MELAMINA.

UN PROBLEMA POTENCIAL PARA LA SALUD ANIMAL Y HUMANA COMO ADULTERANTE EN LOS ALIMENTOS CON NFASIS EN LA LECHE

MELAMINE. A POTENTIAL PROBLEM FOR ANIMAL AND HUMAN HEALTH AS ADULTERANT IN FOOD ESPECIALLY IN MILK

A. Escobar*, R. Faure*, Dayana Sosa*, P. Ponce*, S.Vega** *Direccin de Salud y Produccin Animal, Centro Nacional Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrnico: escobar@censa.edu.cu; **Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Departamento de Produccin Agrcola y Animal, Mxico, D.F.

RESUMEN El consumo de melamina, sustancia qumica empleada en la industria del plstico, constituye un riesgo para la salud humana y animal. La presencia de melamina en la leche u otro alimento puede ocurrir de forma natural, por adulteracin o transformacin metablica del plaguicida ciromaxina. En el presente artculo se aborda los antecedentes de la adulteracin de alimentos con melamina, los aspectos toxicolgicos y una compilacin de criterios de diferentes expertos en cuanto a las ventajas y desventajas de la metodologa analtica para la determinacin de melamina en alimentos. En el CENSA el departamento del CENLAC cuenta una metodologa analtica que posibilita detectar problemas de adulteracin, presencia de residuos y contaminantes en leche lo cual posibilita evaluar su inocuidad. Palabras clave: melamina; adulteracin; leche; mtodos analticos

ABSTRACT Melamineis a chemicalsubstanceused in themanufacturing of plastics, whichaddedtothemilkconstitutes a riskfor human and animal health, ifitisconsumed. Thepresence of melamine in themilkoranotherfood can happen in a natural way, byadulterationormetabolictransformation of thepesticidecyromazine. In thepresentreview, theantecedents of melamineadulteration in foods are showed, thetoxicologicalaspects and a compilation of criteriafromdifferentexpertsabouttheadvantages and disadvantages of theanalyticmethodologyforthemelaminedetermination in foods are analyzed. CENLAC departmentfromtheNational Center forAnimal and PlantHealth (CENSA), has implementedananalyticmethodologywhichfacilitatestodetectadulterationproblems

and thepresence of residuals and contaminants in milkallowingtheevaluation of food safety. Key words: melamine; adulteration; milk; analyticmethods

INTRODUCCIN
La adulteracin de los alimentos constituye una prctica fraudulenta y tiene fines econmicos al alcanzar productos ms baratos. Se considera adulterado un alimento cuando su naturaleza o composicin no correspondan a la informacin mostrada en la etiqueta (1). Los fraudes en materias primas como en productos alimenticios terminados han aumentado considerablemente en los ltimos aos y no slo se manifiesta en los pases pobres sino tambin en los desarrollados. Las adulteraciones cada da son ms difciles de detectar ya que las sustancias implicadas presentan una composicin muy similar a las del producto de origen, de ah la necesidad de contar con mtodos ms selectivos y especficos para poder detectar a los adulterantes. La adulteracin es una prctica penalizada por los organismos regulatorios y se establecen reglamentos y normas para definir la autenticidad de un producto alimenticio; de esta forma contribuir a la inocuidad del mismo. En el caso especfico de la leche, la Federacin Internacional de Lechera (FIL), considera que la misma es el producto de la secrecin normal de la glndula mamaria, obtenido por uno o varios ordeos, sin ninguna adicin o sustraccin (2), por tanto la incorporacin de slidos no lcteos, de origen vegetal o animal a la leche fluida, constituye una adulteracin. Entre las adulteraciones ms frecuentes que se hacen en la leche se puede mencionar la adicin de agua y sales neutralizantes (3), agregado de suero de queseras en leche fluida y deshidratada (4) y la sustitucin de grasa lctea por otras de origen vegetal o animal (5,6). Los altos precios de la leche en polvo en el mercado internacional en los ltimos aos y su tendencia mantenida (7), hace que personas inescrupulosas traten de engaar al consumidor adulterando los alimentos con la finalidad de obtener ganancias, ejemplos recientes muestran la sustitucin con grasa vegetal en una marca de leche pasteurizada de amplio consumo en la Ciudad de Mxico (6) y la presencia de melamina en leche y derivados lcteos en China (8). La intencin de este artculo es ofrecer una informacin til para los profesionales de Medicina Veterinaria y de Alimentos sobre una sustancia qumica empleada en la fabricacin de plstico conocida como melamina y que estuvo implicada en un escndalo mundial ocurrido en empresas Chinas cundo se detect su presencia en leche para infantes, causando una enfermedad renal en las personas que consumieron el alimento adulterado. Antecedentes En marzo del 2007 en Estados Unidos algunos productores de alimentos para mascotas retiraron del mercado sus productos, ya que se vincularon con la presencia de una insuficiencia renal en gatos y perros (9). Un estudio toxicolgico con unos de los alimentos retirados del mercado evidenci que nueve gatos murieron con la misma sintomatologa presentado durante la intoxicacin (10). Estudios posteriores corroboraron que el alimento sospechoso estaba contaminado

con dos sustancias qumicas empleada en la industria del plstico conocido como melamina y cido cianrico (11,12,13); sin embargo a pesar de relacionar la presencia de estos dos residuos industriales en el alimento, no se pudo explicar directamente la causa de las enfermedades renales, debido a las bajas concentraciones de los mismos (14). Un estudio posterior confirm que los agentes causantes de la insuficiencia renal eran la melanina y el cido cianrico al encontrarse el aducto del cido de melaminacianrico estable en la orina de las mascotas enfermas (15,16). El gluten del trigo empleado como materia prima en la elaboracin de alimentos para mascotas fue identificado como la fuente de contaminacin y el mismo proceda de la empresa China "Xuzhou AnyingBiologicTechnology" (17). La razn por la cual contena melamina la materia prima no est claro, sin embargo medios de noticias reportan que la adulteracin pudo haber sido de manera intencional por razones econmicas (9). Inicialmente los reportes sugieren que la contaminacin fue confinada para alimentos para mascotas, sin embargo se han descubierto la presencia de melamina en alimentos concentrados destinados al consumo de aves, cerdo y pez gato (18,19). El 13 de septiembre del 2008 se hace pblica la adulteracin de leche de lactantes por melamina, donde 400 nios se encuentran intoxicados y se teme por la vida de varios. De hecho un nio de la provincia noroccidental de Gansu falleci por clculos renales. En pocos das se tienen nuevos datos y la cifra de bebs y nios intoxicados sigui aumentando como resultado del consumo de estos productos (20). Una semana despus el Ministerio de Salud Chino report que alrededor de 40 000 nios recibieron tratamiento, de los cuales 12 900 estaban actualmente hospitalizados y se haban confirmado tres defunciones por esta causa (21). La Agencia de Inspeccin Nacional de China encontr niveles de melamina que oscilaron entre 0.09 y 2.560mg/Kg en diversos productos lcteos (22). Las principales compaas implicada en el escndalo fueron: Shijiazhuang SanluGroup Co, Inner Mongolia Yili Industrial Group Co 600887.SS y MengniuDairy 2319.HK, estas dos ltimas lderes del sector lcteo chino. Otros pases afectados por recibir importaciones de leche proveniente del mercado Chino fueron: Bangladesh, Brunei, Burundi, Gabn, Hong Kong, Japn, Malasia, Myanmar, Filipinas, Singapur, Corea del Sur, Taiwn y Vietnam. Los cuales retiraron sus productos de las estanteras, prohibieron las importaciones chinas o comenzaron a realizar controles de calidad (23). Entre las marcas internacionales afectadas estn: la marca suiza Nestl y la DairyFarm UHT ambas de fabricacin China, que retiraron todos sus productos de los comercios de Hong Kong despus de que una serie de pruebas indicaran que tenan melamina, aunque en concentraciones bajas. Por otra parte la cadena de cafeteras Starbucks retir la leche de sus 300 locales en China, al temer haber comprado leche contaminada al proveedor MengniuDairy 2319.HK (23). Regulaciones La Organizacin Mundial de la Salud inform que la melamina no tiene nada que hacer en los alimentos como la leche y ratific que hasta el momento la adicin de la melamina en los alimentos no es aprobada por la OMS, la FAO ni el Codex Alimentarius, mximo rgano internacional que fija los estndares de calidad de los alimentos.

A partir del escndalo de intoxicacin infantil en China por la presencia de melamina en leche, la Unin Europea (UE) establece un lmite mximo de 2 mg/kg (ppm) a la importacin de productos que contienen leche o productos lcteos originarios o procedentes de la China (24). Tambin la UE estableci una dosis mxima diaria tolerable de 0,5 miligramos de melamina por kilo de peso. La agencia de Inspeccin de alimentos de Canad (CFIA-Canadian FoodInspection Agency conocido por sus siglas en ingls) estableci patrones interinos para la presencia de melamina y cido cianrico en productos importados que contengan leche, fijando niveles de 1 ppm para frmulas lcteas infantiles y 2.5 ppm para productos lcteos, fundamentndose que bajos niveles de estas sustancia, no son indicativos de una adulteracin, y s debido a una exposicin ambiental (por ejemplo el embalaje o el procesamiento). Por otra parte la presencia de melamina en un alimento en concentraciones baja no indica que hay un riesgo automticamente a la salud humana (25). La FDA de Estados Unidos (US FDA- U.S. Food and DrugAdministration conocido por sus siglas en Ingls) fij un lmite de 2.5 ppm de melamina en productos lcteos para adultos, no estableciendo ningn valor para nios (26). En China se defini aceptar niveles de melamina de 1 ppm para las frmulas lcteas infantes y 2.5 ppm para leche lquida, en polvo y otros productos lcteos. Propiedades fsico qumicas y sntesis de la melamina La melamina es un qumico industrial txico usado en la fabricacin de plstico. Fue sintetizada por primera vez por el cientfico alemn Justus von Liebig en 1834. Es una base orgnica que presenta una frmula qumica C3H6N6 y se conoce con el nombre 1,3,5-triazina-2,4,6-triamina. Es un polvo blanco cristalino y es soluble ligeramente en agua. Presenta propiedades de retardar el fuego, debido a su liberacin de nitrgeno gaseoso cuando es quemado o carbonizado. Inicialmente la produccin de melamina ocurre cuando la cianamida de calcio es convertida en una dicianidiamida y esta es calentada por encima del punto de fusin, sin embargo en la actualidad se emplea la urea para la produccin de melamina. Este ltimo proceso ocurre en dos pasos, una primera reaccin endotrmica donde la urea se descompone para formar el cido cianrico (HCNO) ms amoniaco. En la segunda etapa ocurre la polimerizacin del cido cinico para formar la melamina y la liberacin de dixido de carbono, este proceso es exotrmico. 6 (NH2)2CO C3H6N6 + 6 NH3 + 3 CO2 Durante la sntesis qumica pueden ocurrir diferentes productos intermedios como son cido cianrico, ammelina y ammelida (Figura 1), estos metabolitos tambin puede aparecer por la degradacin microbiolgica de la melamina (27). La combinacin de la melamina con el cido cianrico forma el cianurato de melanina, tambin conocido como aducto cido de melaminacianrico o complejo cido de melamina cido cianrico, la unin de estos dos compuestos ocurre a travs de enlace de hidrgeno (Figura 2).

A continuacin se muestra un resumen sobre las caractersticas fsico qumicas de las cuatro antes citadas en la Tabla 1. Metabolismo y toxicidad de la melamina La melamina no es metabolizada por los animales y es excretada en ms del 90% en la orina dentro de las 24 horas. Estudios realizados en animales muestran que la melamina tiene un rango de vida media entre 2.7 y 4.04 h cuando es administrada por va oral o endovenosa (28). Un estudio farmacocintico de una aplicacin intravenosa de la melamina (6.13 mg/kg) en puercos destetados mostr un aclaramiento de 0.11 0.01 L/h/kg y un volumen de distribucin de 0.610.04 L/kg (29), mientras en el modelo de rata el valor de la vida media de la melamina fue 1.5 veces menor y el volumen de distribucin 3 veces mayor, estas diferencias se atribuyen a la velocidad de filtracin glomerular (29). Otro estudio farmacocintico en cerdos estim que el intervalo de retiro de la carne fue de 19.2 a 20.9 h cuando fueron expuestos a una dosis nica de melamina de 3.0 y 5.12 mg/kg, mientras un estudio de dosis repetida durante dos veces al da por un tiempo de 7 das mostr un intervalo de 20.1 a 21.3 h. Los intervalos de retiro fueron fundamentados por la determinacin directa de la melamina en el tejido del rin con un nivel de seguridad de 50 ppb (30). Un estudio controlado en vacas Holstein en lactacin se le suministr en la dieta 17 g de melamina por da, apareciendo en la leche 8 horas despus de la primera ingestin alcanzando su mxima excrecin a las 56 horas, donde el porcentaje de melamina en la leche oscil entre 1.7 y 2% con respecto a la cantidad consumida diariamente. Una vez retirado el alimento contaminado se mantuvo los niveles detectables de melamina en la leche hasta 152 h. Estos resultados son de gran importancia porque hasta el momento se pensaba que la presencia de melamina se deba solo a problemas de adulteracin directa de la leche (31). Cuando existe adulteracin por melamina los niveles de nitrgeno en leche se incrementan lo que falsea los resultados en protena bruta , sin embargo la aparicin de forma natural no muestra diferencia significativa en la composicin fsico qumico de la leche entre los grupos tratados con melamina y el control (Tabla 2). Esto se debe en primer lugar al bajo nivel de excrecin y en segundo lugar al efecto dilucin por el nivel produccin de leche. Tambin se ha reportado la presencia de melamina en alimentos debido a la transformacin metablica del plaguicida ciromazina dentro del cuerpo, un estudio en gallina ponedoras donde se suministr el plaguicida ciromazina en la dieta a una concentracin de 5ppm, se encontr residuos de melamina y ciromazina en carne y huevo a una concentracin de 0.25 ppm (32).

La mayor parte de los estudios toxicolgicos se haban realizado siempre en el supuesto de exposicin laboral (por inhalacin o contacto con la piel), no de ingesta por va oral, adems de existir muy poca informacin sobre lo que puede ocurrir a largo plazo. De manera general se puede decir, que la toxicidad de la melanina es baja ypuede producir irritacin de las vas respiratorias, ojos, piel y aparato digestivo, adems hipersensibilizacin y posible dao renal. La ingestin de melamina puede provocar daos en el sistema reproductor, en la vejiga o en formacin de clculos renales. Esto ltimo ocurre cuando la melamina se combina con el cido cianrico formando el cianurato de melamina un producto insoluble que obstruye las vas urinarias impidiendo la correcta eliminacin de la orina, por otra parte el flujo sanguneo dentro del rin tambin se afecta. Toxicidad aguda Reportes de publicaciones informan que el valor ms bajo de LD 50 por va oral en ratas es de 3161 mg/kg y la LD50 para el ensayo de irritacin drmica en conejo fue 1000 mg/Kg. Estudios toxicolgicos realizados con el cianurato de melamina en ratas y ratones sugieren que presenta mayor toxicidad que cuando se analiza la melamina o el cido cianrico solos (la LD50 del cianurato de melamina va oral en rata fue de 4.1g/kg, para la misma especie pero evaluando melamina y cido cianrico, las LD50 fueron 6 y 7.7 g/kg respectivamente) (33). Un estudio realizado para evaluar la toxicidad de la melamina y el cido cianrico y su combinacin en gatos, corroboran que esta ltima es la responsable de los daos renales agudos en gatos (34). Con relacin a la concentracin de efectos adverso no observados (NOAELs por sus siglas en ingls) se han reportados valores de 63 mg/kg.pc/da en ratas alimentadas durante 13 semanas; 240 mg/kg pc/da en ratas alimentadas durante 28 das; 417 mg/kg pc/da en ratas alimentadas por 14 das y 1600 mg/kg pc/da en ratones alimentados durante 13 semanas. Otros clculos de NOAELs para ratas en estado reproductivo y de desarrollo mostraron valores de 400 y 1060 mg/kg pc/da para el estado maternal y fetal respectivamente. Los principales sntomas clnicos observados en los experimentos anteriormente mencionados cuando la melamina fue administrada por va oral son: disminucin en el consumo de los alimentos, prdida de peso, clculos renales, hiperplasia epitelial en la vejiga y una baja tasa de supervivencia (14). Toxicidad crnica La ingestin de melamina adems de los daos antes mencionados puede desarrollar cncer de vejiga. Un estudio realizado en perros donde se suministr melamina al 3% mezclado con el alimento durante un ao (1200 mg/kg/day) provoc los siguientes cambios: disminucin de la gravedad especfica de la orina, poliuria, presencia de cristales de melamina, protena y sangre oculta (35) Un estudio controlado en ratas durante dos aos expuestas a una dieta alta de melamina (4500 ppm or 263 mg/kg pc/da), encontraron asociaciones con un aumento de clculos renales y un incremento de la incidencia de tumores en la vejiga de ratas hembras (14). En diversos protocolos toxicolgicos donde se evala la toxicidad de la melamina y sus metabolitos en distintas especies corroboran el efecto sinrgico entre ellos. Un estudio en ratas muestra que la mezcla de melamina, ammelina, ammelida y cido cianrico (400/40/40/40 mg/kg) y de melamina y cido cianrico (400/400 mg/kg) presentan mayor toxicidad que los elementos independientes (36); otro estudio en puerco y peces corroboran el mismo efecto sinrgico de las combinaciones

incrementando la presencia de cristales renales (37) y en gatosa las 12 horas de consumir la combinacin de melamina y cido cianrico se presenta ligera depresin, vmitos y anorexia (34). Los principales hallazgos anatomopatolgicos son: riones edematosos con un incremento de su peso y presencia de precipitado de color amarillo carmelita en los tbulos. En histopatologa en secciones congeladas se observa la presencia de cristales en la fraccin larga de los tbulos renales particularmente en la medula, mientras en secciones fijadas con formalina aparecen dilatacin tubular extensiva y debrisbasoflico en tbulos distal y lazos de Henlen. Anlisis qumicos Varios mtodos han sido desarrollados para los anlisis de melamina en diferentes sustratos. Estos incluyen cromatografa gaseosa (GC), cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR o HPLC en sus siglas en ingles); CG o HPLC acoplada a un espectrmetro de masa, electroforesis capilar e inmunoensayos entre otros. Un anlisis compilado por diferentes expertos de los principales procedimientos se refleja a continuacin: HPLC-MS/MS. Es el mtodo ms seguro para la cuantificacin de melamina en diferentes matrices en el orden de las partes por billn (ppb) por su alta sensibilidad y selectividad en una amplia variedad de productos. Las muestras son extradas con una mezcla de acetonitrilo:agua, el extracto es purificado por extraccin lquido-lquido seguido por extraccin en fase slida. El uso de estndares internos marcados isotpicamente permite la cuantificacin confiable a niveles bajos. La instrumentacin requerida es de alta tecnologa y costosa (38). HPLC-MS. En muchos casos sus resultados de selectividad y lmite de cuantificacin son comparables con el HPLC-MS/MS, su principal limitacin est en la valoracin de la muestra por las interferencias que pueden coincidir con la masa molecular protonada de la melanina 127.07 daltons Se requiere de una limpieza eficiente empleando columna de intercambio catinico. El procedimiento permitira una cuantificacin confiable y al igual que el procedimiento anterior la instrumentacin requerida es de alta tecnologa (38). CG-MS. Las muestras son extradas con una mezcla de acetonitrilo agua dietilamina y requieren de una mayor purificacin para su posterior derivatizacin con TMS ante de aplicar la misma. El mtodo una vez desarrollado presenta alta selectividad y sensibilidad, pudiendo ser aplicado a una amplia variedad de matrices. El mtodo original propuesto por la FDA de Estados Unidos alcanz un lmite de cuantificacin de 2 mg/kg, sin embargo puede determinar hasta 0.01 mg/kg. El sistema CG-MS requiere mayor atencin cuando se trabaja con muestras derivatizadas. Los controles de calidad son ms estrictos debido a una mayor probabilidad de error por la manipulacin de la muestra en su preparacin. La instrumentacin requerida es de alta tecnologa y costosa. HPLC-UV. Puede proporcionar una informacin cuantitativa (generalmente emplea UV 240 nm). Las muestras son extradas con una mezcla de acetonitrilo y agua empleando un sistema de par inico en sus anlisis. Muestras complejas como galletas y golosinas presentan una variedad de interferencias que absorben a la longitud de onda de 240 nm. Por lo general las muestras positivas requieren de un

segundo mtodo para su confirmacin y cuantificacin. Requiere de tecnologa pero no tan costosa como la anterior (38). ELISA. Son mtodos de alta especificidad por su principio de reaccin antgeno anticuerpo. Son ensayos cuantitativos y se emplean fundamentalmente en las matrices de leche fluida y en polvo, gluten de trigo y comida de mascota. Las muestras no requieren de purificacin para ser analizadas. Los juegos de reactivos estn disponibles comercialmente y constituye una herramienta de pesquisaje adecuado. En ocasiones no se alcanzan los lmites de deteccin requeridos para algn tipo de matriz (38). En la Tabla 3 se muestran un resumen de los diferentes procedimientos para la determinacin de melamina y compuestos anlogos en distintos sustratos. En el Centro de Ensayo para el Control y Calidad de la Leche (CENLAC), del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) cuenta con las condiciones tecnolgicas que permite detectar problemas de adulteracin y la presencia de residuos y contaminantes en leche a travs de metodologas analticas de avanzadas aplicando las normas ISO 9004-2 e ISO 17025 para ofrecer servicios analticos especializados.

REFERENCIAS
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