavina y la tripoflavina. Interfieren en la biosntesis de cidos nucleicos (intercalndose en la ACCCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS MICROBIOLOGIA

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL doble hlice del ADN) y protenas. Son bactericidas y

bacteriostticos sobre una gran diversidad de bacterias. A diferencia de las anilinas, ejercen su accin tambin en presencia de materiales como suero, pus, etc. Su uso principal es la antisepsia de heridas.

4. Agentes alquilantes Son agentes esterilizantes, activos tanto sobre clulas vegetativas como sobre esporas, que ejercen su efecto letal por su accin alquilante de protenas y cidos nucleicos.

a) Formaldehido (HCHO). b) La alquilacin la produce reemplazando hidrgenos lbiles de ciertos grupos qumicos (-NH2, -OH, -COOH y -SH), produciendo:

o o

Hidroximetilaciones Condensaciones (entrecruzamientos).

c)

Usos comerciales:

Como

gas,

en

la de

descontaminacin habitaciones; o Como formalina

(solucin

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EAP. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL acuosa al 35%); o Como pureza). paraformaldehido

(polmero slido de 91-99% de

La formalina se emplea para preservar tejidos, en lquidos de embalsamamiento, y al 0,2-0,4% en la preparacin de vacunas de virus. a) Glutaraldehido Es menos txico y ms potente que el formaldehido, y no se afecta por materiales con protenas.Cada vez se emplea ms como esterilizante fro de instrumental quirrgico. Es el nico recomendado para esterilizar equipamiento de terapia respiratoria. b) Oxido de etileno.

Tiene un efecto similar al del formaldehido: Sustituciones y entrecruzamientos irreversibles en grupos amino, sulfhidrilo, etc., de protenas. Tambin reacciona con grupos fosfato y anillos nitrogenados de los cidos nucleicos. Es un agente empleado como esterilizante gaseoso, aunque es de accin lenta. Se emplea cuando no se puede recurrir a la esterilizacin por calor: esterilizacin de material de plstico, drogas, ciertos productos biolgicos, equipamiento electrnico. La operacin se realiza en cmaras parecidas al autoclave. Sin embargo, es un mtodo caro y exhibe ciertos riesgos: presenta accin vesicante y toxicidad para el hombre (mutgeno y carcingeno). c) d) -propionil-lactona

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Es 25 veces ms activa que el formaldehido. Acta como gas en presencia de 80-90% de humedad relativa, aunque es poco penetrante.

Caractersticas diferenciales entre desinfectantes y antispticos contra los antibiticos

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